In mehrzelligen Organismen ist der Aufbau stabiler Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen lebensnotwendig. Hierfür werden innerhalb einer Körperzelle membranständige Adhäsionskomplexe gebildet, die eine zentrale Rolle in der Verankerung sowie Regulierung des intrazellulären Zytoskelettes spielen. Zu diesen Aktin-bindenden Proteinen gehören das ubiquitär vorkommende Vinculin sowie dessen muskelspezifische Spleißvariante Metavinculin, deren genaue Funktion bisher nicht bekannt ist. Metavinculin besitzt einen Einschub von zusätzlichen 68 Aminosäuren im Vergleich zu Vinculin, wodurch eine neue alpha-Helix H1´ im Bereich der Schwanzdomäne entsteht, die dem Protein funktionelle Unterschiede verleiht. Frühere Studien zeigten, dass eine Punktmutation innerhalb des Metavinculin-spezifischen Einschubes (Mutante R975W) mit dem Auftreten einer familiären dilatativen Kardiomyopathie assoziiert ist. In der vorliegenden Arbeit wurden biochemische und zellbiologische Versuche sowie immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt, welche bisher unbekannte Eigenschaften des Metavinculins aufdecken und Hinweise zur physiologischen Funktion des Metavinculins in muskulären Zelladhäsionsverbindungen liefern. Es konnte in der Rindermuskulatur gezeigt werden, dass Metavinculin eine fasertypabhängige Expression aufweist, welche unabhängig vom verwendeten Muskeltyp reproduzierbar auftritt. Metavinculin wird im Gegensatz zum ubiquitär vorkommenden Vinculin in den Muskeladhäsionskomplexen vor allem schneller, glykolytischer Muskelfasertypen ausgebildet. Untersuchungen zur Proteindynamik zeigten eine deutlich verlängerte Verweildauer von Metavinculin im Vergleich zu Vinculin in den Adhäsionskomplexen von Muskelvorläuferzellen. In CD-spektroskopischen Untersuchungen konnte eine deutliche Destabilisierung der Schwanzdomäne der Metavinculin-Mutante R975W im Vergleich zum Wildtyp aufgezeigt werden. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der zusätzliche Einbau von Metavinculin in die Adhäsionskomplexe von Muskelfasern eine spezielle Anpassung an die physiologische Funktion und mechanische Belastung der Muskelfasern ist und wahrscheinlich eine höhere mechanische Stabilität bei schnellen und glykolytischen Muskelfasertypen gewährleistet. Wird die Stabilität der Aktin-bindenden Domäne in Metavinculin durch eine Punktmutation vermindert, könnte dies zu einer weniger stabilen Verankerung des Aktinzytoskelettes führen, was zu den pathophysiologischen Veränderung des Herzmuskels im Rahmen einer dilatativen Kardiomyopathie beitragen kann.

In mehrzelligen Organismen ist der Aufbau stabiler Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen lebensnotwendig. Hierfür werden innerhalb einer Körperzelle membranständige Adhäsionskomplexe gebildet, die eine zentrale Rolle in der Verankerung sowie Regulierung des intrazellulären Zytoskelettes spielen. Zu diesen Aktin-bindenden Proteinen gehören das ubiquitär vorkommende Vinculin sowie dessen muskelspezifische Spleißvariante Metavinculin, deren genaue Funktion bisher nicht bekannt ist. Metavinculin besitzt einen Einschub von zusätzlichen 68 Aminosäuren im Vergleich zu Vinculin, wodurch eine neue alpha-Helix H1´ im Bereich der Schwanzdomäne entsteht, die dem Protein funktionelle Unterschiede verleiht. Frühere Studien zeigten, dass eine Punktmutation innerhalb des Metavinculin-spezifischen Einschubes (Mutante R975W) mit dem Auftreten einer familiären dilatativen Kardiomyopathie assoziiert ist. In der vorliegenden Arbeit wurden biochemische und zellbiologische Versuche sowie immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt, welche bisher unbekannte Eigenschaften des Metavinculins aufdecken und Hinweise zur physiologischen Funktion des Metavinculins in muskulären Zelladhäsionsverbindungen liefern. Es konnte in der Rindermuskulatur gezeigt werden, dass Metavinculin eine fasertypabhängige Expression aufweist, welche unabhängig vom verwendeten Muskeltyp reproduzierbar auftritt. Metavinculin wird im Gegensatz zum ubiquitär vorkommenden Vinculin in den Muskeladhäsionskomplexen vor allem schneller, glykolytischer Muskelfasertypen ausgebildet. Untersuchungen zur Proteindynamik zeigten eine deutlich verlängerte Verweildauer von Metavinculin im Vergleich zu Vinculin in den Adhäsionskomplexen von Muskelvorläuferzellen. In CD-spektroskopischen Untersuchungen konnte eine deutliche Destabilisierung der Schwanzdomäne der Metavinculin-Mutante R975W im Vergleich zum Wildtyp aufgezeigt werden. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der zusätzliche Einbau von Metavinculin in die Adhäsionskomplexe von Muskelfasern eine spezielle Anpassung an die physiologische Funktion und mechanische Belastung der Muskelfasern ist und wahrscheinlich eine höhere mechanische Stabilität bei schnellen und glykolytischen Muskelfasertypen gewährleistet. Wird die Stabilität der Aktin-bindenden Domäne in Metavinculin durch eine Punktmutation vermindert, könnte dies zu einer weniger stabilen Verankerung des Aktinzytoskelettes führen, was zu den pathophysiologischen Veränderung des Herzmuskels im Rahmen einer dilatativen Kardiomyopathie beitragen kann.:1 Einleitung……………………………………………………………………......................... 5 1.1 Allgemeine Einleitung……....…………………………………........................... 5 1.2 Die Adhäsionsproteine Metavinculin und Vinculin…......................... 5 1.2.1 Bedeutung und Vorkommen………………………………...........................5 1.2.2 Aufbau, Struktur und Bindungspartner………………......................... 7 1.2.3 Unterschiede in Aufbau und Funktion zwischen Metavinculin und Vinculin ... 8 1.2.4 Unterschiede der Dynamik im Adhäsionskomplex………………............8 1.3 Metavinculin in der Muskulatur………………………………..........................9 1.3.1 Allgemeines………………………………………………………………………………………. 9 1.3.2 Aufbau und Einteilung verschiedener Muskeltypen……………………….. 10 1.3.3 Skelettmuskelfasertypen……………………………………………………………...… 11 1.3.4 Dilatative Kardiomyopathie bei Mutationen im Metavinculingen…12 1.3.5 Ungleiche Verteilung von Metavinculin in verschiedenen Muskeltypen... 13 1.4 Zielstellung der Arbeit………………………………………………………………….. 14 2 Publikation - Metavinculin: New insights into functional properties of a muscle adhesion protein… 15 3 Zusammenfassung…………...........…………………………………………………… 24 4 Anhang……………………………………………...……………………………………………. 29 Material und Methoden………………………………………………..…………………….. 29 Literaturverzeichnis……………………………………………………….…………………… 33 5 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit…………………36 6 Lebenslauf……………………………………………………………………………………….. 37 7 Danksagung……………………………………………………………………………………… 39

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Um mit ihrer Umgebung zu kommunizieren verfügen lebende Zellen über Rezeptoren, welche die umschließende Membran überbrücken. Die vorherrschende G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) erhalten Informationen von Außerhalb durch Bindung eines Liganden, wodurch der Rezeptor aktiviert wird. Während der Aktivierung bildet sich innerzellulär ein offener Spalt, in den ein G-Protein (Gαβγ, G) mit seinem C-terminalen Ende koppeln kann. Die Bindung an einen GPCR führt in der Gα-Untereinheit vom Gαβγ zu einen GDP/GTP-Austausch, welcher für die weitere Signalübertragung ins Zellinnere notwendig ist. Die Kopplung von Rezeptor und Gαβγ umfasst eine Reihe von dynamischen strukturellen Änderungen, die Geschwindigkeit und Spezifität der Interaktion regeln. Hier haben wir MD-Simulationen (Molekulardynamik) verwendet, um die molekularen Details der GPCR Gαβγ Kopplung vor und während der GPCR-Gαβγ-Komplexbildung bis hin zum GDP/GTP-Austausch zu untersuchen. / To communicate with their environment, living cells feature receptors that provide a bridge across the enclosing membrane. The prevalent G protein-coupled receptors (GPCR) receive outside information through the binding of a ligand, which activates the receptor. During activation, an open intracellular crevice forms, to which a G protein (Gαβγ, G) can couple with its Gα C-terminus. Binding to GPCRs triggers GDP/GTP exchange in the Gα subunit of Gαβγ, necessary for further signal transfer within the cell. The coupling between receptor and Gαβγ involves a series of dynamic structural changes that govern speed and specificity of the interaction. Here we used molecular dynamics (MD) simulations to elucidate molecular details of the GPCR Gαβγ coupling process before and during GPCR Gαβγ complex formation up to the GDP/GTP exchange.

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