A organização da membrana biológica em microdomínios tem um papel chave em vários processos celulares semelhante a receptores protéicos e a transdução de sinal. A existência de microdomínios, também denominados de rafts tem sido explicada pela separação das membranas lipídicas em duas fases: liquida cristalina (L) e fase liquida ordenada (Lo) rica em colesterol e esfingolipídeos. Assim, o enfoque deste projeto foi correlacionar mecanismos de controle da atividade da fosfatase alcalina (TNAP) com a organização intermolecular e o estado de fase de alguns lipídios que compõem as vesículas da matrix. Foi estudada a modulação da atividade da enzima e sua inserção à sistemas de lipossomos constituídos com diferentes composições lipídicas (Dipalmitoilfosfatidilcolina, Colesterol, Esfingomielina e Gangliosídeo) como um mecanismo de regulação e transdução entre enzimas que não compartilham intermediários metabólicos comuns. Isto é, verificar como mudanças de organização molecular, induzida por colesterol e/ou outros lipídios, podem modular a atividade de enzimas regulando a produção de mensageiros lipídicos secundários e/ou processos de fusão e recombinação topológica da bicamada lipídica, modulando concomitantemente a atividade da fosfatase alcalina. Com tal propósito, a TNAP foi reconstituída em lipossomos constituídos de DPPC e lipossomos mistos formando sistemas binários DPPC:Chol, DPPC:SM e DPPC:GM1 com razões molares de (9:1); sistemas terciários DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 e DPPC:SM:GM1 com razões molares de (8:1:1) e por fim sistemas quaternários constituídos de DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). Estes sistemas foram propostos com o intuito de mimetizarmos os lipid rafts existentes nas membranas biológicas, porém utilizando lipídios que já foram identificados e quantificados nas vesículas da matrix. Foram avaliados os efeitos da composição lipídica dos lipossomos na inserção da enzima aos sistemas vesiculares. Além disso, foram realizados estudos biofísicos de calorimetria analisando como os parâmetros termodinâmicos são afetados com as diferentes composições lipídicas e pela presença da enzima ancorada aos sistemas. A reconstituição da enzima a lipossomos constituídos de DPPC proporcionou uma incorporação em torno de 80% da atividade enzimática. Estudos termodinâmicos dos proteolipossomos formados evidenciaram uma queda significativa nos valores de variação de entalpia em relação aos sistemas de lipossomos (de 7,63 a 1,88 kcal.mol-1). Lipossomos binários constituídos de DPPC:Chol em concentrações crescentes (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 razão molar) foram estudados tanto pelos parâmetros biofísicos como pela habilidade de inserção da enzima a tais sistemas. Foi observado um significativo decréscimo nos valores de variação entalpia com o aumento da proporção de colesterol no lipossomo. Além disso, a presença do colesterol proporcionou uma redução na inserção da atividade catalítica em até 42%, quando utilizada a composição lipídica de 9:5 DPPC:Chol. Dos sistemas binários formados com razões molares 9:1, o que apresentou maior porcentagem de reconstituição da TNAP foi o sistemas DPPC:Chol, apresentando em torno de 62% de incorporação da enzima. Os sistemas terciários apresentaram ao redor de 30% de incorporação da atividade catalítica e o sistema quaternário em torno de 25%. Além dos ensaios de atividade enzimática, a incorporação da enzima aos sistemas vesiculares também pôde ser comprovada pelas mudanças nos parâmetros termodinâmicas detectados por DSC. Nos estudos de calorimetria de todos os sistemas de proteolipossomos formados, foram observadas significativas diminuições nos valores de variação de entalpia quando comparados aos sistemas de lipossomos correspondentes. Deste modo, os resultados aqui apresentados fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão do comportamento da atividade da fosfatase alcalina na presença de diferentes composições lipídicas dos microdomínios existente membrana, quanto para o entendimento dos processos de regulação da enzima durante o processo de biomineralização. / The organization of the biological membrane in microdomains has a key roll in many cellular processes similar to proteic receptors and signal transduction. The existence of microdomains, also called rafts, has been explained by the lipid membrane separation in two phases: crystalline phase (L) and ordinate liquid phase (Lo), rich in cholesterol and sphingolipids. The focus of this Project was to correlate activity control mechanisms of the alkaline phosphatase (TNAP) with the intermolecular organization and the phase stat of some lipids that comprise the matrix vesicles. The enzyme activity modulation and its insertion into liposomes systems, constituted by different lipid compositions (DPPC, Chol, SM e GM1) as a regulation and transduction mechanism between enzymes that do not share common intermediary metabolites, was studied. That is, to verify how molecular organization changes, induced by cholesterol and/or other lipids, can modulate the enzyme activity regulating the production of secondary lipid messengers and/or fusion processes and topological recombination of the lipidic bilayer, concomitantly modeling the alkaline phosphatase activity. TNAP was then reconstituted in liposomes constituted by DPPC and mixed liposomes forming binary systems DPPC:Chol , DPPC:SM , DPPC: Chol:GM1 with (9:1) molar rates; tertiary systems DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 and DPPC:SM:GM1 with (8:1:1) molar rates and finally quaternary system constituted by DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). These systems were proposed aiming the mimetization of lipid rafts existent in biological membranes, but using lipids that had already been identified and quantified in the matrix vesicles. The effects of liposome lipid composition in the enzyme insertion to the vesicular systems were assayed. Besides that, calorimetry biophysical studies were done analyzing how the thermodynamic parameters are affected by the different lipid compositions e by the presence of the systems anchored enzyme. The enzyme reconstruction to the DPPC constituted liposomes has provided an incorporation of around 80% of the enzyme activity. Thermodynamic studies of the proteoliposomes formed have shown a significant decrease in the H values in relation to the liposomes systems (from 7.63 to 1.88 kcal.mol-1). Binary liposomes constituted of DPPC:Chol in increasing concentrations (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 molar ratio) were studied by the biophysical parameters as well as by the insertion ability of the enzyme into those systems. A significant decrease in the enthalpy values with the increase of the cholesterol proportion in the liposome was observed. Besides that, the presence of cholesterol has allowed a reduction in the insertion of the catalytic activity in up to 42% when the lipid composition 9:5 DPPPC:Chol was used. Among the binary systems formed with molar ratios of 9:1, the one which showed the highest percentage of TNAP reconstitution was the DPPC:Chol system, with around 62% enzyme incorporation. The tertiary systems had around 30% incorporation of the catalytic activity, and the quaternary system around 25%. Besides the enzymatic activity assays, the enzyme incorporation to the vesicular systems can also be verified by the thermodynamic parameters change detected by DSC. In the calorimetry studies of all the proteoliposomes formed, significant decreases in the enthalpy values were observed when compared to the corresponding liposomes systems. Thereby, the results presented here provide new information that can contribute to understand the alkaline phosphatase behavior in the presence of different microdomain lipid compositions existent in the membrane, as well as understanding the regulation processes of the enzyme during the biomineralization process.

A Na,K-ATPase é uma proteína integral que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar íons Na+ e K+ através da membrana contra seus gradientes eletroquímicos. É composta por três subunidades, denominadas alfa, beta e gama. Alguns autores defendem que o protômero (alfa-beta) seja a unidade estrutural e funcional da enzima, porém outros consideram que a enzima nativa da membrana funciona como um oligômero, na forma de um dímero (alfa-beta)2. Em estudos com proteínas de membrana, o uso de detergentes é bastante comum para manter a proteína de interesse em um estado funcional após ser retirada da bicamada lipídica, além disso, sabe-se que vários fatores interferem a atividade enzimática da Na,K-ATPase e existem evidências que mostram que a bicamada lipídica, na qual a enzima está inserida, também controla a interação entre os protômeros da proteína e alterações nas suas propriedades biofísicas podem modular a atividade da enzima. O objetivo do trabalho foi verificar o efeito de diferentes razões detergente/proteína na estabilidade da Na,K-ATPase solubilizada e de diferentes microambientes lipídicos na sua atividade, analisando as alterações no comportamento termotrópico da bicamada com a mudança da composição lipídica, observando as alterações da incorporação e recuperação da atividade enzimática quando a proteína foi reconstituída em sistemas miméticos de membrana. Utilizando o espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi possível acompanhar o processo de agregação térmica da enzima, fornecendo informações da sua estrutura, bem como avaliar a sua estabilidade quando solubilizada. A desnaturação térmica da Na,K-ATPase também foi avaliada por calorimetria diferencial de varredura (DSC) e verificou-se que é um processo irreversível, e ocorreu entre 50 e 70°C, sendo a soma de três transições. Utilizando DSC, analisou-se ainda o comportamento termotrópico dos sistemas de lipossomos e proteolipossomos constituídos de DPPC, DPPE e colesterol. Para os sistemas vesiculares, na ausência da proteína, foi observado que para o sistema binário de DPPC e DPPE, o aumento da proporção do último lipídio induz uma separação de fase, assim como a presença de colesterol, tanto nos sistemas binários (DPPC:Col e DPPE:Col), quanto no ternário (DPPC:DPPE:Col). Avaliou-se ainda como o microambiente lipídico interfere na incorporação e atividade da Na,K-ATPase. Verificou que diferentes quantidades de colesterol alteram a atividade enzimática, confirmando que este possui um importante papel na modulação da atividade, alterando propriedades da membrana e influenciando na conformação da proteína. / Na,K-ATPase is an enzyme that is intrinsic to the plasma membrane, responsible for the coupled active transport of Na+ and K+ across animal cell membranes. The enzyme consists of alfa, beta and gama subunits. It has been demonstrated that the alfa-beta form of Na,K-ATPase is capable of both ATP hydrolysis and active ion transport, however accumulating evidence suggest that the enzyme normally self-associates as (alfa-beta)2 dimers. In membrane protein research, the most typical use of a detergent is to maintain a target membrane protein in a functional, folded state in the absence of a membrane. Moreover, it is known that several factors influence the enzymatic activity of Na, K-ATPase and there is evidence that the lipid bilayer, in which the enzyme is located, also controls the interaction between protomers and that changes in their biophysical properties can modulate the activity of the enzyme. The objective of this study was to investigate the effect of different detergent/protein ratios on the stability solubilized of Na, K-ATPase and different lipid microenvironments in their activity by analyzing changes in the thermotropic behavior of the bilayer, analysing the incorporation changes and the recovery of enzyme activity when the protein was reconstituted in a membrane mimetic systems. Dynamic light scattering (DLS) was used to monitor the process of thermal aggregation of the enzyme, providing information on their structure and evaluating its stability when solubized. The thermal denaturation of Na, K-ATPase was also evaluated by differential scanning calorimetry (DSC) and it was verified that it is an irreversible process, which occurred between 50 and 70 ° C, being the sum of three transitions. Using DSC, we analyzed the thermotropic behavior of proteolipossomos and liposomes consisting of DPPC, DPPE and cholesterol. For vesicular systems in the absence of the protein, it was observed that for the binary system of DPPC and DPPE, increasing the proportion of the latter induces a lipid phase separation and the presence of cholesterol in both binary systems (DPPC: Col and DPPE: Chol), and in the ternary system (DPPC: DPPE: Chol) it induces a lipid phase separation. It was also evaluated how the lipid microenvironment interferes on the incorporation and activity of Na, K-ATPase. It was found that different amounts of cholesterol alter the enzyme activity, confirming cholesterol has an important role in the modulation of the activity by altering the membrane properties and influencing the protein conformation.

A Na, K-ATPase (NKA) é uma proteína de membrana encontrada em organismos eucariotos multicelulares cuja atividade e funções já são amplamente discutidas na literatura. Sua unidade funcional corresponde a um heterodímero formado por duas subunidades , com regiões transmembrana. Espécies multiméricas como dímeros e tetrâmeros dessa enzima também são conhecidos por exercer atividade enzimática. As interações lipídio-proteína são intrínsecas para a NKA, por tal motivo, proteolipossomos constituídos de DPPC e DPPC:DPPE foram preparados por co-solubilização. Como controle, lipossomos de mesma composição foram produzidos por extrusão e/ou sonicação. Para as imagens de AFM, as amostras foram fixadas com glutaraldeído, para proteção mecânica e contra desidratação das vesículas. Para lipossomos de DPPC as imagens topográficas de AFM das vesículas apresentaram formato oval, superfície perfeitamente lisa e diâmetro médio de 151 + 46 nm, enquanto as vesículas de composição DPPC:DPPE, apesar de lisas, tiveram cantos pontiagudos e diâmetro médio de 98 + 28 nm. Imagens de fase de ambas as composições não apresentaram qualquer indicativo de diferenças na composição química, provavelmente devido à natureza de carga neutra dos dois fosfolipídios. As imagens de fase por AFM para os proteolipossomos tanto de DPPC-NKA, quanto DPPC:DPPE-NKA, revelaram resultados inéditos na literatura, onde a inserção da NKA aparece como nítidas regiões transições de fase de composição química distinta quando comparadas com os lipossomos. No entanto, as mudanças de fase são diferentes entre as composições estudadas, aparecendo como manchas escuras circulares para DPPC-NKA e mais visíveis como interstícios brilhantes para composição de DPPC:DPPE-NKA. As vesículas de DPPC-NKA apresentaram diâmetro médio de 390 + 326 nm e, nas imagens de topografia tridimensionais, protusões de 38 a 115 nm correspondentes às regiões de mudanças de fase, que, indicaram o diâmetro dos microdomínios relacionados à proteína. Já nas imagens para DPPC:DPPE-NKA o diâmetro médio dos proteolipossomos foi de 189 + 156 nm, e as protusões apareceram entre os interstícios, variando de 20 a 66 nm. O estudo de DSC dos lipossomos revelou que a concentração de glutaraldeído nas condições das análises de AFM, em torno de 5% (v/v), afetam as características físico-químicas para as composições com DPPE. A AFM foi eficiente para confirmar a reinserção da NKA em proteolipossomos pelas imagens de fase, e, para medir o diâmetro dos microdomínios pelas imagens de topografia. / Na, K-ATPase (NKA) is a membrane protein present in eukaryotic multicellular organisms. Its functions and activity are already widely described in the literature. Its minimal functional structure is a heterodimer of two main subunits , with transmembrane domains. However, dimers and tetramers of the enzyme are also known to have enzymatic activity. Since there are intrinsic lipid-protein interactions, NKA proteoliposomes composed of DPPC and DPPC:DPPE (1:1 molar ratio) were prepared by the co-solubilization method and liposomes of the same compositions were obtained by extrusion and/or sonication to be used as control. The samples to the AFM study were prepared using glutaraldehyde to protect the vesicles from mechanical shocks and dehydration. Liposomes composed of DPPC and DPPC:DPPE (1:1 molar ratio) were prepared by extrusion and sonication, respectively, as control. The topographical images for DPPC liposomes showed vesicles with an oval shape and smoothed surfaces with a mean diameter of 151 + 46 nm. DPPC:DPPE vesicles also presented smoothed surfaces, but with pointed corners and mean diameter of 98 + 28 nm. Phase images for both lipid compositions showed no differences in chemical composition. For DPPC:DPPE samples, this can be explained by the neutral net charge of both lipids. The proteoliposomes observed in the AFM phase images showed darker and large circular spots in the vesicles. These spots represent delays in the phase oscillation of the AFM probe and are associated with different chemical composition. The phase changes showed the reconstitution of the NKA in the proteoliposomes. When compared with topographical images, this spots matched protrusions. The mean diameter of DPPC-NKA proteoliposomes determined by AFM was 390 + 326 nm. In the three-dimensional topographical images of composition, protrusions from 38 to 115 nm near the areas of different phases indicate the diameters of the NKA microdomains. The phase changes for DPPC:DPPE-NKA appeared as bright interstices with the protrusions of the topographical images in between them. The size of these protrusions ranged from 20 to 66 nm and the mean diameter of the proteoliposomes was 189 + 156 nm. The DSC liposomes data showed that the glutaraldehyde concentration used in the AFM analysis affect the physical chemistry properties of the samples with DPPE. AFM proved to be an efficient method to confirm the reconstitution of into proteoliposomes with phase images and to determine the diameter of the protein microdomains with the topographical images.

A Na,K-ATPase é uma proteína integral que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar íons Na+ e K+ através da membrana contra seus gradientes eletroquímicos. É composta por três subunidades, denominadas alfa, beta e gama. Alguns autores defendem que o protômero (alfa-beta) seja a unidade estrutural e funcional da enzima, porém outros consideram que a enzima nativa da membrana funciona como um oligômero, na forma de um dímero (alfa-beta)2. Em estudos com proteínas de membrana, o uso de detergentes é bastante comum para manter a proteína de interesse em um estado funcional após ser retirada da bicamada lipídica, além disso, sabe-se que vários fatores interferem a atividade enzimática da Na,K-ATPase e existem evidências que mostram que a bicamada lipídica, na qual a enzima está inserida, também controla a interação entre os protômeros da proteína e alterações nas suas propriedades biofísicas podem modular a atividade da enzima. O objetivo do trabalho foi verificar o efeito de diferentes razões detergente/proteína na estabilidade da Na,K-ATPase solubilizada e de diferentes microambientes lipídicos na sua atividade, analisando as alterações no comportamento termotrópico da bicamada com a mudança da composição lipídica, observando as alterações da incorporação e recuperação da atividade enzimática quando a proteína foi reconstituída em sistemas miméticos de membrana. Utilizando o espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi possível acompanhar o processo de agregação térmica da enzima, fornecendo informações da sua estrutura, bem como avaliar a sua estabilidade quando solubilizada. A desnaturação térmica da Na,K-ATPase também foi avaliada por calorimetria diferencial de varredura (DSC) e verificou-se que é um processo irreversível, e ocorreu entre 50 e 70°C, sendo a soma de três transições. Utilizando DSC, analisou-se ainda o comportamento termotrópico dos sistemas de lipossomos e proteolipossomos constituídos de DPPC, DPPE e colesterol. Para os sistemas vesiculares, na ausência da proteína, foi observado que para o sistema binário de DPPC e DPPE, o aumento da proporção do último lipídio induz uma separação de fase, assim como a presença de colesterol, tanto nos sistemas binários (DPPC:Col e DPPE:Col), quanto no ternário (DPPC:DPPE:Col). Avaliou-se ainda como o microambiente lipídico interfere na incorporação e atividade da Na,K-ATPase. Verificou que diferentes quantidades de colesterol alteram a atividade enzimática, confirmando que este possui um importante papel na modulação da atividade, alterando propriedades da membrana e influenciando na conformação da proteína. / Na,K-ATPase is an enzyme that is intrinsic to the plasma membrane, responsible for the coupled active transport of Na+ and K+ across animal cell membranes. The enzyme consists of alfa, beta and gama subunits. It has been demonstrated that the alfa-beta form of Na,K-ATPase is capable of both ATP hydrolysis and active ion transport, however accumulating evidence suggest that the enzyme normally self-associates as (alfa-beta)2 dimers. In membrane protein research, the most typical use of a detergent is to maintain a target membrane protein in a functional, folded state in the absence of a membrane. Moreover, it is known that several factors influence the enzymatic activity of Na, K-ATPase and there is evidence that the lipid bilayer, in which the enzyme is located, also controls the interaction between protomers and that changes in their biophysical properties can modulate the activity of the enzyme. The objective of this study was to investigate the effect of different detergent/protein ratios on the stability solubilized of Na, K-ATPase and different lipid microenvironments in their activity by analyzing changes in the thermotropic behavior of the bilayer, analysing the incorporation changes and the recovery of enzyme activity when the protein was reconstituted in a membrane mimetic systems. Dynamic light scattering (DLS) was used to monitor the process of thermal aggregation of the enzyme, providing information on their structure and evaluating its stability when solubized. The thermal denaturation of Na, K-ATPase was also evaluated by differential scanning calorimetry (DSC) and it was verified that it is an irreversible process, which occurred between 50 and 70 ° C, being the sum of three transitions. Using DSC, we analyzed the thermotropic behavior of proteolipossomos and liposomes consisting of DPPC, DPPE and cholesterol. For vesicular systems in the absence of the protein, it was observed that for the binary system of DPPC and DPPE, increasing the proportion of the latter induces a lipid phase separation and the presence of cholesterol in both binary systems (DPPC: Col and DPPE: Chol), and in the ternary system (DPPC: DPPE: Chol) it induces a lipid phase separation. It was also evaluated how the lipid microenvironment interferes on the incorporation and activity of Na, K-ATPase. It was found that different amounts of cholesterol alter the enzyme activity, confirming cholesterol has an important role in the modulation of the activity by altering the membrane properties and influencing the protein conformation.

A organização da membrana biológica em microdomínios tem um papel chave em vários processos celulares semelhante a receptores protéicos e a transdução de sinal. A existência de microdomínios, também denominados de rafts tem sido explicada pela separação das membranas lipídicas em duas fases: liquida cristalina (L) e fase liquida ordenada (Lo) rica em colesterol e esfingolipídeos. Assim, o enfoque deste projeto foi correlacionar mecanismos de controle da atividade da fosfatase alcalina (TNAP) com a organização intermolecular e o estado de fase de alguns lipídios que compõem as vesículas da matrix. Foi estudada a modulação da atividade da enzima e sua inserção à sistemas de lipossomos constituídos com diferentes composições lipídicas (Dipalmitoilfosfatidilcolina, Colesterol, Esfingomielina e Gangliosídeo) como um mecanismo de regulação e transdução entre enzimas que não compartilham intermediários metabólicos comuns. Isto é, verificar como mudanças de organização molecular, induzida por colesterol e/ou outros lipídios, podem modular a atividade de enzimas regulando a produção de mensageiros lipídicos secundários e/ou processos de fusão e recombinação topológica da bicamada lipídica, modulando concomitantemente a atividade da fosfatase alcalina. Com tal propósito, a TNAP foi reconstituída em lipossomos constituídos de DPPC e lipossomos mistos formando sistemas binários DPPC:Chol, DPPC:SM e DPPC:GM1 com razões molares de (9:1); sistemas terciários DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 e DPPC:SM:GM1 com razões molares de (8:1:1) e por fim sistemas quaternários constituídos de DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). Estes sistemas foram propostos com o intuito de mimetizarmos os lipid rafts existentes nas membranas biológicas, porém utilizando lipídios que já foram identificados e quantificados nas vesículas da matrix. Foram avaliados os efeitos da composição lipídica dos lipossomos na inserção da enzima aos sistemas vesiculares. Além disso, foram realizados estudos biofísicos de calorimetria analisando como os parâmetros termodinâmicos são afetados com as diferentes composições lipídicas e pela presença da enzima ancorada aos sistemas. A reconstituição da enzima a lipossomos constituídos de DPPC proporcionou uma incorporação em torno de 80% da atividade enzimática. Estudos termodinâmicos dos proteolipossomos formados evidenciaram uma queda significativa nos valores de variação de entalpia em relação aos sistemas de lipossomos (de 7,63 a 1,88 kcal.mol-1). Lipossomos binários constituídos de DPPC:Chol em concentrações crescentes (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 razão molar) foram estudados tanto pelos parâmetros biofísicos como pela habilidade de inserção da enzima a tais sistemas. Foi observado um significativo decréscimo nos valores de variação entalpia com o aumento da proporção de colesterol no lipossomo. Além disso, a presença do colesterol proporcionou uma redução na inserção da atividade catalítica em até 42%, quando utilizada a composição lipídica de 9:5 DPPC:Chol. Dos sistemas binários formados com razões molares 9:1, o que apresentou maior porcentagem de reconstituição da TNAP foi o sistemas DPPC:Chol, apresentando em torno de 62% de incorporação da enzima. Os sistemas terciários apresentaram ao redor de 30% de incorporação da atividade catalítica e o sistema quaternário em torno de 25%. Além dos ensaios de atividade enzimática, a incorporação da enzima aos sistemas vesiculares também pôde ser comprovada pelas mudanças nos parâmetros termodinâmicas detectados por DSC. Nos estudos de calorimetria de todos os sistemas de proteolipossomos formados, foram observadas significativas diminuições nos valores de variação de entalpia quando comparados aos sistemas de lipossomos correspondentes. Deste modo, os resultados aqui apresentados fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão do comportamento da atividade da fosfatase alcalina na presença de diferentes composições lipídicas dos microdomínios existente membrana, quanto para o entendimento dos processos de regulação da enzima durante o processo de biomineralização. / The organization of the biological membrane in microdomains has a key roll in many cellular processes similar to proteic receptors and signal transduction. The existence of microdomains, also called rafts, has been explained by the lipid membrane separation in two phases: crystalline phase (L) and ordinate liquid phase (Lo), rich in cholesterol and sphingolipids. The focus of this Project was to correlate activity control mechanisms of the alkaline phosphatase (TNAP) with the intermolecular organization and the phase stat of some lipids that comprise the matrix vesicles. The enzyme activity modulation and its insertion into liposomes systems, constituted by different lipid compositions (DPPC, Chol, SM e GM1) as a regulation and transduction mechanism between enzymes that do not share common intermediary metabolites, was studied. That is, to verify how molecular organization changes, induced by cholesterol and/or other lipids, can modulate the enzyme activity regulating the production of secondary lipid messengers and/or fusion processes and topological recombination of the lipidic bilayer, concomitantly modeling the alkaline phosphatase activity. TNAP was then reconstituted in liposomes constituted by DPPC and mixed liposomes forming binary systems DPPC:Chol , DPPC:SM , DPPC: Chol:GM1 with (9:1) molar rates; tertiary systems DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 and DPPC:SM:GM1 with (8:1:1) molar rates and finally quaternary system constituted by DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). These systems were proposed aiming the mimetization of lipid rafts existent in biological membranes, but using lipids that had already been identified and quantified in the matrix vesicles. The effects of liposome lipid composition in the enzyme insertion to the vesicular systems were assayed. Besides that, calorimetry biophysical studies were done analyzing how the thermodynamic parameters are affected by the different lipid compositions e by the presence of the systems anchored enzyme. The enzyme reconstruction to the DPPC constituted liposomes has provided an incorporation of around 80% of the enzyme activity. Thermodynamic studies of the proteoliposomes formed have shown a significant decrease in the H values in relation to the liposomes systems (from 7.63 to 1.88 kcal.mol-1). Binary liposomes constituted of DPPC:Chol in increasing concentrations (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 molar ratio) were studied by the biophysical parameters as well as by the insertion ability of the enzyme into those systems. A significant decrease in the enthalpy values with the increase of the cholesterol proportion in the liposome was observed. Besides that, the presence of cholesterol has allowed a reduction in the insertion of the catalytic activity in up to 42% when the lipid composition 9:5 DPPPC:Chol was used. Among the binary systems formed with molar ratios of 9:1, the one which showed the highest percentage of TNAP reconstitution was the DPPC:Chol system, with around 62% enzyme incorporation. The tertiary systems had around 30% incorporation of the catalytic activity, and the quaternary system around 25%. Besides the enzymatic activity assays, the enzyme incorporation to the vesicular systems can also be verified by the thermodynamic parameters change detected by DSC. In the calorimetry studies of all the proteoliposomes formed, significant decreases in the enthalpy values were observed when compared to the corresponding liposomes systems. Thereby, the results presented here provide new information that can contribute to understand the alkaline phosphatase behavior in the presence of different microdomain lipid compositions existent in the membrane, as well as understanding the regulation processes of the enzyme during the biomineralization process.

A Na, K-ATPase (NKA) é uma proteína de membrana encontrada em organismos eucariotos multicelulares cuja atividade e funções já são amplamente discutidas na literatura. Sua unidade funcional corresponde a um heterodímero formado por duas subunidades , com regiões transmembrana. Espécies multiméricas como dímeros e tetrâmeros dessa enzima também são conhecidos por exercer atividade enzimática. As interações lipídio-proteína são intrínsecas para a NKA, por tal motivo, proteolipossomos constituídos de DPPC e DPPC:DPPE foram preparados por co-solubilização. Como controle, lipossomos de mesma composição foram produzidos por extrusão e/ou sonicação. Para as imagens de AFM, as amostras foram fixadas com glutaraldeído, para proteção mecânica e contra desidratação das vesículas. Para lipossomos de DPPC as imagens topográficas de AFM das vesículas apresentaram formato oval, superfície perfeitamente lisa e diâmetro médio de 151 + 46 nm, enquanto as vesículas de composição DPPC:DPPE, apesar de lisas, tiveram cantos pontiagudos e diâmetro médio de 98 + 28 nm. Imagens de fase de ambas as composições não apresentaram qualquer indicativo de diferenças na composição química, provavelmente devido à natureza de carga neutra dos dois fosfolipídios. As imagens de fase por AFM para os proteolipossomos tanto de DPPC-NKA, quanto DPPC:DPPE-NKA, revelaram resultados inéditos na literatura, onde a inserção da NKA aparece como nítidas regiões transições de fase de composição química distinta quando comparadas com os lipossomos. No entanto, as mudanças de fase são diferentes entre as composições estudadas, aparecendo como manchas escuras circulares para DPPC-NKA e mais visíveis como interstícios brilhantes para composição de DPPC:DPPE-NKA. As vesículas de DPPC-NKA apresentaram diâmetro médio de 390 + 326 nm e, nas imagens de topografia tridimensionais, protusões de 38 a 115 nm correspondentes às regiões de mudanças de fase, que, indicaram o diâmetro dos microdomínios relacionados à proteína. Já nas imagens para DPPC:DPPE-NKA o diâmetro médio dos proteolipossomos foi de 189 + 156 nm, e as protusões apareceram entre os interstícios, variando de 20 a 66 nm. O estudo de DSC dos lipossomos revelou que a concentração de glutaraldeído nas condições das análises de AFM, em torno de 5% (v/v), afetam as características físico-químicas para as composições com DPPE. A AFM foi eficiente para confirmar a reinserção da NKA em proteolipossomos pelas imagens de fase, e, para medir o diâmetro dos microdomínios pelas imagens de topografia. / Na, K-ATPase (NKA) is a membrane protein present in eukaryotic multicellular organisms. Its functions and activity are already widely described in the literature. Its minimal functional structure is a heterodimer of two main subunits , with transmembrane domains. However, dimers and tetramers of the enzyme are also known to have enzymatic activity. Since there are intrinsic lipid-protein interactions, NKA proteoliposomes composed of DPPC and DPPC:DPPE (1:1 molar ratio) were prepared by the co-solubilization method and liposomes of the same compositions were obtained by extrusion and/or sonication to be used as control. The samples to the AFM study were prepared using glutaraldehyde to protect the vesicles from mechanical shocks and dehydration. Liposomes composed of DPPC and DPPC:DPPE (1:1 molar ratio) were prepared by extrusion and sonication, respectively, as control. The topographical images for DPPC liposomes showed vesicles with an oval shape and smoothed surfaces with a mean diameter of 151 + 46 nm. DPPC:DPPE vesicles also presented smoothed surfaces, but with pointed corners and mean diameter of 98 + 28 nm. Phase images for both lipid compositions showed no differences in chemical composition. For DPPC:DPPE samples, this can be explained by the neutral net charge of both lipids. The proteoliposomes observed in the AFM phase images showed darker and large circular spots in the vesicles. These spots represent delays in the phase oscillation of the AFM probe and are associated with different chemical composition. The phase changes showed the reconstitution of the NKA in the proteoliposomes. When compared with topographical images, this spots matched protrusions. The mean diameter of DPPC-NKA proteoliposomes determined by AFM was 390 + 326 nm. In the three-dimensional topographical images of composition, protrusions from 38 to 115 nm near the areas of different phases indicate the diameters of the NKA microdomains. The phase changes for DPPC:DPPE-NKA appeared as bright interstices with the protrusions of the topographical images in between them. The size of these protrusions ranged from 20 to 66 nm and the mean diameter of the proteoliposomes was 189 + 156 nm. The DSC liposomes data showed that the glutaraldehyde concentration used in the AFM analysis affect the physical chemistry properties of the samples with DPPE. AFM proved to be an efficient method to confirm the reconstitution of into proteoliposomes with phase images and to determine the diameter of the protein microdomains with the topographical images.

A biomineralização óssea é um processo complexo e multifatorial sendo um grande desafio para a ciência à compreensão dos seus mecanismos regulatórios. Este processo é mediado pela liberação de vesículas da matriz (MVs), as quais surgem das superfícies de osteoblastos e são secretadas no local específico do início da biomineralização. MVs têm a capacidade de acumular altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Especial atenção deve ser dada a duas proteínas: Anexina V (AnxA5) e Fosfatase Alcalina (TNAP). As anexinas são as proteínas mais abundantes detectadas nas MVs e responsáveis pela formação de canais de cálcio. TNAP apresenta atividade fosfomonohidrolítica, produzindo Pi a partir, principalmente, de pirofosfato (PPi) e ATP. O enfoque deste projeto foi produzir e caracterizar proteolipossomos com diferentes composições lipídicas de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) contendo TNAP e AnxA5, e manter a funcionalidade das proteínas após incorporação nos sistemas miméticos. Foi possível incorporar AnxA5 em DPPC-proteolipossomos (11,64 µg/mL), mas na presença de DPPS houve um aumento significativo de AnxA5 incorporada (25,79 µg/mL) a DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar). A presença das proteínas nos proteolipossomos compostos por DPPC e DPPC:DPPS 5, 10 e 15% (razão molar) foi confirmada por SDS-PAGE e Immunoblotting. Melhores rendimentos de incorporação das duas proteínas foram obtidos quando ambas foram incorporadas concomitantemente. DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteoliposomos revelaram conter 75% de AnxA5 e 25% de TNAP em concentração de proteína. A presença de DPPS não afetou significativamente as porcentagens de proteínas incorporadas. Os parâmetros cinéticos da TNAP na hidrólise de diferentes substratos fisiológicos (ATP, ADP e PPi) foram determinados na presença e ausência de AnxA5, em pH fisiológico, e para os diversos sistemas lipídicos. A melhor eficiência catalítica da enzima foi obtida para sistemas contendo 10% de DPPS (razão molar) (kcat/K0.5= 183,02; 776,06 e 657,08 M-1.s-1, respectivamente). A TNAP apresentou maior especificidade para a hidrólise de PPi quando comparado com ATP e ADP. Estudos utilizando Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) mostraram que o aumento da concentração de DPPS em DPPC-lipossomos proporcionou um progressivo alargamento no pico de transição de fase, diminuição na t1/2 e H. A pré-transição de fase só foi detectada até a concentração de 15% de DPPS em DPPC. Para 20% de DPPS e acima, observou-se uma segregação lateral de fase com a formação de possíveis microdomínios ricos em DPPS. A interação da AnxA5 com DPPC-lipossomos e DPPC:DPPS 10%-lipossomos resultou em uma redução nos valores de H (de 8,73 para 5,68 e 8,43 para 5,37 Kcal.mol-1, respectivamente). Quando a TNAP está presente nos proteolipossomos, este efeito é ainda maior. A AnxA5 incorporada em DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar) foi capazes de mediar o influxo de 45Ca2+ para dentro das vesículas (~ 800 nmol Ca2+) quando utilizados faixas de concentração de cálcio em níveis fisiológicos (~2 mM). A presença da TNAP nos proteolipossomos não afetou o influxo de Ca2+ mediado pela AnxA5. Entretanto, a presença da AnxA5 afetou significativamente os parâmetros cinéticos da TNAP para os diferentes substratos. Estudos com vesículas unilamelares gigantes (GUVs) também confirmaram a inserção funcional da AnxA5 em vesículas constituídos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e DOPC:DPPS 10% (razão molar). O principal efeito causado pela AnxA5 na morfologia das GUVs foi a perda de contraste óptico devido a formação de poros nas membranas das vesículas. Neste caso, a presença de DPPS não proporcionou mudanças significativas para a incorporação da AnxA5. TNAP quando inserida em GUVs provocou intensa flutuação e excesso de área das vesículas com formação de filamentos. A presença do DPPS provavelmente dificulta a inserção da TNAP à membrana das GUVs. Quando há microdomínios lipídicos heterogêneos na composição de GUVs compostas por DOPC:Colesterol:Esfingomielina (8:1:1) e DOPC:Colesterol:Esfingomielina:Gangliosídeo (7:1:1:1) (razão molar), a inserção da TNAP provocou uma maior segregação lateral de fase evidenciada por imagens com fluorescência. A presença da TNAP e AnxA5 em DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos proporcionou mudanças significativas nas propriedades mecânicas visco-elásticas dos proteolipossomos detectadas por imagens de Microscopia de Força Atômica. Assim, no presente trabalho foi possível obter uma inédita metodologia para a formação de proteolipossomos contendo TNAP e AnxA5 concomitantemente, os quais apresentaram uma reconstituição funcional das proteínas, apresentando capacidade de captar Ca2+ para dentro das vesículas e habilidade de hidrolisar fosfosubstratos em sua superfície. / Bone biomineralization is a multifactorial and complex process, being a challenge for the science the understanding of their regulatory mechanisms. This process is mediated by the release of matrix vesicles (MVs), structures which arise by budding from osteoblast and chondroblast surface and are secreted in the specific site where biomineralization begins. MVs have the ability of accumulating high concentrations of Ca2+ and Pi ions, providing an adequate microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. Two protein families present in MVs merit special attention: Annexins and Phosphatases. The annexins were the most abundant proteins detected in MVs and are responsible for the Ca2+-channels formation (especially AnxA5). Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) exhibits phosphomonohydrolytic activity, producing Pi mainly from PPi and ATP. Such proteins regulate the formation of calcium phosphate crystals, acting directly in the bone mineralization process. The goal of this project was to produce and characterize proteoliposomes with different lipid compositions of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS) harboring TNAP and AnxA5, keeping the functions of both proteins after their incorporation into the mimetic systems. AnxA5 was able to incorporate into DPPC-proteoliposomes (11.64 µg/mL), but the presence of DPPS increased significantly the AnxA5 incorporation (25.79 µg/mL) into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes. The presence of both proteins into DPPC and DPPC:DPPS 5, 10 and 15% (molar ratios) proteoliposomes was confirmed by SDS-PAGE and Immunoblotting analysis. Better yield of TNAP and AnxA5 incorporation was observed when both proteins were reconstituted simultaneously. DPPC-proteoliposomes and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) incorporated about 75% of AnxA5 and 25% of TNAP (protein concentration). DPPS presence did not affect significantly the yield of incorporation of both proteins. The kinetic parameters for the hydrolysis of different physiological substrates (ATP, ADP and PPi) by TNAP were determined in the presence and absence of AnxA5, at physiological pH, for the different systems. The best catalytic efficiencies were achieved with proteoliposomes containing DPPS 10% (molar ratio) (kcat/K0.5= 183.02; 776.06 and 657.08 M-1.s-1 for ATP, ADP and PPi, respectively), condition that also favored PPi hydrolysis by TNAP when compared to ATP and ADP hydrolysis. Studies by Differential Scanning Calorimetry (DSC) showed that the increasing DPPS concentrations in the DPPC-liposomes resulted in a progressive broadening of the phase transition peaks and decreased t1/2 and H values. The pre-transition was detected only in concentrations up to DPPS 15% in DPPC. Phase lateral segregation can be observed for DPPS 20% and above, suggesting the formation of DPPS-rich microdomains. The interaction of AnxA5 with DPPC and DPPC:DPPS 10%-liposomes resulted in a decrease of H values (from 8.73 to 5.68 and from 8.43 to 5.37 Kcal.mol-1, respectively). When TNAP was present in the proteoliposomes, this effect was even greater. AnxA5 incorporated into DPPC and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) was able to mediate 45Ca2+-influx (~ 800 nmol Ca2+) into the vesicles at physiological Ca2+-concentrations (~ 2 mM), and this process was not affected by the presence of TNAP in the systems. However, AnxA5 affected significantly the hydrolysis of substrates by TNAP. Studies with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) also confirmed the functional reconstitution of AnxA5 in dioleoylphosphocholine (DOPC) and DOPC:DPPS 10% (molar ratio) vesicles. The main effect caused by AnxA5 in the GUVs morphology was the formation of pores in the vesicles membrane. In this case, DPPS presence did not affect the AnxA5 incorporation. The presence of TNAP in GUVs caused a several fluctuation, indicating that the vesicles acquired an excess of area and undergoes sequential budding transitions. It is suggested that the presence of DPPS makes the TNAP insertion into the GUVs membrane difficult. With the presence of heterogeneous lipid microdomains in GUVs composed of DOPC, Cholesterol (Chol), Sphingomyelin (SM) and Ganglioside (GM1) in the proportions DOPC:Chol:SM 8:1:1 and DOPC:Chol:SM:GM1 7:1:1:1 (molar ratios), the TNAP insertion caused a greater phase lateral segregation, evidenced by fluorescence analysis. Atomic Force Microscopy (AFM) analysis indicated that the presence of both proteins into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) caused significant changes in the visco-elastic mechanical properties of the vesicles. In conclusion, the present work describes the synthesis of proteoliposomes harboring TNAP and AnxA5 concomitantly, with the functional reconstitution of both proteins, with the ability to transport Ca2+ into the vesicles and hydrolyze phosphosubstrates on their surface.

A biomineralização óssea é um processo complexo e multifatorial sendo um grande desafio para a ciência à compreensão dos seus mecanismos regulatórios. Este processo é mediado pela liberação de vesículas da matriz (MVs), as quais surgem das superfícies de osteoblastos e são secretadas no local específico do início da biomineralização. MVs têm a capacidade de acumular altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Especial atenção deve ser dada a duas proteínas: Anexina V (AnxA5) e Fosfatase Alcalina (TNAP). As anexinas são as proteínas mais abundantes detectadas nas MVs e responsáveis pela formação de canais de cálcio. TNAP apresenta atividade fosfomonohidrolítica, produzindo Pi a partir, principalmente, de pirofosfato (PPi) e ATP. O enfoque deste projeto foi produzir e caracterizar proteolipossomos com diferentes composições lipídicas de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) contendo TNAP e AnxA5, e manter a funcionalidade das proteínas após incorporação nos sistemas miméticos. Foi possível incorporar AnxA5 em DPPC-proteolipossomos (11,64 µg/mL), mas na presença de DPPS houve um aumento significativo de AnxA5 incorporada (25,79 µg/mL) a DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar). A presença das proteínas nos proteolipossomos compostos por DPPC e DPPC:DPPS 5, 10 e 15% (razão molar) foi confirmada por SDS-PAGE e Immunoblotting. Melhores rendimentos de incorporação das duas proteínas foram obtidos quando ambas foram incorporadas concomitantemente. DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteoliposomos revelaram conter 75% de AnxA5 e 25% de TNAP em concentração de proteína. A presença de DPPS não afetou significativamente as porcentagens de proteínas incorporadas. Os parâmetros cinéticos da TNAP na hidrólise de diferentes substratos fisiológicos (ATP, ADP e PPi) foram determinados na presença e ausência de AnxA5, em pH fisiológico, e para os diversos sistemas lipídicos. A melhor eficiência catalítica da enzima foi obtida para sistemas contendo 10% de DPPS (razão molar) (kcat/K0.5= 183,02; 776,06 e 657,08 M-1.s-1, respectivamente). A TNAP apresentou maior especificidade para a hidrólise de PPi quando comparado com ATP e ADP. Estudos utilizando Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) mostraram que o aumento da concentração de DPPS em DPPC-lipossomos proporcionou um progressivo alargamento no pico de transição de fase, diminuição na t1/2 e H. A pré-transição de fase só foi detectada até a concentração de 15% de DPPS em DPPC. Para 20% de DPPS e acima, observou-se uma segregação lateral de fase com a formação de possíveis microdomínios ricos em DPPS. A interação da AnxA5 com DPPC-lipossomos e DPPC:DPPS 10%-lipossomos resultou em uma redução nos valores de H (de 8,73 para 5,68 e 8,43 para 5,37 Kcal.mol-1, respectivamente). Quando a TNAP está presente nos proteolipossomos, este efeito é ainda maior. A AnxA5 incorporada em DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar) foi capazes de mediar o influxo de 45Ca2+ para dentro das vesículas (~ 800 nmol Ca2+) quando utilizados faixas de concentração de cálcio em níveis fisiológicos (~2 mM). A presença da TNAP nos proteolipossomos não afetou o influxo de Ca2+ mediado pela AnxA5. Entretanto, a presença da AnxA5 afetou significativamente os parâmetros cinéticos da TNAP para os diferentes substratos. Estudos com vesículas unilamelares gigantes (GUVs) também confirmaram a inserção funcional da AnxA5 em vesículas constituídos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e DOPC:DPPS 10% (razão molar). O principal efeito causado pela AnxA5 na morfologia das GUVs foi a perda de contraste óptico devido a formação de poros nas membranas das vesículas. Neste caso, a presença de DPPS não proporcionou mudanças significativas para a incorporação da AnxA5. TNAP quando inserida em GUVs provocou intensa flutuação e excesso de área das vesículas com formação de filamentos. A presença do DPPS provavelmente dificulta a inserção da TNAP à membrana das GUVs. Quando há microdomínios lipídicos heterogêneos na composição de GUVs compostas por DOPC:Colesterol:Esfingomielina (8:1:1) e DOPC:Colesterol:Esfingomielina:Gangliosídeo (7:1:1:1) (razão molar), a inserção da TNAP provocou uma maior segregação lateral de fase evidenciada por imagens com fluorescência. A presença da TNAP e AnxA5 em DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos proporcionou mudanças significativas nas propriedades mecânicas visco-elásticas dos proteolipossomos detectadas por imagens de Microscopia de Força Atômica. Assim, no presente trabalho foi possível obter uma inédita metodologia para a formação de proteolipossomos contendo TNAP e AnxA5 concomitantemente, os quais apresentaram uma reconstituição funcional das proteínas, apresentando capacidade de captar Ca2+ para dentro das vesículas e habilidade de hidrolisar fosfosubstratos em sua superfície. / Bone biomineralization is a multifactorial and complex process, being a challenge for the science the understanding of their regulatory mechanisms. This process is mediated by the release of matrix vesicles (MVs), structures which arise by budding from osteoblast and chondroblast surface and are secreted in the specific site where biomineralization begins. MVs have the ability of accumulating high concentrations of Ca2+ and Pi ions, providing an adequate microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. Two protein families present in MVs merit special attention: Annexins and Phosphatases. The annexins were the most abundant proteins detected in MVs and are responsible for the Ca2+-channels formation (especially AnxA5). Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) exhibits phosphomonohydrolytic activity, producing Pi mainly from PPi and ATP. Such proteins regulate the formation of calcium phosphate crystals, acting directly in the bone mineralization process. The goal of this project was to produce and characterize proteoliposomes with different lipid compositions of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS) harboring TNAP and AnxA5, keeping the functions of both proteins after their incorporation into the mimetic systems. AnxA5 was able to incorporate into DPPC-proteoliposomes (11.64 µg/mL), but the presence of DPPS increased significantly the AnxA5 incorporation (25.79 µg/mL) into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes. The presence of both proteins into DPPC and DPPC:DPPS 5, 10 and 15% (molar ratios) proteoliposomes was confirmed by SDS-PAGE and Immunoblotting analysis. Better yield of TNAP and AnxA5 incorporation was observed when both proteins were reconstituted simultaneously. DPPC-proteoliposomes and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) incorporated about 75% of AnxA5 and 25% of TNAP (protein concentration). DPPS presence did not affect significantly the yield of incorporation of both proteins. The kinetic parameters for the hydrolysis of different physiological substrates (ATP, ADP and PPi) by TNAP were determined in the presence and absence of AnxA5, at physiological pH, for the different systems. The best catalytic efficiencies were achieved with proteoliposomes containing DPPS 10% (molar ratio) (kcat/K0.5= 183.02; 776.06 and 657.08 M-1.s-1 for ATP, ADP and PPi, respectively), condition that also favored PPi hydrolysis by TNAP when compared to ATP and ADP hydrolysis. Studies by Differential Scanning Calorimetry (DSC) showed that the increasing DPPS concentrations in the DPPC-liposomes resulted in a progressive broadening of the phase transition peaks and decreased t1/2 and H values. The pre-transition was detected only in concentrations up to DPPS 15% in DPPC. Phase lateral segregation can be observed for DPPS 20% and above, suggesting the formation of DPPS-rich microdomains. The interaction of AnxA5 with DPPC and DPPC:DPPS 10%-liposomes resulted in a decrease of H values (from 8.73 to 5.68 and from 8.43 to 5.37 Kcal.mol-1, respectively). When TNAP was present in the proteoliposomes, this effect was even greater. AnxA5 incorporated into DPPC and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) was able to mediate 45Ca2+-influx (~ 800 nmol Ca2+) into the vesicles at physiological Ca2+-concentrations (~ 2 mM), and this process was not affected by the presence of TNAP in the systems. However, AnxA5 affected significantly the hydrolysis of substrates by TNAP. Studies with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) also confirmed the functional reconstitution of AnxA5 in dioleoylphosphocholine (DOPC) and DOPC:DPPS 10% (molar ratio) vesicles. The main effect caused by AnxA5 in the GUVs morphology was the formation of pores in the vesicles membrane. In this case, DPPS presence did not affect the AnxA5 incorporation. The presence of TNAP in GUVs caused a several fluctuation, indicating that the vesicles acquired an excess of area and undergoes sequential budding transitions. It is suggested that the presence of DPPS makes the TNAP insertion into the GUVs membrane difficult. With the presence of heterogeneous lipid microdomains in GUVs composed of DOPC, Cholesterol (Chol), Sphingomyelin (SM) and Ganglioside (GM1) in the proportions DOPC:Chol:SM 8:1:1 and DOPC:Chol:SM:GM1 7:1:1:1 (molar ratios), the TNAP insertion caused a greater phase lateral segregation, evidenced by fluorescence analysis. Atomic Force Microscopy (AFM) analysis indicated that the presence of both proteins into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) caused significant changes in the visco-elastic mechanical properties of the vesicles. In conclusion, the present work describes the synthesis of proteoliposomes harboring TNAP and AnxA5 concomitantly, with the functional reconstitution of both proteins, with the ability to transport Ca2+ into the vesicles and hydrolyze phosphosubstrates on their surface.