Sphingolipide (SPL) sind wichtige und ubiquitar verbreitete Bestandteile von Biomembranen. Aufgrund der enormen Vielfalt, der komplexen Struktur und diverser physiko-chemischer Eigenschaften der Sphingolipide gestaltet sich die qualitative und quantitative Untersuchung der Sphingolipide allerdings schwierig. In dieser Arbeit konnten, basierend auf publizierten Methoden, analytische Verfahren entwickelt werden, mit deren Hilfe sich die Gehalte spezifischer Sphingolipide in A. thaliana quantitativ nachweisen lassen. Unter Einsatz eines targeted metabolite profiling-Ansatzes wurde die Rolle spezifischer Sphingolipide in der Pflanzen-Pathogen Interaktion charakterisiert. Infiltration von avirulenten P. syringae pv. tomato (Pst) in Blätter von A. thaliana führte zu schnell und transient erhöhten Gehalten der freien Sphingobase Phytosphingosin (t18:0). Im Gegensatz zu avirulenten Pst kam es nach Infiltration von virulenten Pst zu einer schnellen Rückkehr auf Basalniveau und nicht zu einer hypersensitiven Antwort (HR), was auf eine positiv regulatorische Rolle von t18:0 in Abwehrreaktionen von Pflanzen hinwies, z.B. bei der HR. Damit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Spiegel freier Sphingobasen der Pflanze, insbesondere von t18:0, in Antwort auf bakterielle Pathogene reguliert werden. Diese spezifische Regulation korreliert, in Abhängigkeit von der Pathogeninfektion, mit dem Verlauf der HR. Im Unterschied zu avirulenten Stämmen sind virulente Pst in der Lage, Abwehrreaktionen des Wirtsorganismus zu unterdrücken. Daher tritt keine HR auf, welche die Ausbreitung des Pathogens stoppen könnte. Die unterschiedliche Beeinflussung der t18:0 Gehalte virulenter und avirulenter Stämme zeigte sich auch in Experimenten mit einem anderen P. syringae Stamm. Freie Sphingobasen zeigten in dieser Arbeit typische Merkmale von Signalmolekulen: geringe basale Spiegel, schnelle und transiente Gehaltsanderungen, präzise Regulation sowie spezifische Wirkeffekte. Sphingolipide stellen somit, neben den etwa durch PAMPs ausgelösten und durch Phytohormone vermittelten, weitere Signalwege in der Pflanzen Pathogen Interaktion dar. Die Infiltration von Pst in Blätter der A. thaliana Mutante sbh1-1 führte zu transient erhöhten d18:0 Spiegeln. In dieser Mutante ist die Funktion von einer der zwei Sphingobasen-Hydroxylasen gestört. Wie sich nach Totalhydrolyse zeigte, sind die Gesamtgehalte von t18:0 in der Mutante allerdings nicht reduziert. Dies spricht dafür, dass der pathogenabhängige transiente Anstieg von t18:0 durch de novo Synthese aus d18:0 entsteht und nicht durch Freisetzung aus komplexen Sphingolipiden mittels spezifischer Lipasen. Somit ist die Hydroxylase SBH1 für den schnellen signalvermittelten Anstieg von t18:0 verantwortlich. Neben t18:0 lösen auch strukturell ähnliche freie Sphingobasen, z.B. d18:1 und d18:0, Abwehrreaktionen und Zelltod aus, während andere Sphingobasen (d20:0 und d20:1) sowie Ceramide keine Reaktionen auslösten. Dies weist auch direkt auf die Spezifität der beteiligten Mechanismen hin. / Sphingolipids (SPL) are important and ubiquitously distributed constituents of biological membranes. Due to the tremendous variety, complex structure and diverse physicochemical properties of sphingolipids, qualitative and quantitative analysis has only recently been possible due to newly developed methods in mass spectrometry and chromatography. In this work, analytical methods to quantitatively detect the SPL content in A. thaliana leaves were established based on published literature. Using a targeted metabolic profiling approach, the role of specific SPL in the plant‐pathogen interaction was characterized. In line with the production of reactive oxygen species (ROS), a hallmark of biotic stress, infiltration of the avirulent form of the phytopathogen P. syringae pv. tomato (Pst) led to a fast and transient increase of the free long chain base Phytosphingosine (t18:0). Virulent Pst showed also a fast and transient, but clearly less prolonged elevation of t18:0 levels. Also, no HR was elicited in response to the infiltration, pointing to a positive regulatory role of t18:0 in this plant defense response. This work shows, for the first time, that SPL, namely t18:0, were regulated in response to bacterial pathogens. The t18:0 kinetics showed a strong correlation with the course of the pathogen‐elicited HR. There was also evidence, that virulent Pst influences the plants own biosynthetic and regulatory mechanisms to inhibit the SPL mediated defense response. This was also the case with another tested Pseudomonas syringae strain. In this work, free long chain bases showed characteristics typical for signaling molecules: low basal levels, a fast and transient increase in response to pathogens and a tight regulation. Hence, SPL may represent members of signaling pathways in plant‐pathogen interactions in addition to or besides PAMP‐triggered and hormonal mediated signaling pathways. Infiltration of Pst into leaves of the A. thaliana hydroxylase mutant sbh1-1 led to transiently increased d18:0 levels in leaves. In this mutant, one of the two functional sphingobase hydroxylases of A. thaliana is impaired. As the total pool of t18:0 was not significantly reduced in the mutant after total hydrolysis, we argue that the pathogen‐dependent transient increase of t18:0 was due to de novo synthesis from d18:0 and not to the action of specific lipases. Furthermore SBH1 was responsible for the fast increase of t18:0 levels. In addition to t18:0, also other free long chain bases, e.g. d18:0, elicited plant reactions and cell death, whereas other long chain bases (d20:0 and d20:1) or ceramides elicited no response. Apparently, the specific lipid structure plays a major role for the efficiency in different signaling pathways.

<p>&nbsp;Bakteriozno su&scaron;enje tre&scaron;nje (Prunus avium L.) poslednjih nekoliko godina u mladim zasadima i plantažama tre&scaron;nje predstavlja značajan problem u proizvodnji ove voćne vrste. Simptomi bolesti se ispoljavaju u vidu su&scaron;enja grana, grančica ili celih stabala, &scaron;to se uglavnom zapaža na mestima rezidbe i oko pupoljaka, sa uočljivim promena boje tkiva kore, koje puca i nastaju rak rane. U periodu od 2012 &ndash; 2015 godine izvr&scaron;en je monitoring zdravstvenog stanja tre&scaron;nje kojim je obuhvaćeno nekoliko plantaža i manjih zasada tre&scaron;nje iz vi&scaron;e lokaliteta na području AP Vojvodine i centralne Srbije (Ritopek). Mlade voćke su očigledno najugroženije, jer smo na osnovu praćenja zdravstvenog stanja u vi&scaron;e lokaliteta i zasadima različite starosti, pojavu bakterioznog su&scaron;enja u jačem ili slabijem intenzitetu, konstatovali samo u mladim zasadima (do 3 godine starosti &ndash; Selenča, Gornji Tavankut, Donji Tavankut, Ljutovo, Mikićevo i Kanjiža). Izolacijama na strandardne hranljive podloge, iz prikupljenih obolelih uzoraka tre&scaron;nje, kao i sa zdravih pupoljaka i listova tre&scaron;nje (epifitna populacija), dobijeni su brojni izolati bakterija P. syringae pvs. od kojih je za dalja ispitivanja odabrano 155 izolata. Identifikikacija dobijenih izolata je izvr&scaron;ena je na osnovu fenotipskih i genotipskih metoda. Na osnovu LOPAT testova izolati pripadaju Ia grupi fluorescentnih vrsta Pseudomonas syringae. Prema GATTa testovima utvrđene su dve grupe izolata u okviru vrste P. syringae: I grupa (G+A+T&ndash;Ta&ndash;) i II grupa (G&ndash;A&ndash;T+Ta+). Dodatni testovi su potvrdili GATTa testove, na osnovu kojih je zaključeno da su&scaron;enje mladih stabala tre&scaron;nje prouzrokuju dve grupe bakterije P. s. pv. syringae (I grupa) i P. s. pv. morsprunorum rasa 1 (II grupa). Među ispitivanim izolatima nije bilo odstupanja u pogledu fenotipskih karakteristika u okviru iste grupe, osim sposobnosti stvaranja siringomicina pojedinih izolata I grupe (pv. syringae). Proverom patogenosti na raznim test biljkama i biljci domaćinu utvrđene su razlike, ali i određene sličnosti između izolata I i II grupe. Jasne razlike između grupa izolata utvrđene su pri inokulaciji zelenih plodova tre&scaron;nje, vi&scaron;nje, ringlova i kru&scaron;ke, paradajza, paprike i mahuna boranije. Pri inokulaciji odvojenih listova jorgovana izolati I grupe (pv. syringae), kao i većina izolata II grupe (pv. morsprunorum rasa 1) su pozitivno reagovali, &scaron;to ukazuje na heterogenost populacije bakterije P. s. pv. morsprunorum rasa 1. Pri inokulaciji sejanaca voćnih podloga (divlja tre&scaron;nja, magriva, divlja &scaron;ljiva, divlja kru&scaron;ka) svi izolati pv. syringae su prouzrokovali karakteristične patolo&scaron;ke promene na podlogama svih voćnih vrsta, a izolati pv. morsprunorum rase 1 takođe na svim vrstama, osim na sejancima divlje &scaron;ljive. Ovi rezultati ukazuju da je &scaron;irenje bakterija moguće i putem podloga koje takođe mogu biti zaražene. Inokulacijama dvogodi&scaron;njih grančica tre&scaron;nje u periodu mirovanja zaključeno je da su svi izolati pv. syringae i morprunorum rasa 1 podjednako patogeni na svim sortama tre&scaron;nje (Burlat, Summit, Hedelfigenska i Germerzdorfska). Najveća dužina nekroze najče&scaron;će je zabeležena na sortama Burlat i Summit u kombinaciji sa izolatima I grupe (pv. syringae) u pojedinim slučajevima i sa izolatima II grupe (pv. morsprunorum rasa 1), a najmanja uglavnom kod sorti Germerzdorfska i Hedelfigenska sa izolatima II grupe (pv. morsprunorum rasa 1). Identifikacija izolata KBNS71 &ndash; 84 (Gornji Tavankut) i KBNS85 &ndash; 94 (Selenča) na bazi MLST kori&scaron;ćenjem gena gyrB, rpoD, gapA i gltA, jasno je pokazala prisustvo dva patovara P. s. pv. syringae i P. s. pv. morsprunorum rasa 1. Pri poređenju sa sojevima H &ndash; 1, V &ndash; 85, V &ndash; 88 (vi&scaron;nja) i V &ndash; 109 (tre&scaron;nja) utvrđene su značajne razlike i postojanje genetskog diverziteta populacije ovih patogena. Simultana detekcija gena syrB i syrD utvrđena je kod 70 izolata I grupe (pv. syringae), a samo SyrB kod 9 izolata iste grupe (pv. syringae). Gen za sintezu koronatina detektovan je kod svih 76 izolata II grupe (pv. morsprunorum rasa 1). Rep &ndash; PCR metodom ustanovljene su značajne razlike (58%) između I i II grupe izolata (pv. syringae i pv. morsprunorum rasa 1). Ispitivani izolati sa tre&scaron;nje u okviru pv. syringae nisu ispoljili međusobne razlike, ali se razlikuju od sojeva sa drugih lokaliteta i ranije izolovanih sa istog domaćina (V &ndash; 109 i T6), kao i od sojeva sa drugih domaćina &ndash; vi&scaron;nje (V &ndash; 85) i uljane tikve (Tk21) do 37%. Razlike među izolatima pv. morsprunorum rase 1 iznosile su manje od 5%, a 24% u odnosu na soj CFBP2119 istog patogenog varijeteta. Rep &ndash; PCR analiza ukazala je na nizak nivo heterogenosti ispitivanih izolata u okviru istog patogenog varijeteta. RAPD metoda, kori&scaron;ćenjem većeg broja prajmera, bila je uspe&scaron;nija za poređenje ispitivanih izolata od rep &ndash; PCR. Od testiranih 11 prajmera, 4 (SPH1, DJP17, DJ15, DJ16) su selektovana za dalji rad na osnovu razlika među izolatima unutar patogenih varijeteta. Kumulativna RAPD analiza pokazala je da između ispitivanih izolata pv. syringae postoje razlike do 24%, a 41% u poređenju sa sojem KFB0103, dok su kod izolata pv. morsprunorum rase 1 razlike iznosile do 15%, a 36% u odnosu na soj</p><p>4<br />CFBP2119. Dobijeni rezultati RAPD analize ukazuju da u okviru populacije obe grupe ispitivanih izolata postoji određena heterogenost, ali je genetski diverzitet izraženiji kod pv. syringae. Proučavanjem epidemilogije ovih patogena u poljskim uslovima inokulacijom jednogodi&scaron;njih grana / mladara sortama Burlat, Germerzdorfska, Hedelfigenska i Droganova žuta, zaključeno je da tre&scaron;nja u na&scaron;im agroekolo&scaron;kim uslovima ranije postaje osetljiva (oktobar) prema P. s. pv. morsprunorum rasa 1 u odnosu na pv. syringae. Prvi pozitivni rezultati pri inokulaciji sojevima pv. syringae utvrđeni su pri inokulaciji u novembru. U pogledu dužine nekroze najuspe&scaron;nije su bile novembarske inokulacije (najduže nekroze; 2,17 &ndash; 3,35 cm), uspe&scaron;ne su bile i januarske i martovske inokulacije, ali je dužina nekroze bila sve manja, respektivno. Generalno najduže nekroze su ostvarene kod sorte Burlat, a najkraće kod sorte Germerzdorfska. Sve inokulacije urađene u periodu vegetacije su bile negativne. Inokulacijama dvo &ndash; trogodi&scaron;njih grana na sorti Summit prve uspe&scaron;ne inokulacije (oba patovara) su ostvarene tek u novembru (oktobarske su bile negativne), kada je utvrđena i veća agresivnost patovara syringae. Pri inokulacijama u januaru dužina nekroze je bila manja, a martovska je bila negativna. Sve inokulacije vr&scaron;ene u periodu od bubrenja pupoljaka do opadanja li&scaron;ća takođe su bile negativne. Ispitivanjem osetljivosti sotrimenta tre&scaron;nje i pojedinih sorti vi&scaron;nje zaključeno je da su prema oba patovara (syringae i morsprunorum rasa 1) najosetljivije sorte tre&scaron;nje Katalin, Linda, Summit, New Star i Burlat, srednje osetljive su sorte vi&scaron;nje Erdi Botermo i sorte tre&scaron;nje Droganova žuta, CarmCarmen, Germerzdorfska i Rana od Noara, a slabo osetljive sorte vi&scaron;nje &Scaron;panska i Ujfeheti firto&scaron; i sorta tre&scaron;nje Rita.</p> / <p>Bacterial die back (canker) of sweet cherry (Prunus avium L.) in young orchards and sweet cherry plantations in the past few years has been a significant problem in the production of this fruit species. Symptoms of the disease were manifested in the form of drying branches, twigs or whole trees, which were mainly observed in places of pruning or around the buds, bark changes a color, cracks and cankers has formed. In the period 2012 - 2015 monitoring of the health status of sweet cherries was carried out covering several plantations and smaller orchards of sweet cherries in several localities in Vojvodina and central Serbia (Ritopek). Young fruit trees are obviously the most susceptible, based on monitoring of the health status in many localities and plantations of different ages, the occurrence of bacterial canker in a stronger or weaker intensity was found only in young plantations (up to 3 years old - Selenča, Gornji Tavankut, Donji Tavankut, Ljutovo, Mikićevo and Kanjiža). From collected diseased samples of sweet cherries, as well as healthy buds and leaves of sweet cherry (epiphytic population) isolations on standard nutrient medium, were obtained numerous isolates of P. syringae pvs. and for further investigations was selected 155 isolates. Identification of isolates was performed on the basis of phenotypic and genotypic methods. Based on LOPAT tests isolates belonging to Ia group fluorescent Pseudomonas syringae. According to GATTa tests two groups of P. syringae isolates were identified, I group (G+A+T-Ta-) and II group (G-A-T+Ta+). Additional tests confirmed the GATT tests, on the basis which it was concluded that the drying of young sweet cherry trees caused P. s. pv. syringae (I group) and P. s. pv. morsprunorum race 1 (II group). Among the tested isolates was not exceptions in phenotypic characteristics within the same group, except for the ability to produced syringomycine for some isolates of I groups (pv. syringae). In pathogenicity tests on various plants and host plant were observed differences, but also and some certain similarity between isolates of I and II groups. Clear differences between the groups of isolates were determined in the inoculations of green fruit of sweet cherry, sour cherry, cherry plum and pears, tomatoes, peppers and green bean pods. In the case of inoculation of separate lilac leaves isolates of I group (pv. syringae) and most isolates of II group (pv. morsprunorum race 1) reactions were positive, what indicating the heterogeneity of the population of P. s. pv. morsprunorum race 1. In the inoculation of fruit rootstock seedlings (wild cherry, Magriva, wild plum, wild pear) all isolates pv. syringae caused the characteristic pathological changes on the all fruit species, isolates of pv. morsprunorum race 1 also except on the seedlings of wild plum. These results suggest that the spreading of bacteria is possibly through the rootstock that can also be infected. Inoculations of two &ndash; years old branches of sweet cherry during dormancy, was concluded that all isolates pv. syringae and morprunorum race 1 were equally pathogenic in all sweet cherry cultivars (Burlat, Summit, Hedelfigen and Germersdorf). The longest length of necrosis usually was observed on the cultivars Burlat and Summit in combination with isolates of I groups (pv. syringae), in some cases with isolates of II group (pv. morsprunorum race 1), and the lowest mainly in cultivars Germersdorf and Hedelfigen with isolates of II group (pv. morsprunorum race 1). Identification of isolates KBNS71 - 84 (GornjiTavankut) and KBNS85 - 94 (Selenča) based on MLST using genes gyrB, rpoD, gapA and gltA genes clearly showed the presence of two patovars P. s. pv. syringae and P. s. pv. morsprunorum race 1. Comparison with strains H - 1, V - 85 V - 88 (sour cherry) and V - 109 (sweet cherry) showed significant differences and the existence of genetic diversity in the population of these pathogens. Simultaneous detection of syrB and syrD gene was found in 70 isolates of I group (pv. syringae) and only syrB gene in 9 isolates of the same group (pv. syringae). The gene for coronatine synthesis was detected in all 76 isolates of II group (pv. morsprunorum race 1). Rep - PCR method detected significant differences (58%) between isolates of I and II groups (pv. syringae and pv. morsprunorum race 1). The tested isolates from sweet cherry within pv. syringae did not show differences between them, but they were different from the strains from other locations and previously isolated from the same host (V - 109 and T6), as well as strains from other hosts - cherry (V - 85) and pumpkin (Tk21) to 37 %. The differences between isolates pv. morsprunorum race 1 were less than 5% and 24% compared to the same pathovar strain CFBP2119. Rep - PCR analysis indicated a low level of heterogeneity of isolates within the same pathovar. RAPD method using a large number of primers were more successful to compare isolates than rep - PCR. Among 11 tested primers, 4 (SPH1, DJP17, DJ15, DJ16) were selected for further work on the basis of the difference between isolates within same pathovar. Cumulative RAPD analysis showed up to 24% differences among tested isolates of pv. syringae and 41% compared to the strain KFB0103, while among isolates pv. morsprunorum race 1 differences were 15% and 36% compared to the strain CFBP2119. The results of RAPD analysis indicate that a certain heterogeneity<br />7<br />exists in the population of both tested groups of isolates, but genetic diversity is more pronounced among isolates of pv. syringae. Studying the epidemiology of this pathogen in field conditions, by inoculating one &ndash; year old branches / or shoots sweet cherry cultivars Burlat, Germersdorf, Hedelfigen and Droganova žuta, it was concluded that the sweet cherry in our agroecological conditions becoming sensitive (October) to P. s. pv. morsprunorum race 1 before in relation to the pv. syringae. The first positive results of inoculations with strains pv. syringae were determined in November. Regarding the length of necrosis most successful were inoculation in the November (necrosis longest; 2.17 to 3.35 cm), inoculations also were successful in the January and the March, but the length of necrosis was smaller, respectively. Generally longest necrosis were observed in the cultivar Burlat, and the shortest in cultivar Germersdorf. All inoculations carried out in the period of vegetation were negative. Inoculations of two &ndash; three &ndash; years old branches of the cultivar Summit, first successful inoculations (for both pathovar) were observed only in November (October was negative), when a greater aggressiveness of pathovar syringae were determined. In inoculations in January length of necrosis was smaller, and in March was negative. All inoculations carried out in the period from buds swelling to leaf falling were also negative. Investigation susceptibility of sweet cherry and some sour cherry cultivars was concluded that against to both pathovars (syringae and morsprunorum race 1) the most susceptible were cultivars of sweet cherry Katalin, Linda, Summit, New Star and Burlat, medium susceptible were cultivar of sour cherry Erdi Botermo and sweet cherry cultivars Droganova žuta, Carmen, Germersdorf and Rana od Noara and low susceptible cultivars of sour cherry &Scaron;panska and Ujfeheti firto&scaron; and cultivar of sweet cherry Rita.</p>

Sphingobasen bilden das Grundgerüst und die Ausgangsbausteine für die Biosynthese von Sphingolipiden. Während komplexere Sphingolipide einen wichtigen Bestandteil von eukaryotischen Membranen bilden, sind Sphingobasen, die auch als long-chain bases (LCBs) bezeichnet werden, als Signalmoleküle bei zellulären Prozessen in Eukaryoten bekannt. Im tierischen System wurden antagonistische Effekte von nicht-phosphorylierten Sphingobasen (LCBs) und ihren phosphorylierten Gegenstücken (LCB-Ps) bei vielen Zellfunktionen, insbesondere der Apoptose, nachgewiesen und die zugrundeliegenden Signalwege umfassend aufgeklärt. Im Gegensatz dazu sind in Pflanzen weniger Belege für einen antagonistischen Effekt und mögliche Signaltransduktionsmechanismen bekannt. Für eine regulatorische Funktion von Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen existieren mehrere Hinweise: (I) Mutationen in Genen, die den Sphingobasen-Metabolismus betreffen, führen zum Teil zu spontanem PCD und veränderten Zelltodreaktionen. (II) Die Gehalte von LCBs sind bei verschiedenen Zelltod-auslösenden Bedingungen erhöht. (III) Nekrotrophe Pathogene produzieren Toxine, wie Fumonisin B1 (FB1), die mit dem Sphingolipid-Metabolismus der Wirtspflanze interferieren, was wiederum die Ursache für den dadurch ausgelösten PCD darstellt. (IV) Die Behandlung von Pflanzen mit LCBs, nicht aber mit LCB-Ps, führt zu Zelltod. In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion untersucht, wobei der Fokus auf der Überprüfung der Hypothese eines antagonistischen, Zelltod-hemmenden Effekts von LCB-Ps lag. Anhand von Leitfähigkeit-basierten Messungen bei Blattscheiben von Arabidopsis thaliana wurde der durch Behandlung mit LCBs und separater oder gleichzeitiger Zugabe von LCB-Ps auftretende Zelltod bestimmt. Mit dieser Art der Quantifizierung wurde der an anderer Stelle publizierte inhibierende Effekt von LCB-Ps auf den LCB-induzierten Zelltod nachgewiesen. Durch parallele Messung der Spiegel der applizierten Sphingobasen im Gewebe mittels HPLC-MS/MS konnte dieser Antagonismus allerdings auf eine reduzierte Aufnahme der LCB bei Anwesenheit der LCB-P zurückgeführt werden, was auch durch eine zeitlich getrennte Behandlung mit den Sphingobasen bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer exogenen Zugabe von LCBs und LCB-Ps auf den durch Pseudomonas syringae induzierten Zelltod von A. thaliana untersucht. Für LCB-Ps wurde dabei kein Zelltod-hemmender Effekt beobachtet, ebenso wenig wie ein Einfluss von LCB-Ps auf den PCD, der durch rekombinante Expression und Erkennung eines Avirulenzproteins in Arabidopsis ausgelöst wurde. Für LCBs wurde dagegen eine direkte antibakterielle Wirkung im Zuge der Experimente mit P. syringae gezeigt, die den in einer anderen Publikation beschriebenen inhibierenden Effekt von LCBs auf den Pathogen-induzierten Zelltod in Pflanzen relativiert. In weiteren Ansätzen wurden Arabidopsis-Mutanten von Enzymen des Sphingobasen-Metabolismus (LCB-Kinase, LCB-P-Phosphatase, LCB-P-Lyase) hinsichtlich veränderter in-situ-Spiegel von LCBs/LCB-Ps funktionell charakterisiert. Der Phänotyp der Mutanten gegenüber Fumonisin B1 wurde zum einen anhand eines Wachstumstests mit Keimlingen und zum anderen anhand des Zelltods von Blattscheiben bestimmt und die dabei akkumulierenden Sphingobasen quantifiziert. Die Sensitivität der verschiedenen Linien gegenüber FB1 korrelierte eng mit den Spiegeln der LCBs, während hohe Gehalte von LCB-Ps alleine nicht in der Lage waren den Zelltod zu verringern. In einzelnen Mutanten konnte sogar eine Korrelation von stark erhöhten LCB-P-Spiegeln mit einer besonderen Sensitivität gegenüber FB1 festgestellt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die Hypothese eines antagonistischen Effekts von phosphorylierten Sphingobasen beim pflanzlichen Zelltod in Frage. Stattdessen konnte in detaillierten Analysen der Sphingobasen-Spiegel die positive Korrelation der Gehalte von LCBs mit dem Zelltod gezeigt werden. Die hier durchgeführten Experimente liefern damit nicht nur weitere Belege für die Zelltod-fördernde Wirkung von nicht-phosphorylierten Sphingobasen, sondern tragen zum Verständnis der Sphingobasen-Homöostase und des Sphingobasen-induzierten PCD in Pflanzen bei. / Sphingobases are the building blocks for the biosynthesis of sphingolipids. While complex sphingolipids form a major part of eukaryotic membranes, sphingobases, which are also called long-chain bases (LCBs), are well-known signaling molecules of cellular processes in eukaryotes. In the animal system, antagonistic effects of nonphosphorylated sphingobases (LCBs) and their phosphorylated counterparts (LCB-Ps) have been reported in many cell functions, with a particular focus on apoptosis, and the underlying signaling pathways have been elucidated in detail. In contrast, few records of an antagonistic effect and the potential signal transduction mechanisms have been established in plants. Several lines of evidence point to a regulatory function of sphingobases in plant programmed cell death (PCD): (i) Mutations in genes related to sphingobase metabolism may cause spontaneous PCD and altered cell death reactions. (ii) Levels of LCBs are increased under different cell death conditions. (iii) Necrotrophic pathogens produce toxins, like fumonisin B1 (FB1), interfering with sphingolipid metabolism of the host plant and, thus, causing PCD. (iv) Treatment of plants with LCBs, but not LCB-Ps, induces cell death. In the present study the role of sphingobases in plant cell death reactions, with a focus on the examination of the hypothesis of an antagonistic cell death-inhibitory effect of LCB-Ps, has been investigated. Using conductivity-based measurements of Arabidopsis thaliana leaf discs, cell death induced by treatment with LCBs and separated or combined feeding of LCB-Ps was determined. That kind of quantification allowed the verification of an inhibitory effect of LCB-Ps on LCB-induced cell death, which was published elsewhere. However, by simultaneous measurement of the applied sphingobase levels in the tissue with HPLC-MS/MS, this antagonism could be explained by a reduced uptake of the LCB in the presence of the LCB-P, which was also confirmed by a separated treatment with the sphingobases. In addition to that an impact of exogenous applied LCBs and LCB-Ps on cell death in A. thaliana induced by Pseudomonas syringae has been investigated. For LCB-Ps no cell death inhibitory effect was observed. Similarly, there was no impact for LCB-Ps on the cell death induced by recombinant expression of an avirulence protein in Arabidopsis. For LCBs, a direct antibacterial effect against P. syringae was shown in this work. This puts previous findings of an inhibitory effect of LCBs on pathogen-induced cell death in plants into a new perspective. In further approaches, Arabidopsis mutants of enzymes of the sphingobase metabolism (LCB kinase, LCB-P phosphatase, LCB-P lyase) were functionally characterized with regard to altered in situ levels of LCBs/LCB-Ps. The phenotype of the mutants in response to fumonisin B1 was determined in a growth assay with seedlings, and by cell death measurements in leaf discs, which were accompanied by quantification of sphingobase levels. The sensitivity of different lines to FB1 was closely correlated with the levels of LCBs, while high contents of LCB-Ps alone were not able to reduce cell death. Some mutants even showed a correlation of highly enhanced LCB-P levels with a pronounced sensitivity to FB1. The results of the present study challenge the hypothesis of an antagonistic effect of phosphorylated sphingobases on plant cell death. Instead, a detailed analysis of sphingobase levels revealed a positive correlation of LCB contents with cell death. The conducted experiments not only provide further evidence for a cell death-promoting effect of nonphosphorylated sphingobases, but also contribute to the comprehension of sphingobase homeostasis, as well as of the sphingobase-induced PCD in plants.

Die Multigenfamilie der Lipid Transfer Proteine (LTP) stellt eine Gruppe von kleinen Proteinen dar, welche in allen höheren Landpflanzen vorkommen. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana werden 92 Proteine zur Klasse der LTPs gezählt. Die Benennung der Proteinfamilie basiert auf dem beobachteten in vitro Transfer von Lipiden zwischen zwei Membranen. Alle LTPs weisen ein konserviertes, 8 Cysteine beinhaltendes Motiv und eine hydrophobe Tasche auf, welche für die Bindung hydrophober Moleküle verantwortlich ist. Aufgrund ihrer Signalsequenz werden LTPs über den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum geschleust. Für einige pflanzliche LTPs konnte eine derartige Sekretion bereits nachgewiesen werden. Für andere LTPs wird eine Funktion in der Kutinbildung, der Embryogenese oder der pflanzlichen Immunantwort gegen Phytopathogene postuliert. Letzteres wurde für DIR1 (DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1) und AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1) nachgewiesen, während von LTPIV.4 (At4g55450) nur bekannt ist, dass die Expression spezifisch in Antwort auf Pathogene induziert ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Funktion von LTPIV.4 und AZI1 in Bezug auf die pflanzliche Pathogenantwort in Arabidopsis thaliana untersucht. Anhand von GFP-Fusionsproteinen konnte für LTPIV.4 und AZI1 eine Endoplasmatische Retikulum-Lokalisierung detektiert werden. Auch eine gewebespezifische Promotoraktivität von LTPIV.4 an den Leitgeweben und in jungen sich entwickelnden Blättern konnte identifiziert werden. Diese Erkenntnisse lassen darauf schließen, dass LTPIV.4 möglicherweise an der Signaltransduktion am/im Leitgewebe mitverantwortlich ist. Im Fokus dieser Arbeit stand die spezifische Einordnung von LTPIV.4 in der Ausbildung der lokalen bzw. systemischen Immunantwort von Arabidopsis thaliana. Anhand einer Infektion von Wildtyppflanzen und LTPIV.4 Mutanten mit zwei verschiedenen Pseudomonasstämmen konnte eine LTPIV.4-abhängige Steigerung der pflanzlichen Resistenz gegen die biotrophen Bakterien nachgewiesen werden. In der Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia hingegen zeigte sich keine LTPIV.4 Abhängigkeit. Da die Hormone Salicylsäure (SA) und Jasmonsäure (JA) in der Ausbildung der pflanzlichen Abwehr gegen verschiedene Pathogene wichtig sind, wurden die Hormonlevel von SA und JA in ltpIV.4, 35S::LTPIV.4 sowie in Wildtyppflanzen analysiert. Die untersuchten Phytohormongehalte zeigten eine LTPIV.4 unabhängige, schnelle Akkumulation von SA nach der Infektion mit virulenten (vir) Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm) und eine spätere Erhöhung der JA-Gehalte. Es konnte somit kein regulatorischer Effekt von LTPIV.4 auf die SA- sowie die JA-Gehalte detektiert werden. Die Expression von SAG13 (SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 13) und OXI1 (OXIDATIVE SIGNAL-INDUCIBLE 1), welche eine Funktion im programmierten Zelltod (PCD) haben beziehungsweise durch oxidativen Stress induziert werden, war hingegen erhöht in konstitutiv LTPIV.4 exprimierenden Pflanzen, verglichen mit dem Wildtyp von LTPIV.4. Als ein weiterer Ansatzpunkt für die funktionelle Charakterisierung von LTPIV.4 wurde die in vitro Identifizierung möglicher Substrate mittels Lipid-Protein-Interaktionsanalysen, sowie einer unspezifischen Metabolomanalyse herangezogen. Bei den Interaktionsanalysen konnten Phosphatidsäuren (PA), Phosphatidylglycerine (PG), Monogalactosyldiacylglycerole (MGDG) und auch Digalactosyldiacylglycerole (DGDG) als Interaktionspartner von LTPIV.4 identifiziert werden. Die Metabolomanalyse zeigte einen quantitativen Unterschied zwischen Wildtyp/35S::LTPIV.4 und ltpIV.4 bei einigen MGDG, DGDG und PG Spezies. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich somit schließen, dass LTPIV.4 nach Pathogen/Schaden-assoziierte molekulare Muster- (PAMP/ DAMP-) Erkennung, z.B. von Psm, SA-abhängig vermehrt gebildet wird. Da die konstitutive Expression von LTPIV.4 sowohl zu erhöhter OXI1 und SAG13 Expression als auch zu erhöhter Resistenz gegenüber Psm führt, lässt sich ein Modell aufstellen, in dem LTPIV.4 als positiver Regulator des PCD die Pathogenresistenz von Arabidopsis erhöht. Der zugrunde liegende Mechanismus ist unbekannt. Die Bindung von PAs, PGs, MGDGs und DGDGs an LTPIV.4 in vitro könnte darauf hindeuten, dass auch in vivo hydrophobe Moleküle gebunden und möglicherweise transportiert werden und dies ein Teil der Pathogenantwort ist. Es wäre z.B. denkbar, dass eine mögliche Translokation von LTPIV.4 über das ER in das Zytoplasma oder den apoplastischen Raum erfolgt. Dort interagiert LTPIV.4 mit durch ROS gebildeten, oxidierten Lipiden oder DAMPs und löst entweder symplastisch durch eine Interaktion in der Infizierten Zelle oder in intakten Nachbarzellen durch eine weitere Signaltransduktionskaskade den PCD sowie eine erhöhte ROS Bildung aus, oder das LTP interagiert spezifisch mit oxidierten Lipiden oder DAMPs von abgestorbenen Nachbarzellen, und löst eine intrazelluläre Signalkaskade mit Initiierung des PCD sowie erhöhter ROS-Bildung aus. AZI1 wurde als zweites LTP in dieser Arbeit einbezogen. Ausgehend von der Beobachtung, dass die konstitutive Expression von AZI1 die Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogene Botrytis cinerea erhöht, sollte in der vorliegenden Arbeit detailiert untersucht werden, ob AZI1 eine Rolle in der Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogen Sclerotinia sclerotiorum spielt. Die azi1-1 Mutante zeigte hierbei jedoch eine erhöhte Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia sclerotiorum. Da bisher keine Unterschiede in der Genexpression von spezifischen Markergenen in WT und azi1-1 Pflanzen nach Sklerotiniainfektion festgestellt werden konnte und es auch für LTPs bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Kutikulasynthese spielen, wäre eine Hypothese, dass die unterschiedlichen Infektionsphänotypen mit Sclerotinia und Botrytis auf eine strukturelle Veränderung der Kutikulabeschaffenheit zurückzuführen sind. Weiterhin konnte für AZI1 eine mögliche Rolle in der Verwundungsantwort detektiert werden, da sowohl die AZI1 Genexpression, als auch die erhaltenen basal signifikant erhöhten 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA)-Gehalte auf eine negativ regulatorische Rolle von AZI1 in der Verwundungs-abhängigen JA-Signaltransduktion hindeuten. / Functional characterization of two lipid transfer proteins involved in Arabidopsis thaliana pathogen defense response

Copies of author's previously published articles inserted. Bibliography :leaves 65-80 Ice nucleation active (INA) bacteria were detected in a pea field in South Australia. They were identified as strains of Pseudomonas syringae and Pseudomonas flourescens biotype 1. Some chemical agents were tested on the two ice nucleating species, as cryoprotectants.

Graduation date: 1998

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2006. / Title from first page of PDF file. Includes bibliographical references (p. 103-124).

The pathogenicity of plant pathogen Pseudomonas syringae depends on the type III secretion system which translocates effector proteins into host cells. In response, plants have evolved resistance proteins to detect presence of specific effectors and activate defense responses. The constant host surveillance imposes a strong selective pressure on effector proteins to evolve rapidly in order to evade detection. The P. syringae HopZ1 effector has evolved into three allelic forms as a result of diversifying selection. In this thesis, I aimed to investigate how sequence divergence contributes to the distinct allelic specificities of HopZ1. Mutational analysis of HopZ1a identified three amino acid residues that were potentially involved in dampening host defense responses, and two HopZ1a mutants partially lost the ability to trigger defense responses yet did not lose their virulence functions. These results suggested that distinct host targets could be involved in the defense-eliciting activity and virulence function of HopZ1a.

The pathogenicity of plant pathogen Pseudomonas syringae depends on the type III secretion system which translocates effector proteins into host cells. In response, plants have evolved resistance proteins to detect presence of specific effectors and activate defense responses. The constant host surveillance imposes a strong selective pressure on effector proteins to evolve rapidly in order to evade detection. The P. syringae HopZ1 effector has evolved into three allelic forms as a result of diversifying selection. In this thesis, I aimed to investigate how sequence divergence contributes to the distinct allelic specificities of HopZ1. Mutational analysis of HopZ1a identified three amino acid residues that were potentially involved in dampening host defense responses, and two HopZ1a mutants partially lost the ability to trigger defense responses yet did not lose their virulence functions. These results suggested that distinct host targets could be involved in the defense-eliciting activity and virulence function of HopZ1a.

Successful pathogens like Pseudomonas syringae translocate type III effector proteins (T3SE) into host cells. Plant hosts react by specifically recognizing these effectors via R proteins that trigger defense responses. The T3SE family HopZ1 has evolved into three allelic forms as a result of diversifying selection. In this thesis, I investigated how virulence and immune-eliciting functions are determined in HopZ1a and HopZ1b in Arabidopsis. Mutational analysis of HopZ1a identified ten residues important for immune elicitation and at least three are involved in virulence functions. These results suggest that distinct key amino acid residues in HopZ1a mediate the two activities. The closely related HopZ1b T3SE elicits an inconsistent immune response in Arabidopsis. We found that HopZ1b-triggered immune response involves a TIR-type R protein and plastid-derived SA. Together, these results highlight an uncharacterized ETI response to the HopZ1 family of T3SEs.