This thesis describes fundamental biological characteristics of soybean. Main topic of the thesis is finding resistence of twelve soybean varieties to bacterial blight. Virulence of four Pseudomonas syringae pv. glycinea isolates was tested in laboratory conditions to find isolates with the highest virulence, which were then used for testing of selected soybean varieties resistance to this patogen. The highest virulence was found in Šumperk 112 isolate and Žabčice isolate. These isolates were used for testing of soybean varieties resistance. The lowest resistance was found in Moravians variety, low resistance was found in Laurentiana variety and Bru-nensis variety. High resistance was found in Gallec variety and Chinese NM3 variety.

Small RNAs are important regulators for a variety of biological processes, including leaf development, flowering-time, embryogenesis and defense responses. Most ancient miRNAs are conserved among different plant species and well characterized, while young MIRNA genes are considered to be non-conserved, highly species-specific and less well-studied. miR163 is a non-conserved miRNA and its locus has evolved recently by inverted duplication events of its target gene. Previously, we have shown that miR163 acts as a negative regulator of defense response. However, it remains unclear how miR163 and its targets are being regulated in response to pathogen attacks. Here, we further elucidated the molecular controls and the involvement of miR163 and its targets in plant defense response. Elevated level of miR163 was observed by Pst treatment in Arabidopsis thaliana, and this upregulation was found to be important in controlling the accumulation of its targets (PXMT1 and FAMT), to which they were also inducible by Pst treatment. Transcript and protein level analyses in transgenic plants overexpressing miR163-resistant form of PXMT1 or FAMT provided evidence for miR163 in fine-tuning its targets, suggesting that the stress-inducible miR163 and its targets act in concert in affecting defense genes expression. Epigenetically, histone deacetylation was found to involve in the repression of miR163 targets before and after Pst infection. Our findings revealed additional mechanistic insights to the controls and the evolutionary significance of young miRNA in mediating plant defense pathways against biotic stresses.

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The major outer membrane protein OprF from Pseudomonas aeruginosa was compared with OprF from the fluorescent phytopathogen Pseudomonas syringae. The P. syringae oprF gene was subcloned and sequenced and found to code for a sequence of 344 amino acids containing a 24 amino acid leader sequence. The mature protein, with a deduced molecular weight of 34,225, contained four cysteine residues and an alanine-proline rich area. Comparison of the P. syringae OprF amino acid sequence with the P. aeruginosa OprF and the E. coli OmpA sequences showed that the sequences were most similar at the carboxy-terrninal ends. Restriction enzyme site heterogeneity near the oprF gene from nine different P. syringae pathovars was determined. All pathovars had a conserved SalI site within the gene and conserved PstI. and BamHI sites near the ends of the gene. The location of the PstI and the SalI sites outside the gene was variable, although similar. Immunological relatedness between P. syringae OprF from the different pathovars and P. aeruginosa OprF was confirmed. Protein OprF from all the pathovars was shown to be 2-mercaptoethanol modifiable and more easily heat modifiable than was OprF from P. aeruginosa. / Science, Faculty of / Microbiology and Immunology, Department of / Graduate

Plants rely on innate immunity to perceive and respond to pathogenic microbes. Pathogenic microbes suppress and evade plant immune responses to obtain nutrients and multiply resulting in plant diseases and death. One battleground for the arms race between plants and microbial invaders is located in the leaf intercellular space, specifically between Pseudomonas bacteria and Arabidopsis. This thesis seeks to understand the virulence mechanisms that allow Pseudomonas bacteria to grow within the leaves of Arabidopsis and how the plant immune response reduces pathogen growth and reproduction. Some plant pathogens produce specific extracellular polysaccharides to potentially enhance pathogenicity during infection of plants. The objective of this thesis is to understand the importance of biofilms for Pseudomonas success and determine if Arabidopsis suppresses biofilm formation as part of the plant immune response. It was hypothesized that biofilm formation contributes to Pseudomonas success in planta and Arabidopsis suppresses biofilm formation during PAMP-Triggered Immunity (PTI) to reduce bacterial growth. Wild-type plants and defense mutants were infiltrated with flg22 or mock (water) treatments to induce or mock-induce PTI in plants, followed by observing GFP-expressing Pseudomonas via florescence microscopy to determine if biofilm-like aggregate formation was occurring. In vivo studies in this thesis indicate that biofilm-like aggregate formation contributes to bacterial success during Arabidopsis infection. Additionally, the phytohormone, salicylic acid (SA), accumulates in leaf intercellular spaces of resistant plants during PTI that suppresses biofilm formation, suggesting that SA acts as an anti-microbial and anti-biofilm agent that contributes to the suppression of pathogen growth during plant defense. / Thesis / Master of Science (MSc)

Orientador: Adriana Zanin Kronka / Banca: Daniela Comelis Bertolin / Banca: Marileia Regina Ferreira / Banca: Ana Paula de Oliveira Amaral Mello / Banca: Edson Luiz Lopes Baldin / Resumo: A pinta bacteriana do tomateiro, causada por Pseudomonas syringae pv. tomato Okabe (Pst), é uma das principais doenças da cultura, pois pode reduzir a qualidade e o rendimento da produção, afetando o mercado de tomates frescos e transformados. A semente de tomate infectada por Pst, além de manter a bactéria viável por um longo período, também é importante por ser uma fonte primária de inóculo, justificando a necessidade de utilização de sementes isentas do patógeno. Desse modo, esse trabalho teve como objetivos avaliar a eficiência da termoterapia e da aplicação de óleos essenciais como alternativas para o tratamento de sementes de tomate, visando ao manejo de Pst. Inicialmente, foi verificada a ação in vitro dos óleos essenciais (OE) de citronela (Cymbopogon nardus (L.) Rendle), capim-limão (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf), tomilho (Thymus vulgaris L.) e melaleuca (Melaleuca alternifolia Cheel), nas concentrações de 1%, 2% e 3%, utilizando-se leite em pó (LP - 1%) como emulsificante. Sulfato de estreptomicina (25mg/mL) e água esterilizada + LP foram incluídos como testemunhas. Os OE de tomilho (2 e 3%) e de citronela (nas três concentrações) e o sulfato de estreptomicina inibiram o desenvolvimento da colônia bacteriana, promovendo a formação do halo de inibição. Em seguida, foram conduzidos experimentos independentes, um para testar o tratamento de sementes com os OE selecionados (citronela a 1% e tomilho a 2%) e outro, com a termoterapia (50°C/30' e 50°C/25'). Todos os exp... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The bacterial speck of tomato, caused by the bacterium Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst), is among the main diseases of this crop, as it can reduce the quality and production yield, affecting the market of fresh and processed tomatoes. Pstinfected tomato seed, besides maintaining the bacterium viable for a long period, is also important because it is a primary source of inoculum, demonstrating the need of using Pst-free seeds. Thus, the objective of this work was to evaluate the efficiency of thermotherapy and the application of essential oils as alternatives for tomato seeds treatment, aiming at the management of Pst. Initially, the essential oils (EO) of citronella, lemon grass, thyme and tea tree were evaluated in concentrations of 1%, 2% and 3% (powder milk (PM - 1%) was used as emulsifier). Streptomycin sulfate (25mg/mL) and sterile water + PM were included as controls. Thyme (2% and 3%) and citronella (at three concentrations) EO and streptomycin sulfate inhibited the bacterial colonies development, promoting inhibition halo the formation. Then, independent experiments were carried out, one to test the seed treatment with the selected EOs (citronella 1% and thyme 2%) and another with thermotherapy (50°C/30' and 50°C/25'). All experiments were performed in duplicate. The incidence of Pst in seeds, germination and vigor (plant height) were evaluated. All the tested treatments promoted the eradication of Pst in the seeds. Pst presence in the seeds did not interfere in seeds germination, but promoted a reduction in plant height. Treatment with thyme EO resulted in a significant germination and vigor reduction. Thermal treatments (both temperature/exposure time combinations) and 1% citronella EO were found to be viable alternatives for Pst management in tomato seeds / Doutor

Exocyst is a protein complex conserved in yeast, animals and plants. It mediates tethering of a secretory vesicle to the plasma membrane in the semifinal step of exocytosis. Several roles of exocyst in the processes of cell polarization in plant cells have been implied, including polarized growth of polen tubes and root hairs, cytokinesis, deposition of seed coat pectin and possibly autophagy. One of the most recent roles of exocyst includes also a response to bacterial and fungal pathogens. Exo70B2 and Exo70H1 subunits were shown to play prominent roles in this respect, with Exo70H1 being responsible for mediating defense against bacterial (Pseudomonas syringae) and Exo70B2 defense against both bacterial and fungal (Blumeria graminis) pathogens. Recently, new data appeared indicating the interaction between Exo70B1 and RIN4 and Exo70A1 and NOI6, respectively. RPM-1 interacting protein 4 (RIN4) is a well known negative regulator of both basal and effector-triggered resistance. This thesis shows interaction between NOI6 and several exocyst subunits, confirming previous data. I show here that exocyst subunints interact specifically with N terminus of NOI6 protein and that this interaction is lost in the shorter version of NOI6 mimicking AvrRpt2 cleavage. Since AvrRpt2 is an effector protein from...

Stickstoffmonooxid (NO) wird als wichtige Signalkomponente bei der Entwicklung der Hypersensitiven Reaktion beschrieben. Außerdem wird NO eine Rolle als Signalmolekül bei der Expression von Abwehrgenen wie PR-1, PAL1 oder Chalkonsynthase (CHS) und bei der Akkumulation von Salicylsäure zugeordnet (Durner et al., 1998). In der vorliegenden Arbeit wurden transgene Pflanzen mit veränderten endogenen NO-Spiegeln verwendet, um die Rolle von NO in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Arabidopsis-Pflanzen, die aufgrund der Expression einer NO Dioxygenase erniedrigte NO-Gehalte aufweisen, zeigen nach einem Angriff avirulenter Pathogene einen abgeschwächten oxidative burst und eine reduzierte Expression von Genen des Phenylpropanbiosyntheseweges. Weitere Experimente mit transgenen Pflanzen, die eine bakterielle NO-Synthase exprimieren, legen nahe, dass eine konstitutive Erhöhung der NO-Spiegel nicht zu einer konstitutiv verstärkten Pathogenabwehr führt. Möglicherweise ist eine graduelle Steigerung der NO-Gehalte nach Pathogenkontakt für die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen erforderlich. Im Gegenteil, die NOS-exprimierenden Pflanzen waren anfälliger gegen bakterielle Pathogene als Wildtyp-Pflanzen und zeigten eine abgeschwächte SAR-Reaktion. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass NO eine wichtige Rolle bei der Regulation des Redoxstatus in der Pflanzenzelle spielt. Diese Funktion von NO ist wichtig beim Seneszenzvorgang. Entsprechend der Ergebnisse dieser Arbeit kann NO als negativer Regulator der Blattseneszenz angesehen werden. Die Wirkungsweise von NO auf molekularer Ebene und die Signalkaskaden, in die NO involviert ist, sind immer noch nicht ausreichend verstanden. In zukünftigen Experimenten wird es notwendig sein, die selektive Quantifizierung von NO in intaktem Pflanzengewebe zu gewährleisten, die Proteintargets von NO zu identifizieren und die Struktur und Funktion NO-modifizierter Biomoleküle zu entschlüsseln, um die Rolle von NO in Pflanze-Pathogen-Wechselwirkungen besser verstehen zu lernen. Die Nichtwirtsresistenz beruht auf mehreren Verteidigungsebenen, welche konstitutive und induzierte Komponenten beinhalten. Die Bedeutung induzierter Abwehrreaktionen für die Nichtwirtsresistenz gegen bakterielle Pathogene ist nicht vollständig klar. Die Daten der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass das Wachstum von Nichtwirtsbakterien in Arabidopsis-Blättern durch vorgebildete toxische Substanzen und durch induzierte Zellwandverstärkungen gehemmt wird. Nichtwirtsbakterien verursachen eine schnelle Induktion der Expression der Ligninbiosynthesegene PAL1 und BCB, die unabhängig vom Typ III-Sekretionssystem ist und möglicherweise zur Papillenbildung beiträgt. Darüber hinaus ist die Überlebensrate der Nichtwirtsbakterien in den extrazellulären Räumen der Arabidopsis pal1-Mutante höher als in Wildtyp-Pflanzen, was die funktionelle Bedeutung der PAL1-Expression bei der Nichtwirtsresistenz verdeutlicht. Außerdem zeigen die Experimente, dass Nichtwirtsbakterien in ähnlicher Weise wie Wirtsbakterien die Akkumulation von Salicylsäure und die Expression von PR-Genen induzieren. Die Induktion dieser Abwehrkomponenten ist abhängig von einem intakten Typ III-Sekretionssystem. Die Signalwege, auf denen nach Kontakt mit Nichtwirtsbakterien und Wirtsbakterien Abwehrreaktionen induziert werden, sind ähnlich. Es wurden jedoch zwischen zwei verschiedenen Nichtwirtsstämmen auch unterschiedliche Signalwege aktiviert, was möglicherweise auf ein unterschiedliches Repertoire von TypIII-Effektoren der beiden Stämme zurückgeführt werden kann. Trotz der Aktivierung dieser induzierten Abwehr zeigen Experimente mit klassischen Abwehrmutanten, dass SA- und JA-abhängige Abwehrreaktionen nicht direkt zur Nichtwirtsresistenz gegen P. syringae beitragen. Weiterhin zeigt diese Arbeit, dass die Nichtwirtsresistenz des Arabidopsis-Ökotyps Col-0 effektiver ist als die des Ler-0-Ökotyps, obwohl bei letzterem die Resistenz gegen virulente Bakterien höher ist. Diese Unterschiede scheinen nicht mit der unterschiedlichen Glucosinolatzusammensetzung der beiden Ökotypen im Zusammenhang zu stehen. Um das Verständnis der Nichtwirtsresistenz von Arabidopsis gegenüber P. syringae zu verbessern, können in zukünftigen Experimenten Doppel- und Triplemutanten hergestellt werden, die gleichzeitig Defekte in der zellwandabhängigen Abwehr (Lignin- und Callosebiosynthese) und in klassischen, SA-abhängigen Abwehrreaktionen aufweisen. Auch können Analysen des Genom-Polymorphismus und der Zusammensetzung von Sekundärmetaboliten in den Ökotypen Ler-0 und Col-0 zu einem besseren Verständnis der Nichtwirtsresistenz führen. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass ein lokaler, symptomfreier Kontakt von Arabidopsis-Blättern mit Nichtwirtsbakterien, TTSS-defiziente Bakterien und allgemeine bakterielle Elicitoren (PAMPs) wie Flagellin und Lipopolysaccharide die systemisch erworbene Resistenz innerhalb der Gesamtpflanze hervorrufen. Die symptomlose systemische Resistenzreaktion findet in SAR-defizienten Mutanten nicht statt, wird jedoch in der Jasmonat-insensitiven jar1-Mutante, die keine ISR-Reaktion ausbilden kann, beobachtet. Durch Behandlung von Arabidopsis-Blättern mit unterschiedlichen Inokuli von virulenten oder avirulenten P. syringae-Stämmen wurde auch eine deutliche Korrelation des Ausmaßes der SAR-Induktion mit der Höhe der SA-Akkumulation oder der PR-Genexpression, aber nicht mit der Nekrosenbildung oder der JA-Produktion, am Infektionsort festgestellt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass nicht die Hypersensitive Reaktion oder Gewebenekrosen, sondern möglicherweise die Stärke bestimmter Abwehrreaktionen am Ort der Inokulation zur Auslösung der SAR beitragen. Die Befunde, dass die systemische Resistenz auch durch PAMPs und durch TTSS-defekte P. syringae-Stämme erhöht wird, verdeutlicht die wichtige Rolle von allgemeinen Elicitoren bei der SAR-Induktion. In künftige Experimenten kann untersucht werden, ob verschiedene PAMPs die SAR in synergistischer Weise induzieren und ob allgemeine Elicitoren pilzlicher Herkunft SAR auslösen können. Weiterhin können die molekulare Prozesse spezifiziert werden, die stromabwärts von PAMP-Erkennungsprozessen für die SAR-Ausbildung notwendig sind. In weiteren Experimenten könnte die Hypothese überprüft werden, ob einzelner PAMPs als mobile SAR-Langstreckensignale fungieren können. Durch phytopathologische Charakterisierung von T-DNA-Knockout-Linien, die Defekte in Genen aufweisen, welche in Arabidopsis nach einer P. syringae-Infektion aufreguliert werden, konnte das FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1)-Gen als notwendige Komponente der SAR in Arabidopsis identifiziert werden. So bleiben die im Wildtyp induzierten systemischen Abwehrreaktionen und die Erhöhung der systemischen Resistenz nach lokaler Inokulation mit P. syringae in fmo1-Knockout-Pflanzen vollständig aus. Weiterhin korreliert die systemische Expression des FMO1-Gens eng mit der SAR-Induktion. So gibt es bei allen Abwehrmutanten, die keine SAR nach Kontakt mit P. syringae ausbilden können, keine FMO1-Expression in distalen Blättern inokulierter Pflanzen. Umgekehrt verhält es sich mit Arabidopsis-Linien, die die SAR ausbilden. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass FMO1 eine wichtige Komponente eines Signalverstärkungszyklus darstellt, der in nichtinfizierten, systemischen Teilen der Pflanze wirkt, um die SAR zu ermöglichen. In künftigen Experimenten soll der postulierte Amplifizierungsmechanismus experimentell verifiziert werden. Die Konstruktion von transgenen Linien, die ein FMO1:GFP-Fusionsprodukt exprimieren, kann Informationen über die zelluäre Lokalisation des FMO1-Proteins liefern. Weiterhin können vergleichende Analysen der chemischen Zusammensetzung von Blattextrakten der fmo1 Knockout-Linien, von FMO1-Überexprimierern und von Wildtyp-Pflanzen zur Aufklärung der biochemischen Reaktion beitragen, die die FMO1-Monooxygenase katalysiert. In Anlehnung an die Funktion von yFMO, die die einzige Flavin-abhängige Monooxygenase der Hefe darstellt, kann überprüft werden, ob FMO1 die korrekte Faltung von Proteinen am endoplasmatischen Retikulum vermittelt. Schließlich kann durch die Identifizierung weitere SAR-Gene nach der beschriebenen Strategie und durch funktionelle Charakterisierung der zugehörigen Proteine das Verständnis der SAR-Reaktion auf molekularer Ebene weiter verbessert werden. / NO has been described as an important component involved in the development of the hypersensitive reaction (Delledonne et.al., 1998). Furthermore, NO induces expression of a set of defence gene, such as PR-1, PAL1 and chalcone synthase (CHS), and accumulation of SA (Durner et al., 1998). In this study, transgenic plants with altered NO levels were used to study the role of NO in plant defence. Arabidopsis plants which, due to expression of a bacterial NO dioxygenase, exhibit lower levels of NO than wild-type plants, show several weakened defence response, including the oxidative burst and expression of phenylpropanoid pathway genes. By contrast, constitutive expression of a bacterial NO synthase in Arabisopsis results in increased levels of endogenous NO. However, these plants do not show constitutively activated defence responses, but suffer from increased susceptibility to various strains of P. syringae. This might indicate that a gradient in NO production rather than constitutive elevation of NO is necessary to trigger plant defence responses. Nevertheless, NO seems to be important for regulation of the oxidative state in plant cells. This function of NO is important during leaf senescence. The data of the present work indicate that NO acts as senescence-delaying factor during plant development. The molecular action of NO in plants and signalling cascades in which NO is involved as second messenger are still poorly understood. Experiments addressing the selective quantification of NO in intact plant tissue, the identification of NO-target proteins as well as the function of NO-modified biomolecules might help to understand the role of NO in plants. Non-host resistance consists of several layers of defence that include preformed compounds existing in plants before pathogen infection and induced defences which the plant activates after recognition of a pathogen. The role of inducible defences in preventing multiplication of non-adapted bacteria is not clear. Our experiments suggest that to restrict non-adapted bacterial growth, pre-formed antimicrobial compounds and an early inducible cell wall-based defence might play an important role in Arabidopsis leaves. Upon inoculation with non-adapted bacteria, we have observed early, TTSS-independent up-regulation of PAL1 and BCB, two lignin biosynthesis genes which might be involved in papilla formation or other kinds of cell wall fortification. Moreover, Arabidopsis pal1 knockout lines permit significantly higher survival of non-adapted bacteria in leaves than wild-type plants, suggesting a functional importance of PAL1 up-regulation. Although non-host bacteria, like host bacteria, induce accumulation of SA and PR gene expression in a TTSS-dependent manner, SA-dependent or JA/ET-dependent defences do not directly contribute to non-host resistance. Moreover, non-adapted bacteria activate similar defence signalling pathways as do host bacteria. However, because of varieties in effector protein composition between different non-adapted bacterial strains, the activated signalling pathways might also include different compounds. The Arabidopsis ecotype Ler 0 is more susceptible to a non-adapted strain of P. syringae than ecotype Col-0. Although differences in glucosinolate content and composition between those ecotypes exist, they are probably not a major reason for the observed difference in non-host resistance. To further understand the mechanisms underlying non-host resistance, the generation of double or triple mutants with deficits in both cell wall-based defences and SA-dependent signal cascades is necessary. Moreover, the study of genome polymorphism and composition of secondary metabolites between Ler-0 and Col-0 can shed new light into the mechanisms of non-host resistance against bacterial pathogens. Additionally, experiments addressing papilla formation and callose biosynthesis in Ler-0 and Col-0 could help to further elucidate bacterial non-host resistance. Our data indicate that localized contact of Arabidopsis leaves with non-adapted bacteria, type III secretion-defective P. syringae strains and bacterial pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) induce systemic acquired resistance (SAR) at the whole plant level. This finding contrasts the general belief that an HR or other leaf necroses are required for SAR induction. The observed symptomless systemic response was abolished in all SAR-deficient mutants tested in this study, but was intact in the jar1 mutant, which is compromised in induction of ISR, indicating that non-host bacteria and PAMPs induce SAR in a mechanistically similar way than host bacteria. In addition, our data show that the extent of SA accumulation or PR gene expression induced at sites of virulent or avirulent P. syringae inoculation rather than the amount of tissue necroses or jasmonate accumulation determine the magnitude of SAR. The fact that systemic responses were also triggered after local treatment with type III secretion-defective P. syringae strains and bacterial PAMPs indicate that induction of SAR is TTSS-independent. Instead, recognition of general elicitors like flagellin and LPS play an important role in activation of the SAR process. To broaden the concept of PAMP-based SAR initiation, further general elicitors from bacteria and fungal pathogens should be tested for their capability to induce SAR. Screens for mutants with deficiency in SAR activation by individual PAMPs can help to identify new components involved in the SAR signalling cascade. Possible functions of PAMPs as mobile systemic signals should be tested in future experiments. By selection of candidate genes whose expression is up-regulated in Arabidopsis leaves infected with avirulent and virulent P. syringae and pathophysiological analyses of corresponding T-DNA knockout lines, FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1) was identified as a key SAR regulator. SAR triggered by P. syringae is completely abolished in fmo1 mutant plants, and pathogen-induced expression of FMO1 in systemic leaves is closely correlated with the capability of different Arabidopsis lines to develop SAR. According to our findings, we have proposed that the FMO1 acts in signal amplification in non-inoculated, systemic leaves to trigger SAR. Experimental verification of the postulated potential amplification cycle underlying SAR should be tested in future experiments. The generation of transgenic lines expressing FMO1::GFP will provide useful information about the cellular localization of the FMO1 protein. Moreover, a comparative metabolomic analysis using SAR-induced wild-type, fmo1 knockout and FMO1 overexpressing lines can be used to identify substrates and reaction products of the FMO1 monooxygenase. As the single yeast FMO (yFMO) provides oxidizing equivalents at the ER for correct protein folding, expression of FMO1 in yfmo mutant yeast combined with protein activity assays might indicate whether FMO1 exhibits functional similarities with yeast FMO, e.g. in assuring proper folding of ER-targeted proteins essential for SAR establishment. Identification of further genes involved in activation of systemic resistance and biochemical characterization of the corresponding proteins can help to understand the SAR process in more detail.

Invertasen sind Schlüsselenzyme in der Kohlenhydratverteilung und haben möglicherweise auch während einer Pathogeninfektion eine zentrale Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde zunächst die Regulation verschiedener Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana nach Infektionen mit einem virulenten oder avirulenten Stamm von Pseudomonas syringae untersucht. Mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz-Bildgebung konnten räumliche und zeitliche Veränderungen der Photosynthese verfolgt werden. Verschiedene Parameter waren unterschiedlich reguliert. In beiden Interaktionen waren Effekte nur lokal um die Infektionsstellen erkennbar und qualitativ ähnlich. Unterschiede waren im zeitlichen Eintreten und Verlauf sichtbar. Die Methode schien geeignet für die sensitive, nicht-invasive Pathogenfrüherkennung vor dem Auftreten sichtbarer Symptome. Die Regulation verschiedener Gene innerhalb von Source-Sink-Übergängen und die Aktivität von Invertasen war in den beiden Interaktionen qualitativ unterschiedlich. Die Infektion mit virulenten Bakterien resultierte in einer Repression photosynthetischer Gene. Die Aktivität vakuolärer Invertasen stieg vorübergehend nach Infektion mit virulenten Bakterien an, während sie nach Infektion mit avirulenten Bakterien sank. Die Aktivität extrazellulärer Invertasen war in beiden Interaktionen reprimiert. Die erfolgreiche Generierung verschiedener Bakterienstämme von P. syringae, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, kann bei der weiteren Charakterisierung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen helfen. Die Regulation von Invertasen erfolgt auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Um die Funktion von Invertasen in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, wurde zunächst die Regulation von Invertasen durch endogene proteinogene Invertaseinhibitoren untersucht. In Übereinstimmung mit in silico Expressionsdaten konnte durch Untersuchung von Reportergenlinien und in Northern Blot Analysen eine starke Expression von Invertaseinhibitoren in Blättern von A. thaliana festgestellt werden. Nach Applikation biotischer und abiotischer Stressfaktoren wurde diese Expression nahezu vollständig reprimiert. Die indirekte Bestimmung der Invertaseinhibitoraktivität durch Messung der Invertaseaktivität in Mischextrakten zeigte, dass diese nach einer Pathogeninfektion vollständig reprimiert war. In funktionellen Ansätzen wurden transgene Pflanzen generiert, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle induzierbarer Promotoren exprimieren. Die Induktion der Invertaseinhibitorexpression änderte die Sensitivität gegenüber verschiedenen Pathogenen nicht signifikant. In einem pharmakologischen Ansatz wurde der chemische Inhibitor Acarbose zur Hemmung der Invertaseaktivität in A. thaliana verwendet. Eine Behandlung von Blättern bei gleichzeitiger Infektion mit Bakterien verursachte eine erhöhte Sensitivität der Pflanzen gegenüber der Infektion, eine stärkere Repression verschiedener Chlorophyllfluoreszenzparameter sowie ein erhöhtes Bakterienwachstum im Vergleich zu einer Infektion mit den Bakterien allein. Keine Effekte wurden auf transkriptioneller Ebene bei der Untersuchung von Genen verschiedener Stoffwechselwege gefunden. Die Invertaseaktivität nach zusätzlicher Behandlung mit Acarbose war tendenziell niedriger als die Aktivität nach einer Pathogeninfektion alleine. Acarbose erhöhte die Spiegel an Salicylsäure unabhängig von einer Pathogeninfektion. Da das Bakterienwachstum in Mutanten des Salicylsäure-vermittelten Abwehrweges bei zusätzlicher Behandlung mit Acarbose ebenfalls erhöht war, kann eine Beteiligung dieses Abwehrweges am Acarboseeffekt bisher ausgeschlossen werden. Invertasen sind neben ihrer Beteiligung an der Abwehr für die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig. In einem funktionellen Ansatz mit Pflanzen, die Invertaseinhibitoren induzierbar produzieren, wurde die Funktion von Invertasen getestet. Zur Generierung spezifischer Effekte wurden die Inhibitoren unter Kontrolle synthetischer Promotoren in A. thaliana exprimiert. Unerwarteterweise war das Wachstum putativ transgener Keimlinge jedoch im 4-Blatt-Stadium arretiert. Eine Analyse der Aktivität der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Reporterlinien zeigte eine Korrelation zwischen der Wachstumsarretierung und einer hohen Aktivität dieser Promotoren unter verschiedenen in vitro Bedingungen. Dieser negative Effekt der Invertaseinhibition auf das Keimlingswachstum wurde in transgenen Tabakpflanzen bekräftigt, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors exprimierten. Eine erfolgreiche Induktion des Promotors resultierte in einer Reduktion des Frischgewichtes der Keimlinge. Mittels in silico Expressionsdaten und Northern Blot Analysen konnte für A. thaliana eine spezifische und starke Expression verschiedener Invertaseisoformen in Keimlingen nachgewiesen werden. Diese komplementären Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Invertaseaktivität für eine normale Keimlingsentwicklung. / Invertases are key metabolic enzymes in carbohydrate partitioning which may also play an important role during pathogen infection. In this study, the regulation of different metabolic pathways in Arabidopsis thaliana plants after infection by a virulent and an avirulent strain of Pseudomonas syringae was investigated. With help of chlorophyll fluorescence imaging spatio-temporal changes in photosynthesis were monitored. The monitored chlorophyll fluorescence parameters were showing differential regulation. The effects were restricted to the vicinity of the infection site and did not spread to uninfected areas of the leaf. Qualitatively similar changes in photosynthetic parameters were observed in both interactions. Major differences between the responses to both strains were evident in the onset and time course of changes. Changes could be detected by chlorophyll fluorescence imaging before symptoms were visible by eye. In contrast to photosynthesis, the regulation of marker genes for source/sink relations and the activities of invertase isoenzymes showed qualitative differences between both interactions. Inoculation of the virulent but not the avirulent strain resulted in downregulation of photosynthetic genes and upregulation of vacuolar invertases. The activity of vacuolar invertases transiently increased upon infection with the virulent strain but decreased with the avirulent strain while extracellular invertase activity was downregulated in both interactions. As an advanced tool for the characterization of the interaction between A. thaliana and P. syringae bacteria expressing the green fluorescing protein were generated. Invertases are regulated on transcriptional and posttranscriptional level. To understand the function of invertases in plant-pathogen-interactions, the regulation of endogenous proteinaceous invertase inhibitors was investigated. According to expression profiling the analysis of reporter gene lines and Northern Blot analyses revealed a strong expression of invertase inhibitors in source leaves of A. thaliana. After application of biotic and abiotic stress factors this expression was completely repressed. Indirect determination of invertase inhibitor activity by measurement of invertase activity in mixed extracts revealed a complete repression of inhibitor activity after pathogen infection. In functional approaches transgenic plants were generated, expressing invertase inhibitor proteins under control of inducible promoters. However, no effect of the induction of inhibitor expression on the sensitivity to different pathogens could be observed so far. In a pharmacological approach acarbose war used as an invertase inhibitor. Simultaneous treatment of plants with acarbose and bacteria revealed an increased sensitivity of the plant towards the bacterial infection and a stronger repression of chlorophyll fluorescence parameters compared to plants treated with bacteria alone. No effects on photosynthesis, carbohydrate metabolism and defence could be observed on transcriptional level. A tendency of lowered invertase activity could be observed after treatment with acarbose and bacteria compared to bacterial treatment alone. Acarbose treatment enhanced the levels of salicylic acid independent of bacterial infection. The acarbose-mediated increase in sensitivity was also detectable in sid2 and cpr6 mutants indicating that the effect of acarbose is independent of the salicylic acid mediated defence pathway. Invertases are important enzymes in higher plants, which are involved in regulating developmental processes and responses to external factors. In a functional approach the role of invertases was investigated using transgenic plants ectopically expressing inhibitor proteins to decrease invertase activity. For generating specific effects, these inhibitor proteins were expressed in A. thaliana under the control of synthetic promoters consisting of tetramers of pathogeninducible elements, which were reported to yield low constitutive expression. Unexpectedly, seedling growth of putative transgenic plants was arrested at the four-leaf stage. Analysis of ß-glucuronidase activity of corresponding reporter gene lines showed a correlation of the growth arrest with high activity of these promoters in seedlings grown under tissue culture conditions. The negative effect of invertase inhibition on seedling growth was substantiated by transgenic tobacco plants expressing an invertase inhibitor under control of a tetracycline inducible promoter. Ectopic induction of the invertase inhibitor during early seedling development resulted in a reduced fresh weight of seedlings. Expression profiling and Northern Blot analyses further supported the importance of invertase in Arabidopsis thaliana seedling development. Different invertases were specifically and strongly expressed. These complementing results show that invertase activity is required for normal seedling development.

Inoculation with plant pathogens induces a diverse range of plant responses which potentially contribute to disease resistance or susceptibility. Plant responses occuring in consequence of pathogen infection include activation of classical defence pathways and changes in metabolic activity. The main defence route against hemibiotrophic bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae is based on the phytohormone salicylic acid (SA). SA-mediated responses are strictly regulated and have also been shown to depend on external factors, e.g. the presence of light. A major goal of this work was to provide a better understanding of the light dependency of plant defence responses mediated through SA. The second part of the project focussed on the influence of plant sterols on plant resistance. I analyzed leaf lipid composition and found that accumulation of the phytosterol stigmasterol in leaves and in isolated (plasma) membranes is a significant plant metabolic process occurring upon pathogen infection. / Eine Infektion mit Pathogenen veranlasst Pflanzen zur Aktivierung zahlreicher Abwehrreaktionen, welche entscheidend dazu beitragen können, ob die Pflanze anfällig ist und erkrankt oder eine erfolgreiche Resistenz ausbilden kann. Die Abwehr gegen hemibiotrophe bakterielle Pathogene basiert vor allem auf der verstärkten Bildung des Pflanzenhormons Salicylsäure (SA) und der Aktivierung SA-vermittelter Abwehrreaktionen. Beides ist nicht nur intern genau reguliert, sondern auch von externen Faktoren beeinflusst. So trägt zum Beispiel die Verfügbarkeit von Licht wesentlich zum Ausmaß und zum Erfolg dieser Abwehrreaktionen bei. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, zu einem besseren Verständnis des Einflusses von Licht auf die Pathogenabwehr beizutragen. Das zweite Projekt dieser Arbeit stellt die Lipidzusammensetzung pathogen-infizierter Blätter in den Mittelpunkt. Bei der Analyse pflanzlicher Sterole zeigte sich unter anderem, dass das C22-ungesättigte Sterol Stigmasterol in Blättern und in daraus isolierten Plasmamembranen nach Pathogenbehandlungen akkumuliert.