Les organismes eucaryotes possèdent plusieurs mécanismes de contrôle qualité en vue d'assurer leur survie en condition de stress. La réponse aux protéines mal repliées (UPR) est un mécanisme à la base de différents volets ayant pour but de ramener l'organisme vers l'homéostasie. L'étude qui suit vise à caractériser plus en profondeur un volet de cette réponse qui est lié non pas à la présence de protéines mal repliées, mais plutôt à des défauts dans l'homéostasie des lipides de la cellule. Notre étude a mis en évidence qu'une forme précise de la protéine à ancrage GPI modèle Yps1p est relâchée de manière importante dans des souches mutantes connues pour déclencher ce volet de la réponse UPR. Nous avons aussi montré que cette relâche ne semble pas être causée par le déclenchement de l'UPR et que des phospholipases sont responsables du clivage de l'ancrage GPI. Une défaillance ou une insuffisance de l'UPR est associée à plusieurs pathologies humaines, dont le diabète de type 2, d'où l'intérêt d'en étudier les différentes facettes.

Résumé Les hémoglobines tronquées (Hbtrs) sont retrouvées chez plusieurs organismes et leurs fonctions sont encore inconnues pour la plupart. Les Hbtrs du pathogène de plante Agrobacterium tumefaciens C58 ont été inactivées pour vérifier leurs implications dans la production de tumeur chez les plantes. Les expériences ont montré que les souches mutantes pour les Hbtrs AtuHb2 et AtuHb3 étaient capables d'induire la production de tumeur chez la plante Kalanchoe daigremontiana. La protéine recombinante AtuHb2 a été caractérisée par spectroscopie d'absorption et de résonance Raman. L'analyse, par spectroscopie d'absorption, montre que la protéine est hexacoordonnée dans la forme ferrique et ferreuse, qu'il est possible pour AtuHb2 de former des complexes stables avec les ligands CO, CN- et NO, mais pas avec l'O2 et que le complexe formé entre la forme ferreuse et le NO est pentacoordonné. L'analyse par spectroscopie de résonance Raman a montré que le ligand CO est peu stabilisé

Au cours de la dernière année, Héma-Québec a fourni plus de 236 000 culots globulaires aux centres hospitaliers du Québec, ce qui a permis de sauver la vie de milliers de gens. Les transfusions de ces produits sanguins ne sont toutefois pas sans risques. Il y a, chaque année, de nombreux cas d’effets adverses suite à une ou plusieurs transfusions. La TRIM (Transfusions-Related Immunomodulation) est un concept qui a été développé pour tenter d’expliquer plusieurs de ces observations. Selon la littérature, les produits fabriqués avec la méthode des couches leuco-plaquettaires seraient moins risqués pour le patient [1]. Mon projet consistait à mettre au point un modèle de transfusion in vitro permettant d’étudier les propriétés inflammatoires des culots globulaires fabriqués avec deux méthodes de transformation, soit la méthode des couches leuco-plaquettaires et le procédé de centrifugation à froid du sang total. Pour ce faire, différentes technologies ont été utilisées pour la transformation du sang à l’aide d’appareils automatisés, la cytométrie en flux pour l’analyse des populations cellulaires et le dosage des cytokines par ELISA.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Les β-lactamases sont le principal mécanisme bactérien de défense contre les β-lactamines. Elles catalysent l’inactivation de ces antibiotique par le clivage de leur noyau β-lactame. Les β-lactamases les plus communes sont celles de la classe A, qui rassemble une grande variété d’enzymes aux spécificités de substrat variées. Ces protéines ont été l’objet de nombreuses recherches expérimentales et théoriques. Plusieurs études de dynamique par spectroscopie RMN ont été réalisées dans notre laboratoire sur les enzymes modèles TEM-1 et PSE-4. Le présent projet continue l’investigation de ces deux β-lactamases par des méthodes théoriques. Un protocole de simulation de DM a été établi et validé par comparaison avec des données de relaxation RMN. Une nouvelle technique d’analyse conjointe DM/RMN a également été développée, permettant de limiter les problèmes de sous et sur-ajustement présents dans l’analyse « model-free ». Pour comparer la dynamique des β-lactamases de classe A en présence et en absence de leur substrat, un potentiel pour les β-lactamines a été développé, en tenant compte de la géométrie et du potentiel chimique particuliers du noyau β-lactame. Ce champ de forces est transférable, permettant la construction d’une variété d’antibiotiques. Nos simulations, couplées aux précédentes études par RMN, démontrent qu’il existe une dualité dynamique dans les β-lactamases de classe A : elles sont hautement structurées à l’échelle ps-ns, mais aussi le siège de mouvements lents (µs-ms) aux abords du site actif et particulièrement dans la boucle qui borde le site catalytique. La rigidité ps-ns favorise un positionnement optimal des résidus du site actif pour une catalyse efficace, et permet la tolérance de mutations potentiellement déstabilisantes. Les mouvements à l’échelle µs-ms les plus intéressants sont localisés dans la boucle Ω et confirment son rôle régulatoire : elle permet l’ouverture du site actif pour l’entrée du substrat et le largage du produit. La liaison du substrat a des effets à longue portée rigidifiant TEM-1. On observe également un mouvement accru de la boucle Ω dans TEM-1 et PSE-4. Les interactions spécifiques menant à cette plus grande flexibilité varient toutefois d’une enzyme à l’autre : il y conservation des propriétés dynamiques. / β-Lactamases are the main bacterial mechanism of resistance against β-lactams. They inactivate these antibiotics by cleaving their β-lactam ring. Class A enzymes are the most prevalent, with a broad variety of substrate specificities. These proteins were studied by numerous experimental and theoretical studies. NMR spectroscopy measurements were performed in our laboratory on model enzymes TEM-1 and PSE-4. This project continues the investigation of the dynamic properties of these two β- lactamases using theoretical methods. An MD simulation protocol was established and validated using NMR relaxation data. A new joint MD/NMR analysis technique was developped, allowing a reduction of under- and over-fitting problems in model-free analysis. To compare class A β-lactamase dynamics in presence and absence of substrate, a potential was developped to describe β-lactams, taking into account the particular geometry and chemical potential of the β-lactam cycle. This force field is transferable, allowing the construction of a variety of antibiotics. Our simulations, along with past NMR studies, prove the existence of a dynamical duality in class A β-lactamases : they are highly structured on the ps-ns timescale, but also subjected to slow motions (µs-ms) in the vicinity of the active site, particularly in the Ω loop that borders the catalytic site. Ps-ns rigidity favors an optimal positioning of active site residues for an efficient catalysis, and allows the protein to tolerate potentially destabilizing mutations. The most interesting µs-ms motions are located in the Ω loop, confirming its regulatory role : it opens the active site for substrate entry and product release. Substrate binding has structuring long-range effects on TEM-1. Increased loop motions are also observed in both TEM-1 and PSE-4. However, specific interactions responsible for this higher flexibility vary between the two enzymes : protein dynamics properties are conserved.

Les cellules de l’épithélium gingival expriment des récepteurs pour reconnaître des motifs moléculaires présents sur les microorganismes. Le but de cette étude est de comparer la réponse des cellules de l’épithélium gingival au contact d’un biofilm commensal ou pathogène. Des macrophages, des kératinocytes gingivaux et une coculture de macrophages/kératinocytes ont été stimulés avec des biofilms commensaux et pathogènes. L’expression de gènes et la production des récepteurs TLRs (Toll-like receptors) et NLRS (NOD-like receptors) ont été évaluées respectivement par amplification (qRT-PCR) et par immunofluorescence. Les sécrétions de cytokines et de défensines ont également été évaluées par ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Les résultats obtenus n’ont pas révélés de profils d’expression de récepteurs spécifiques aux pathogènes ou commensaux. La sécrétion de cytokines et de défensines est plus fortement induite par les pathogènes que par les commensaux. L’investigation d’autres récepteurs ou des membres de l’inflammasome pourrait aider à mieux comprendre les mécanismes de tolérance ou de défenses de l’hôte.

Les immunoglobulines intraveineuses (IgIV) sont des préparations thérapeutiques couramment utilisées pour le traitement de diverses maladies auto-immunes et inflammatoires. Récemment, les IgIV ont également été proposées comme thérapie de prophylaxie ou suite à des transplantations afin de réduire les rejets de greffe et de maladie du greffon contre l’hôte (GvHD). Malgré le large spectre d’efficacité des IgIV, leurs modes d’action demeurent encore mal compris. Des observations cliniques ont rapporté que les IgIV modulaient les fonctions des lymphocytes T chez les patients traités mais l’étude in vivo et in vitro des mécanismes responsables de ces modulations n’a pas permis de déterminer précisément comment les IgIV exercent leur effet anti-inflammatoire sur les lymphocytes T. Afin d’apporter des éléments de réponse à ce sujet, nous avons étudié les mécanismes impliqués dans l’inhibition de l’activation des lymphocytes T suite à la stimulation avec des lectines ou des billes anti-CD3/CD28. Nos résultats ont mis en évidence que les IgIV n’affectent pas directement les fonctions des lymphocytes T activés. En effet, nous avons montré que l’inhibition apparente de l’activation des lymphocytes T par les IgIV est en fait la conséquence d’une neutralisation des agents activateurs par les IgIV plutôt qu’un effet direct des IgIV sur les lymphocytes T. En utilisant la réaction lymphocytaire mixte (RLM) comme modèle in vitro de rejet de greffe et de GvHD, nous avons proposé que l’inhibition de l’activation des lymphocytes T par les IgIV est en partie attribuée à l’induction de monocytes avec un phénotype CD80faible/PD-L1élevé.. Finalement, nous avons montré que les modulations inhibitrices des IgIV dans les RLM corrèlent avec la modulation de miARN spécifiques suggérant que des agonistes ou antagonistes de miARN pourraient être utilisés comme substituts thérapeutiques aux IgIV afin de répliquer les effets des IgIV sur les fonctions des lymphocytes T dans le contexte de désordres auto-immuns ou de transplantations. / Intravenous immunoglobulin (IVIg) is a therapeutic preparation commonly used to treat various autoimmune and inflammatory diseases. Recently, IVIg was also proposed as prophylactic and post-transplant therapy to reduce allograft rejection and graft-versus-host disease (GvHD). Despite the broad efficacy of IVIg, its modes of action remain unclear. Clinical observations reported that IVIg modulated the T cell functions in IVIg-treated patients but the in vivo and in vitro study of the mechanisms responsible for these modulations did not permit to clearly determine how IVIg exerts its anti-inflammatory effects on T cells. To gain more insight into the effect of IVIg on this population, we studied the mechanisms implicated in the inhibition of T cell activation by IVIg following stimulation with lectins or anti-CD3/CD28-coated microbeads. Our results showed that IVIg did not directly affect the functions of activated T cells. In fact, we showed that the apparent inhibition of T cell activation by IVIg is the consequence of stimulatory agents neutralization by IVIg rather than a direct effect of IVIg on T cells. Using mixed lymphocyte reaction (MLR) as an in vitro model of allograft rejection and GvHD, we proposed that the inhibition of T cell activation by IVIg is in part attributed to the induction of monocytes with a CD80low/PD-L1high phenotype. Finally, we showed that the inhibitory modulations of IVIg observed in MLR correlate with the modulation of specific miRNA suggesting that miRNA agonists or antagonists could be used as therapeutic substitutes to replicate the effects of IVIg on T cell functions in the context of autoimmunes disorders or transplantations.

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, plusieurs des protéines impliquées dans l'assemblage et le remodelage de la paroi cellulaire sont produites sous forme inactive ou nécessitent une régulation négative une fois leur travail effectué. Des enzymes protéolytiques doivent donc intervenir à des moments précis pour réguler leur activité. Parmi ces enzymes on retrouve Kex2p, une protéase à sérine impliquée dans la maturation protéolytique des précurseurs protéiques acheminés vers la voie de sécrétion, et Yps1p, une aspartyl protéase dont la fonction est encore peu connue puisque aucun de ses substrats biologiques n'a encore été identifié. Par conséquent, notre objectif principal était de découvrir un ou plusieurs substrats naturels de l'endoprotéase Yps1 dans le but de lui associer une fonction précise. Puisque certaines évidences semblaient indiquer une implication possible de Yps1p dans la régulation des propriétés de la paroi cellulaire via le clivage endoprotéolytique de la chitine synthétase I, nous avons premièrement tenté de démontrer un lien direct entre Yps1p et l'activation de cette enzyme. Toutefois, nos résultats ont plutôt démontré que Yps1p était impliquée dans l'activation d'une ou plusieurs autres protéines que Chs1p. Nous avons donc opté pour une approche plus globale en caractérisant les phénotypes des mutants yps1[delta], kex2[delta] et yps1[delta]kex2[delta]. C'est alors que nous avons fait un premier lien entre Yps1p et les mannoprotéines de la paroi cellulaire. Par la suite, une comparaison entre les profils électrophorétiques des mannoprotéines sécrétées dans le milieu de culture nous a permis d'identifier quelques candidats potentiels que nous avons ensuite caractérisés par séquençage en N-terminal. En plus de confirmer que Yps1p joue un rôle important dans la régulation des propriétés de la paroi cellulaire chez S. cerevisiae, nos résultats ont démontrés que cette endoprotéase est impliquée dans le clivage endoprotéolytique de Gas1p, une [bêta] 1,3-glucanosyltransférase responsable de l'élongation des chaînes latérales de [bêta] 1,3-glucans. Par conséquent, cette découverte fait de Gas1p le premier substrat naturel de l'endoportéase Yps1 à être identifié.

Tableau d'honneur de la FÉSP / La signalisation calcique dendritique joue un rôle important dans la régulation de mécanismes neuronaux, tels que la plasticité synaptique et l’intégration de l’information transmise. Bien compris chez les neurones principaux, ce processus de régulation est moins étudié chez les divers types d’interneurones GABAergiques qui modulent l’acquisition et l’envoi de signaux neuronaux. Chez les interneurones à décharge rapide, un type d’interneurone commun dans les circuits corticaux, il a été démontré qu’il y a absence de rétropropagation des potentiels d’action dans les dendrites distales (Hu et al., 2010). Cette découverte a des implications fonctionnelles, car la rétropropagation des potentiels d’action est un signal important pour l’induction des formes de plasticité synaptique hebbiennes. Par contre, il a été suggéré que l’activité dendritique locale pourrait compenser pour l’absence de rétropropagation des potentiels d’action. En conséquence, ce travail porte sur l’étude des évènements calciques dans les dendrites distales des interneurones à décharge rapide. Nous avons cherché à déterminer s’il est possible de générer ces signaux calciques par stimulation dendritique locale, à étudier les mécanismes responsables de ces signaux et à déterminer si ces signaux jouent un rôle dans la régulation de la plasticité synaptique à ces synapses. Pour atteindre ces objectifs, nous avons utilisé une combinaison de méthodes électrophysiologiqes (patch-clamp en mode cellule entière), d’imagerie calcique deux-photons et de modélisation computationnelle. Nous avons pu établir qu’il est possible de générer des évènements calciques postsynaptiques supralinéaires dans les synapses excitatrices étudiées par stimulation électrique locale. Ces signaux sont médiés par l’influx calcique provenant de l’activation des récepteurs AMPA perméables au Ca2+, qui déclenche à son tour le relâchement de Ca2+ par les récepteurs ryanodine présents sur réserves calciques intracellulaires. Ces signaux comprennent aussi une contribution calcique mineure des récepteurs NMDA, et ils restent locaux (pas de propagation dans l’arbre dendritique). De plus, nous avons déterminé que ces évènements calciques supralinéaires produisent un revirement de la plasticité synaptique, car ils induisent la dépression à long-terme dans les synapses étudiées, alors que les signaux calciques de basse amplitude induisent la potentiation à long-terme. Nous avons aussi examiné si ces évènements calciques supralinéaires étaient générés de façon équivalente dans les dendrites apicales et basales, qui reçoivent des synapses de différentes sources. Nous avons observé que les signaux des dendrites apicales avaient une plus grande amplitude et étaient associés à un plus haut niveau de dépolarisation. À partir de la modélisation, nous avons pu prédire le nombre de synapses nécessaires à la génération de ces signaux et la contribution potentielle des mécanismes d’extrusion du Ca2+. Finalement, nous avons étudié la spécificité cellulaire des mécanismes d’intégration dendritique en combinant l’imagerie calcique et la modélisation dans un type différent d’interneurone, les interneurones spécifiques aux interneurones type III. En conclusion, nous avons prouvé qu’il existe dans certains interneurones des mécanismes alternatifs, médiés par des hausses de Ca2+ locales, permettant la régulation de la plasticité aux synapses excitatrices. / Dendritic Ca2+ signaling plays an important role in the regulation of neuronal processes, such as synaptic plasticity and input integration. Well-studied in principal neurons, this form of regulation is not well understood in the various types of GABAergic interneurons that modulate activity in neuronal networks. In fastspiking (FS) interneurons, a common interneuron type in cortical circuits, it has been shown that there is a lack of action potential (AP) backpropagation in distal dendrites (Hu et al., 2010). This discovery has functional implications, AP backpropagation is an important signal for the induction of Hebbian forms of synaptic plasticity. However, it has been suggested that local dendritic activity could compensate for the absence of AP backpropagation. Consequently, this work focuses on the study of Ca2+ transients in distal dendrites of FS interneurons. We sought to determine whether it is possible to generate supralinear Ca2+ transients through local dendritic stimulation, to study the mechanisms responsible for those transients and to determine whether those signals play a role in the regulation of synaptic plasticity at those synapses. To reach those objectives, we used a combination of electrophysiological methods (whole-cell patch-clamp recordings), two-photon Ca2+ imaging and of computational modeling. We were able to establish that supralinear postsynaptic Ca2+ transients can be generated through local electrical stimulation of excitatory synapses in distal dendrites. These Ca2+ transients were mediated by Ca2+ influx from the activation of Ca2+-permeable AMPA receptors, which triggers Ca2+ release through ryanodine receptors present on intracellular Ca2+ stores (Ca2+-induced Ca2+ release). These Ca2+ signals also contain a minor contribution from NMDA receptors, and stay localized (no significant propagation in the dendritic arbor). In addition, we determined that these supralinear Ca2+ signals constitute a switch in the expression of synaptic plasticity, as they induce long-term depression in local synapses, while low-amplitude Ca2+ signals induced synaptic long-term potentiation. We also examined whether these supralinear Ca2+ transients were generated in both apical and basal dendrites, which receive synaptic contacts from different sources (Schaffer collaterals vs local collaterals). We observed that Ca2+ transients in apical dendrites had a higher amplitude and were associated with a higher level of somatic depolarization. We were also able to predict, through computational modeling, the number of synapses necessary to the generation of those signals and the potential contribution of Ca2+ extrusion mechanisms. Finally, we studied the cell-specificity of dendritic integration mechanisms by combining Ca2+ imaging and modeling in a different interneuron type, interneuron-specific interneurons type III. In conclusion, we were able to prove that certain interneurons possess alternative mechanisms, mediated through local Ca2+ transients, that allow for the regulation of plasticity at excitatory synapses.

Par le processus d'érythropoïèse, notre organisme génère à tout instant de nouveaux globules rouges à partir de cellules souches hématopoïétiques. Dans le cadre d'études in vitro réalisées par notre équipe, nous avons démontré que l'hyperthermie légère augmente le taux d'expansion de ces cellules, en plus d'accélérer leur différenciation et leur maturation. Le but de mes travaux était de déterminer si la surexpression des protéines HSP27 et HSP70 qui accompagne l'hyperthermie légère était responsable en partie des effets observés sur la prolifération et la différenciation. Ces travaux démontrent que la surexpression de ces protéines, par l'emploi de lentivirus, serait partiellement responsable en début de culture d'une prolifération accélérée. De plus, leur surexpression serait impliquée dans l'augmentation de la maturation des cellules, favorisant l'expression de marqueurs spécifiques aux cellules érythroïdes matures, tels que la glycophorine A.

ChuS est une protéine provenant d'une bactérie pathogène de l'humain qui a la capacité de lier et de dégrader l'hème de l'hôte pour en libérer le fer nécessaire à la croissance bactérienne. Deux résidus potentiellement importants du site actif, l'arginine 100 (R100) et l'acide aspartique 191 (D191) ont été investigués afin de mieux comprendre leur rôle dans la catalyse par ChuS. Nos résultats révèlent que le résidu D191 n'est pas essentiel à l'activité catalytique, mais qu'il est important pour la stabilité du complexe entre l'enzyme et l'un de ses substrats (hème) alors que le résidu R100 est absolument essentiel à l'activité catalytique. Nos études cinétiques et spectroscopiques détaillées fournissent des informations qui permettent de mieux comprendre le mécanisme catalytique de ChuS. Elles aident ainsi à obtenir une meilleure compréhension des voies d'acquisition de l'hème comme source de fer chez les bactéries pathogènes et à définir de nouvelles cibles thérapeutiques.