Le rôle des progestatifs et du récepteur de la progestérone (PR) dans la carcinogénèse mammaire est maintenant établi. Le PR est exprimé sous deux isoformes PRA et PRB dont l'expression est équimolaire mais qui différent par leur activité transcriptionnelle des gènes cibles. La surexpression de PRA est associée à un pronostic défavorable du cancer mammaire, et est observée chez les femmes à haut risque génétique de cancer du sein. L'utilisation d'antagonistes pour inhiber l'activité de PR pourrait constituer une stratégie thérapeutique potentielle. L'objectif de cette thèse a été d'évaluer les effets de l'ulipristal acétate (UPA), un anti-progestatif, sur la tumorigenèse mammaire dans deux modèles d'études complémentaires. In vitro, dans la lignée cancéreuse mammaire bi-inductible (MDA-iPRAB) développée au laboratoire. Nous avons démontré qu'UPA inhibe la prolifération cellulaire induite par la progestérone en présence de PRA. L'expression de certains gènes clés de la tumorigenèse mammaire, cibles de PRA a été étudiée. Une corrélation entre avec la prolifération cellulaire et l'expression du facteur anti-apoptotique BCL2-L1 (messager et protéine) a été démontrée. L'activation transcriptionnelle, dépendante de la progestérone et inhibée par l'UPA, s'accompagne d'un recrutement spécifique et sélectif de PRA sur des séquences régulatrices du gène BCL2-L1, comme le démontrent les expériences de ChIP. In vivo, nous avons évalué l'efficacité anti-tumorale de l'UPA ainsi qu'une nouvelle classe d'antagoniste sélective et passive de PR, les « APRns » dans un modèle murin de xénogreffe de tumeur mammaire humaine HBCx34. UPA ralentit la croissance tumorale, diminue la prolifération cellulaire (Ki67, PCNA) et inhibe l'expression de BCL2-L1. L'ensemble de nos résultats démontrent une action antiproliférative et apoptotique de l'UPA ce qui suggère une utilisation potentielle d'antagonistes de PR dans la prise en charge du cancer du sein. / The role of progestins and the progesterone receptor (PR) in breast tumorigenesis has now been elucidated. PR is expressed as two isoforms PRA and PRB, differing by their structure and their transcriptional activity. They are often co-expressed in normal breast tissue but the predominance of PRA expression is associated with mammary carcinogenesis, a bad prognosis and an endocrine-resistance. Antiprogestins inhibit mammary tumor growth in several experimental models. The aim of this thesis was to investigate the effect of a well-known selective PR modulator (SPRM), Ulipristal acetate (UPA) in two complementary breast cancer models. In vitro, we used the newly established bi-inducible breast cancer cell line “MDA-iPRAB”, and demonstrated an anti-proliferative activity of UPA in progesterone-dependent, PRA-specific MDA-iPRAB cell proliferation. We also studied the expression of PRA-target genes involved in mammary tumorigenesis, and showed a correlation between cell proliferation and the expression of the anti-apoptotic factor BCL2-L1 (transcript and protein). The transcriptional activation of BCL2-L1 was stimulated by the progesterone in MDA-iPRA cell line, inhibited by UPA and was associated with a specific and selective recruitment of PRA to BCL2-L1 regulatory regions (ChIP assays). In vivo, we evaluated the anti-tumoral activity of UPA and a new class of selective and passive progesterone receptor antagonist ‘APRns' in patient-derived breast cancer xenograft in nude mice. UPA slowed down mammary tumor growth, decreased cell proliferation (Ki67, PCNA) and inhibited the BCL2-L1 expression. Further investigation are needed to determine the actions of APRns. In summary, UPA has an antiproliferative and a pro-apoptotic activities, which suggests a potential interest of UPA in breast cancer endocrine therapy.

Les hormones ovariennes sont impliquées dans le développement du cancer du sein des femmes porteuses de mutations du gène BRCA1. L’étude du tissu mammaire normal de femmes mutées et non mutées nous a permis de montrer des altérations de la signalisation de l’estradiol et la progestérone dans un modèle de greffes chez la souris. Ces dérégulations concernent l’activité proliférative et l’expression des récepteurs hormonaux, et sont hétérogènes d’une patiente mutée à l’autre. De plus, une diminution de l’expression de la forme phosphorylée en sérine 211 du récepteur des glucocorticoïdes a été mise en évidence dans le tissu muté BRCA1. Ces observations posent la question de la place d’unantiprogestatif/anti-glucocorticoïde tel que l’ulipristal acétate (UPA) dans le traitement préventif des femmes mutées pour BRCA1. Les effets de l’UPA ont été caractérisés in vitro dans les cellules mammaires normales pour préciser les conséquences de son utilisation sur le sein. Son action a ensuite été examinée sur les xénogreffes de sein de patientes mutées et non mutées. Nous montrons que l’UPA est capable d’inhiber la prolifération du tissu muté lorsqu’elle est induite par la progestérone. Ce résultat encourage son utilisation dans la prévention tumorale mais indique une spécificité d’action en fonction des dérégulations hormonales associées au tissu muté. / Ovarian hormones, estradiol and progesterone, are known to promote breast carcinogenesis in BRCA1 mutated women. Using normal mammary gland xenografted in mice, we found that hormonal responses were deregulated in a heterogeneous fashion within BRCA1 mutation carriers. These observations raise the question of a potential use ofantiprogestin treatment as ulipristal acetate (UPA) to prevent breast tumorigenesis in BRCA1mutated women. Studies with this experimental model and epithelial normal breast cells in vitro, revealed that UPA alone had no proliferative activity on breast tissue but was efficient to inhibit proliferative activity when induced by progesterone treatment in mutated tissue. UPAcould be a promising treatment to prevent breast tumorigenesis for some mutated women. In addition, we observed a severe decrease of the phosphorylated Serine 211 glucocorticoid receptor isoform in BRCA1 carriers compared to non mutated tissue. This observation suggests that the glucocorticoid receptor expression and activation should be taken intoaccount in BRCA1 carriers.

Le récepteur de la progestérone (PR) est un cible pharmacologique majeure pour la contraception, et pour le traitement de certaines pertubations endocriniennes ainsi que des cancers hormono-dépendants de l’utérus et du sein. Chez la femme, PR est exprimé sous deux isoformes majeures PRA et PRB qui sont des facteurs de transcription fonctionnellement distincts. L’expression de PRA vs PRB est souvent altérée dans certaines situations pathologiques selon des mécanismes encore mal identifiés. Dans cette thèse, nous démontrons que des phosphorylations clés regulées par des MAPK distincts contrôlent la stabilité de PRB et PRA. PRA est sélectivement stabilisée par la p38 MAPK tandis que PRB est préférentiellement stabilisé par la p42/44 MAPK. Ces mécanismes différentiels régulent donc le rapport d’expression PRA/PRB de façon ligand-dépendente et mettent les fonctions progestatives sous le contrôle de l’activité des facteurs de croissance et des cytokines pro-inflammatoires. Or, dans les cellules cancéreuses, la suractivité de certains stimuli extracellulaires provenant de telles signalisations et activant préférentiellement p42/44 et/ou p38 MAPK, pourrait être à l’origine des pertubations du rapport PRA/PRB observées dans les tumeurs du sein. Afin d’explorer la contribution différentielle des isoformes du PR dans la signalisation cellulaire, nous avons élaboré un modèle cellulaire original permettant de contrôler l’expression de PRA et/ou PRB de façon conditionnelle, réversible et dose-dépendante. Par une approche transcriptomique, nous avons identifiés les gènes régulés de façon différentielle par PRA et/ou PRB en absence ou présence de l’hormone. Nous montrons que plusieurs aspects de la signalisation de PR comme la sélectivité de la régulation transcriptionnelle, la dialogue-croisée avec des facteurs de croissance ainsi que l’efficacité antiproliférative des antiprogestatifs dépendent de l’expression differentielle des isoformes du PR. Une nouvelle approche thérapeutique ou préventive possible dans les cancers hormono-dépendants pourrait consister à administrer des antagonistes du PR. Cependant, la plupart des antiprogestatifs disponibles comme la mifépristone présentent des effets agonistes partiels et ne sont pas sélectifs du PR, produisant ainsi des effets indésirables majeurs. Dans un projet collaboratif, et sur la base d’études cristallographiques de PR, nous avons synthétisé et caractérisé plusieurs dizaines de molécules antagonistes du PR, nommés APRn. L’étude des relations structure-fonctions de ces APRn a permis d’identifier les substitutions introduites dans la structure stéroïdienne qui sont responsables des propriétés agonistes/antagonistes de ces molécules. Plusieurs APRn sélectionnés sont dépourvus d’effets agonistes partiels, sont spécifiques du PR et inhibent son activité transcriptionnelle par un nouveau mécanisme d’action dit « passif », en raison de leur capacité particulière à inhiber le recrutement des corégulateurs transcriptionnels. Ces antagonistes sélectifs de PR offrent des perspectives thérapeutiques intéressantes dans les maladies de la reproduction et des cancers hormono-dépendants de l’utérus et du sein. L’ensemble de nos résultats apportent des informations nouvelles sur les mécanismes impliqués dans la sélectivité fonctionnelle des isoformes du PR en physiopathologie, ainsi que sur la possibilité d’un ciblage pharmacologique spécifique par de nouveaux antagonistes utilisables dans le traitement du cancer du sein. / Progesterone receptor (PR) is an essential pharmacological target for contraception, female reproductive disorders as well as for hormone-dependent breast and uterine cancers. Human PR is expressed as two major isoforms PRA and PRB which behave as distinct transcriptional factors. PRA vs PRB expression is often altered under pathological conditions notably breast cancer through unknown mechanisms. In this thesis we demonstrate that down-regulations of PRB and PRA proteins are negatively controlled by key phosphorylation events involving distinct MAP kinase signaling. PRA is selectively stabilized by p38 MAPK whereas p42/44 MAPK specifically controls PRB stability leading to unbalanced PRA/PRB ratios in a ligand sensitive manner. In cancer cells, elevated extracellular stimuli such as epidermal growth factors or pro-inflammatory cytokines that preferentially activate p42/44 or p38 MAPK respectively may result in opposite variations in PRA/PRB expression ratio. These results may explain altered PRA/PRB ratios often associated with breast tumors. To get a mechanistic understanding of how varied PRA/PRB ratio contributes in cell signaling, we generated an original bi-inducible PR-isoform cell model allowing selective, reversible and dose-dependent expression of PRA and/or PRB, enabling fine-tune adjustment of PRA/PRB ratio in the same cells. Using this cell-based system, we undertook genome-wide transcriptomic studies to investigate transcriptional regulation driven by unliganded and liganded PR isoforms. We report that several aspects of PR signaling such as target gene selection/transcriptional regulation, cross-talk with growth factors and antiproliferative efficacy of antiprogestin are highly dependent upon variation in PRA/PRB ratio. A new potential therapeutic strategy in PR-dependent pathological conditions may rely on the use of PR antagonists. Most of the currently available antiprogestins such as mifepristone present partial agonist activity and are not selective to PR leading to undesirable side effects. Therefore, in a collaborative project we have synthesized and characterized several new PR antagonist compounds named as APRn. Structure-activity relationship studies allowed identification of the key substitutions in steroidal skeleton responsible for agonist/antagonist character of these molecules. Several selected APRn lack partial agonist effect, are PR specific and inhibit PR transcriptional properties through a new passive mechanism of action i.e. impaired recruitment of transcriptional coregulators. Such PR selective antagonists devoid of partial agonist character might provide important therapeutic perspectives for various reproductive tract abnormalities and hormone-dependent uterine and breast cancers. Altogehter, our results provide mechanistic insights into the functional selectivity of PR isoforms and their pharmacological targeting by the use of PR antagonists.

Les hormones ovariennes sont impliquées dans le développement du cancer du sein des femmes porteuses de mutations du gène BRCA1. L'étude du tissu mammaire normal de femmes mutées et non mutées nous a permis de montrer des altérations de la signalisation de l'estradiol et la progestérone dans un modèle de greffes chez la souris. Ces dérégulations concernent l'activité proliférative et l'expression des récepteurs hormonaux, et sont hétérogènes d'une patiente mutée à l'autre. De plus, une diminution de l'expression de la forme phosphorylée en sérine 211 du récepteur des glucocorticoïdes a été mise en évidence dans le tissu muté BRCA1. Ces observations posent la question de la place d'unantiprogestatif/anti-glucocorticoïde tel que l'ulipristal acétate (UPA) dans le traitement préventif des femmes mutées pour BRCA1. Les effets de l'UPA ont été caractérisés in vitro dans les cellules mammaires normales pour préciser les conséquences de son utilisation sur le sein. Son action a ensuite été examinée sur les xénogreffes de sein de patientes mutées et non mutées. Nous montrons que l'UPA est capable d'inhiber la prolifération du tissu muté lorsqu'elle est induite par la progestérone. Ce résultat encourage son utilisation dans la prévention tumorale mais indique une spécificité d'action en fonction des dérégulations hormonales associées au tissu muté.

Le récepteur de la progestérone (PR) est un acteur majeur du développement de la glande mammaire. Dans les cellules épithéliales normales, PR est exprimé sous deux isoformes PRA (94 kDa) et PRB (116 kDa) de façon équimolaire. Il est établi que celles-ci ont un impact important sur le développement des cancers du sein, mais leurs rôles dans l’évolution métastatique reste très mal connus. Le ratio d’expression PRA/PRB étant souvent déséquilibré dans les tumeurs mammaires, nous avons analysé le turnover des deux isoformes. Nous avons démontré que PRA et PRB sont les cibles de modifications post-traductionnelles dirigées par les MAPK qui tendent à stabiliser l’une ou l’autre isoforme de manière sélective. Ainsi, Erk1/2 (p42/44) inhibe la dégradation de PRB tandis que la p38 stabilise PRA. Il en résulte que le ratio PRA/PRB varie de façon importante en fonction des signalisations extracellulaires impliquant les facteurs de croissance et les cytokines inflammatoires souvent exacerbés dans les cancers. Pour mieux étudier les effets différentiels de PRA et PRB, nous avons établi un modèle cellulaire original exprimant de manière bi-inductible l’une ou l’autre isoforme de PR, à partir de la lignée cellulaire MDA-MB 231 provenant d’une métastase de cancer du sein. En étudiant les variations induites par PRA ou PRB sur le transcriptome de ces cellules, nous avons identifié les gènes cibles spécifiques de ces isoformes. Parmi-eux se trouvent de nombreux gènes impliqués dans les cancers, notamment agissant sur la prolifération, la survie et la motilité cellulaires comme uPA et PAI-1. De plus, en analysant la migration cellulaire, nous avons mis en évidence un effet pro-migratoire de PRB particulièrement important en absence d’hormone. En recherchant la cause de ces effets, nous avons découvert que PRB était colocalisé et interagissait avec la kinase d’adhésion focale (FAK) qu’il active au niveau des points d’adhésion focaux. Ces travaux soulignent l’incidence du ratio PRA/PRB et du statut du ligand sur les métastases du cancer du sein, aussi bien au niveau de la sélectivité transcriptionnelle que celui des régulations non génomiques impactant la migration cellulaire. Nous suggérons la possibilité de cibler les tumeurs mammaires par des antagonistes sélectifs de PR et des inhibiteurs des voies de signalisation des MAPK ou de FAK. / Progesterone receptor (PR) is a major actor of mammary gland development. PR is equally expressed as two main isoforms PRA (94 kDa) and PRB (116kDa) in the mammary gland epithelium. However, breast cancer progression has been associated with abnormalities of their expression ratio through undefined mechanisms. In this study, using a stably transfected cell line, we showed that PRA and PRB stabilizations are differentially regulated by Erk1/2 (p42/44) and p38 MAPKs respectively, leading to strongly influence PRA/PRB ratio. These results highlight the impact of growth factors and inflammatory cytokines on PRA/PRB imbalance in cancer cells. To study the differential effect of PR isoforms, we established an original bi-inducible cell line expressing either PRA and/or PRB. By analyzing variations induced by PRA and PRB on such cell transcriptomes, we identified the isoform-specific targets genes by DNA microarrays. Most of them are implicated in cancers, notably acting on cell proliferation, survival and motility. Furthermore, focusing our studies on cell migration, we showed that PRB acts as a pro-migratory factor particularly powerful in the absence of ligand. We discovered that PRB colocalized and interacted with the focal adhesion kinase (FAK) that was activated in focal adhesion points. Our results highlight the impacts of both PRA/PRB ratio and ligand status on metastatic evolution, in the contexts of transcriptional regulation as well as non-genomic events. We suggest the possibility to target mammary tumors by PR-selective antagonists and/or inhibitors of MAPK and FAK signalings.

La progression du cancer du sein repose principalement sur la signalisation des œstrogènes et de la progestérone, et les traitements modulant l’action des œstrogènes ont amélioré la survie des patientes atteintes d’un cancer à récepteurs œstrogéniques (ERα). Des études récentes convergent sur le concept selon lequel, dans les cancers du sein ER+, PR (Progesterone Receptor) peut inhiber les fonctions favorisant la croissance induite par l'œstrogène en reprogrammant directement la liaison d'ERα sur de nouveaux gènes cibles. Les données cliniques montrent que cette signature génique est associée à un bon pronostic dans une cohorte de 1.959 patientes atteintes de cancer du sein et qu’un agoniste de la progestérone améliore l'activité antiproliférative des thérapies anti-oestrogéniques1. Ainsi, ces données démontrent qu’ER n’est pas le seul acteur de la tumorigénèse mammaire et qu'il existe une interférence fonctionnelle entre ces deux voies hormonales, soulignant le besoin d’une meilleure compréhension de la signalisation de PR. D’un point de vue mécanistique, l’activité de PR est étroitement liée à l’interaction avec les nucléosomes. En effet, PR fonctionne comme un facteur « pionnier » et se lie à la chromatine au sein de complexes protéiques, régulant son activité transcriptionnelle. Sans progestérone, PR forme un complexe répressif associé à des enzymes modificatrices de la chromatine comme LSD1, HDAC1/2 et la protéine de l'hétérochromatine HP1γ2. En réponse au traitement hormonal, ce complexe est déplacé, ce qui permet de recruter des coactivateurs et des cofacteurs associés, qui modifient la structure de la chromatine locale et entraînent l'activation ou la répression des gènes cibles de PR. Nous avons identifié un nouveau régulateur de la signalisation de la progestérone, l'arginine méthyltransférase PRMT1, enzyme souvent surexprimée dans les cancers mammaires3,4. Par diverses approches in vitro et in vivo, nous avons montré une interaction directe entre PR et PRMT1, dans le noyau des cellules tumorales mammaires, et à la fois en absence d’hormone et après 1h de stimulation à la progestérone. De plus, PRMT1 apparaît comme un nouveau membre du complexe répressif sur la chromatine, associé à PR et à ses partenaires, dans un sous-ensemble de gènes inductibles par la progestérone. Nos résultats indiquent également que l’expression de PRMT1 affecte l’activité transcriptionnelle de PR et que son inhibition perturbe l’activation rapide de la voie de la protéine kinase après une stimulation progestative. Nous montrons pour la première fois que PR est méthylé sur un résidu arginine, conservé parmi les récepteurs nucléaires (R637), localisé dans son domaine de liaison à l'ADN. La production d’un anticorps dirigé contre la forme méthylée de PR nous a permis de préciser qu’elle se localisait dans le noyau des cellules et n’était retrouvée qu’après traitement progestatif. En outre, la mutation de R637 de PR entraine une diminution de l’expression d'un sous-ensemble de cibles de PR, ce qui entraine un retard de croissance cellulaire. En conclusion, ces résultats confirment l'implication de PRMT1 et de son activité méthyltransférase dans la signalisation de PR et plus particulièrement dans son activité transcriptionnelle. Nous démontrons donc que la méthylation sur résidus d'arginine est un nouveau mécanisme de contrôle lors de la réponse à la progestérone dans les cellules tumorales mammaires / Breast cancer progression is mainly driven by estrogen and progesterone signalling and therapies modulating oestrogen‘s action have improved the survival of ER+ cancer patients. As progesterone receptor (PR) is an ER target gene, its expression in breast cancer was considered as a predictive marker of ER functionality. However, recent studies are converging on the concept that PR can directly affect ER functions in breast cancer cells1. Activated PR can redirect ER to novel chromatin binding sites associated with cell differentiation and apoptosis, leading to a potential improvement of the tumour response to anti-oestrogen therapies. In considering the differential effects of progesterone in breast cancer, it is important to define the variable might influence progesterone pathway and the downstream mediators involved in this signalling. Recently, Beato and al reported that, in breast cancer cells, the unliganded form of PR (non-activated with progesterone) bind to genomic sites and target a repressive complex containing enzyme modifying chromatin as the demethylase LSD1 or the Heterochromatin Protein 1 (HP1γ)2. Under hormonal treatment, this complex is displaced, which makes it possible to recruit coactivators and associated cofactors, which modify the structure of the local chromatin and cause the activation or repression of the target genes of PR. In addition, cellular response to progesterone is also regulated by receptor post-translational modifications that may affect its stability, its subcellular localization and its interactions with regulators. In our study, we demonstrated for the first time that PR is methylated on arginine residues, by the arginine methyltransferase PRMT1. We identified as target the arginine 637 (R637), a conserved arginine among nuclear receptor superfamily, located in the DNA-binding domain of the receptor. By in vitro and in vivo approaches, we are studying the impact of PRMT1 on PR signalling pathways. In T47D breast cancer cells, we demonstrated that PR interacts with PRMT1, mainly in the nucleus. Of interest, PRMT1 interacts with PR in the nucleus in absence of hormone stimulation and it appears as a new member of the repressive complex on a subset of progesterone inducible genes. Our results also indicate that PRMT1 expression affects PR transcriptional activity and PRMT1 knockdown disrupts the rapid activation of protein kinase pathway after progestin stimulation. The production of an antibody directed against the methylated form of PR allowed us to specify that methylated-PR is localized in the nucleus of cells and was found only after progesterone treatment. Furthermore, PRMT1 depletion and mutation of R637 resulted in an inhibition of a subset of PR-regulated genes which led to retarded cell growth.Our data reveal the impact of PRMT1 expression on PR pathways and provide evidence for the asymmetric arginine dimethylation of PR. We therefore demonstrate that methylation on arginine residues could be a novel control mechanism in the response to progesterone in mammary tumor cells