La voie de réparation NHEJ (Non-Homologous End-Joining) est une voie majeure de réparation des cassures double-brin chez l’homme. Les protéines de cette voie interagissent et forment des complexes dynamiques dont les mécanismes moléculaires sont encore largement méconnus. Nous avons dans un premier temps mis au point des protocoles de production à l’échelle de plusieurs milligrammes des protéines cœur de la voie NHEJ en cellules d’insecte à l’aide du système MultiBac. Nous avons ainsi purifié les complexes Ku70/Ku80 et Ligase4/XRCC4 et les protéines Cernunnos et Artemis à homogénéité. Des essais de cristallisation, des études par SAXS et des analyses par microscopie électronique ont été réalisés sur différents complexes formés par ces protéines cœur du NHEJ. Nous avons également caractérisé par chromatographie d’exclusion de taille et calorimétrie, les interactions effectuées entre les protéines de la voie NHEJ. L’ensemble de ces travaux a permis d’établir des bases biochimiques solides en vue des études structurales et fonctionnelles de la voie NHEJ chez l’homme. / Human DNA repair pathway NHEJ (Non-Homologous End-Joining) is a major pathway of double-strand breaks repair. The proteins involved in this pathway interact and form dynamic complexes whose molecular mechanisms are largely unknown. Firstly, we established protocols to be able to purify milligrams of those NHEJ pathway core proteins using MultiBac insect cells system. We then purified Ku70/Ku80 and Ligase4/XRCC4 complexes, Artemis and Cernunnos to homogeneity. Crystallogenesis assays, SAXS experiments and Transmission Electronic Microscopy experiments have been performed on several complexes formed by these core NHEJ proteins. We also characterized the interactions between these proteins by Size Exclusion Chromatography and Isothermal Calorimetry. These experiments have led to biochemical results sufficient to establish a solid basis to initiate the structural and functional study of the Human NHEJ Pathway.

Chez les eucaryotes, la synthèse des ARN messagers (ARNm) est un processus hautement régulé en réponse à la fixation d’activateurs spécifiques sur des régions régulatrices. Cette étape permet le recrutement de co-activateurs, des facteurs généraux de la transcription (GTFs) et de l’ARN polymérase II (Pol II) pour former le complexe de préinitiation (PIC). Le Médiateur est un complexe co-activateur essentiel à ce processus et bien qu’il ait fait l’objet de nombreuses études ces dernières années, sa complexité a empêché de parvenir à une compréhension détaillée de son mécanisme de fonctionnement in vivo. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à la sous-unité Med17 qui joue un rôle central au sein du module de tête du Médiateur et interagit directement avec la Pol II. Nous avons construit une collection de mutants thermosensibles de cette sous-unité chez la levure Saccharomyces cerevisiae, que nous avons ensuite caractérisés par différentes approches de biologie moléculaire et génomique fonctionnelle. Nos analyses par ChIP-seq montrent que le Médiateur influence indépendamment le recrutement et/ou la stabilisation de la TBP ainsi que des modules cœur et kinase de TFIIH sur le génome. Ces résultats indiquent que, contrairement à la séquence d’assemblage linéaire observée in vitro, l’assemblage du PIC in vivo est un processus à plusieurs étapes non-séquentielles et que le Médiateur est important pour orchestrer l’arrivée des différents composants du PIC. Par ailleurs, nous avons mis en évidence un contact direct entre le Médiateur et Rad2/XPG, une endonucléase qui intervient dans la réparation de l’ADN. Une analyse à l’échelle du génome a révélé que cette protéine est présente sur les gènes de classe II, en absence de stress génotoxique et que sa localisation génomique corrèle avec celle du Médiateur. Nous avons ainsi démontré que le Médiateur est important pour le recrutement de Rad2, suggérant un nouveau rôle pour ce complexe dans la réparation de l’ADN, en plus de son rôle de co-activateur dans la transcription par la Pol II. / In eukaryotes, the synthesis of messenger RNA (mRNA) is highly regulated in response to the binding of specific activators to regulatory regions. This step allows the recruitment of coactivators, general transcription factors (GTFs) and RNA polymerase II (Pol II) to form the preinitiation complex (PIC). Mediator is a co-activator complex essential to this process and although it has been studied intensively during the last few years, its complexity has precluded a detailed understanding of the molecular mechanisms of its function in vivo. During my PhD, I focused on the Med17 subunit which plays a central role within the Mediator head module and interacts directly with Pol II. We obtained a large collection of temperature-sensitive mutants of this subunit in the yeast Saccharomyces cerevisiae, and then characterized these mutants by different molecular biology and functional genomics approaches. Our ChIP-seq analyses show that Mediator influences independently the recruitment and/or the stabilization of TBP as well as TFIIH core and kinase modules on the genome. These results indicate that, unlike a linear sequence observed in vitro, in vivo the PIC assembly is a non-sequential multistep process and that Mediator is important to orchestrate the recruitment of different PIC components. Furthermore, we identified a direct contact between Mediator and Rad2/XPG, an endonuclease involved in DNA repair. A genome-wide analysis reveals that this protein is present on class II genes in the absence of genotoxic stress, and that its genomic localization correlates with that of Mediator. We thus demonstrated that Mediator is important for Rad2 recruitment, suggesting a new role for this complex in DNA repair, in addition to its co-activator role in Pol II transcription.

Excision Repair Cross-Complementation group 1 (ERCC1) est une enzyme de réparation de l’ADN fréquemment déficiente dans le cancer bronchique non-à-petites cellules. Bien qu’une expression faible d’ERCC1 soit prédictive de réponse aux sels de platine, l’efficacité des chimiothérapies à base de platine est limitée par leur toxicité et l’apparition de résistance, justifiant la nécessité de stratégies thérapeutiques alternatives. Par ailleurs, l’absence de test compagnon diagnostic permettant d’évaluer la fonctionnalité d’ERCC1 dans la pratique clinique empêche actuellement toute thérapie personnalisée basée sur le statut ERCC1.Afin d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les tumeurs ERCC1-déficientes en exploitant le concept de létalité synthétique, des screens à haut-débit , utilisant des composés pharmaceutiques ou par ARN interférence, ont été réalisés dans un modèle isogénique de CBNPC déficient en ERCC1. Cette approche a permis d’identifier plusieurs inhibiteurs de poly(ADP-ribose) polymerase 1 et 2 (PARP1/2), tels l’opalarib (AZD2281), le niraparib (MK-24827) et BMN 673 comme sélectifs pour les cellules ERCC1-déficientes. Les mécanismes sous-tendant cette sensibilité sélective ont été étudiés, et les résultats suivants ont été mis en évidence : (i) les cellules ERCC1-déficientes présentent un blocage prolongé en phase G2/M après exposition à l’olaparib ; (ii) l’isoforme 202 d’ERCC1, dont le rôle a été récemment mis en évidence dans la résistance aux sels de platine, module également la sensibilité aux inhibiteurs de PARP ; (iii) la déficience en ERCC1 est épistatique avec les défauts de recombinaison homologue (RH), malgré une capacité normale des cellules ERCC1-déficientes à former des foyers RAD51 ; ceci suggère qu’ERCC1 pourrait intervenir dans la réparation d’une lésion de l’ADN induite par l’inhibiteur de PARP1/2 en amont de l’invasion du brin d’ADN lors de la RH ; (iv) l’inhibition de l’expression de PARP1 par ARN interférence permet de restaurer la résistance aux inhibiteurs de PARP1/2, dans les cellules ERCC1-déficientes uniquement. Ces résultats suggèrent que les inhibiteurs de PARP1/2 pourraient représenter une nouvelle stratégie thérapeutique chez les patients dont la tumeur est déficiente en ERCC1 et un essai clinique va être mis en place pour évaluer cette hypothèse.Afin d’explorer la présence de biomarqueurs de la fonctionnalité d’ERCC1, quatre approches ont été entreprises en parallèle dans le modèle isogénique de CBNPC déficient en ERCC1: (i) irradiation aux UV, afin d’évaluer la voie NER (Nucleotide Excision Repair); (ii) séquençage d’exome, dans le but de rechercher une signature génomique (ADN) ; (iii) analyse du transcriptome cellulaire, pour identifier des modifications d’expression d’ARN ; et (iv) SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture) afin de comparer le protéome des cellules ERCC1-déficientes et ERCC1-proficientes. Ces approches ont permis d’identifier une potentielle signature génomique, ainsi que de biomarqueurs d’activité – guanine deaminase (GDA) et nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT). De plus amples validations et investigations mécanistiques de ces observations préliminaires sont actuellement requises. / Excision Repair Cross-Complementation group 1 (ERCC1) is a DNA repair enzyme that is frequently deficient in non-small cell lung cancer (NSCLC). Although low ERCC1 expression correlates with platinum sensitivity, the clinical effectiveness of platinum therapy is limited - mainly by toxicities and occurrence of resistance - highlighting the need for alternative treatment strategies. In addition, the lack of a reliable assay evaluating ERCC1 functionality in the clinical setting currently precludes personalising therapy based on ERCC1 status. To discover new synthetic lethality-based therapeutic strategies for ERCC1-defective tumours, high-throughput drug and siRNA screens in an isogenic NSCLC model of ERCC1 deficiency were performed. This approach identified multiple clinical poly(ADP-ribose) polymerase 1 and 2 (PARP1/2) inhibitors such as olaparib (AZD-2281), niraparib (MK-4827) and BMN 673 as being selective for ERCC1 deficiency. The mechanism underlying ERCC1-selective effects was dissected by studying molecular biomarkers of tumour cell response, and revealed that: (i) ERCC1-deficient cells displayed a significant delay in double-strand break repair associated with a profound and prolonged G2/M arrest following PARP1/2 inhibitor treatment; (ii) ERCC1 isoform 202, which has recently been shown to mediate platinum sensitivity, also modulated PARP1/2 sensitivity; (iii) ERCC1-deficiency was epistatic with homologous recombination deficiency, although ERCC1-deficient cells did not display a defect in RAD51 foci formation. This suggests that ERCC1 might be required to process PARP1/2 inhibitor induced DNA lesions prior to DNA strand invasion; and (iv) PARP1 silencing restored PARP1/2 inhibitor resistance in ERCC1-deficient cells but had no effect in ERCC1-proficient cells, supporting the hypothesis that PARP1 might be required for the ERCC1 selectivity of PARP1/2 inhibitors. This study indicated that PARP1/2 inhibitors as a monotherapy could represent a novel therapeutic strategy for NSCLC patients with ERCC1-deficient tumours, and a clinical protocol is being written to evaluate this hypothesis.To investigate whether a surrogate biomarker of ERCC1 functionality could be developed, four parallel approaches were undertaken in the ERCC1-isogenic NSCLC model: (i) UV irradiation, to evaluate the Nucleotide Excision Repair (NER) pathway; (ii) whole exome sequencing, to look for an ERCC1-associated genomic scar at the DNA level; (iii) transcriptomic analysis, to investigate changes at the RNA expression level; and (iv) SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture) analysis, to compare proteomic profiles between ERCC1-proficient and ERCC1-deficient cells. These approaches allowed the identification of putative genomic signature and potential metabolic surrogate biomarkers - guanine deaminase (GDA) and nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT). Further validation and mechanistic investigations of these latter preliminary observations are warranted.

L’ADN, support de l’information génétique, est constamment altéré par des agents physiques ou chimiques d’origines endogènes (métabolisme) et exogènes (UV, radiations ionisantes, produits chimiques) dont les effets sont génotoxiques. Ces modifications structurales délétères de l’ADN sont éliminées par de nombreux mécanismes de réparation. Parmi eux, le système de réparation par excision de bases (BER) est initié par les ADN glycosylases qui reconnaissent et éliminent les bases endommagées. Dans certaines stratégies anti-cancéreuses, l’utilisation de la chimiothérapie et la radiothérapie ont pour but la destruction des cellules cancéreuses en altérant leur ADN. Dans ce contexte, les ADN glycosylases réparent l’ADN des cellules traitées et induisent une résistance non désirée au traitement, faisant de ces enzymes des cibles thérapeutiques intéressantes. Le but de ces travaux est d’approfondir la compréhension des mécanismes de réparation des ADN glycosylases de la superfamille structurale Fpg/Nei grâce à la modélisation moléculaire et de pouvoir identifier et concevoir des inhibiteurs de ces enzymes. Les simulations de dynamique moléculaire (DM) nous ont permis d’étudier la « Lesion Capping Loop » (LCL) et de l’associer à la stabilisation de la base endommagée positionnée dans le site actif. Nous avons également étudié les chemins de sortie possibles de la base après coupure par l’enzyme et l’implication de la boucle LCL dans ce phénomène grâce à des simulations de DM ciblée (TMD-1). De plus, les simulations de DM couplées à un protocole d’amarrage moléculaire « aveugle » nous ont permis d’identifier 2 sites de fixations possibles majoritaires pour des petites molécules potentiellement inhibitrices. Un de ces sites correspondant au site actif de hNEIL1 a fait l’objet d’un criblage virtuel d’une partie de la base de molécules Ambinter. Ceci nous a permis d’identifier des molécules potentiellement inhibitrices dont les effets seront prochainement testés in vitro dans l’équipe sur la protéine humaine hNeil1. / The DNA, genetic information support, is frequently damaged by physical or chemical agents from endogenous (cell metabolism) and exogenous (UV, ionizing radiations, chemicals) factors whose effects are genotoxic. These deleterious DNA structural alterations are removed by many DNA repair mechanisms. Among them, the base excision repair (BER) is initiated by DNA glycosylases which recognize and remove damaged bases. In some anti-cancer strategies, the use of chemo- and radiotherapy is aimed to cancerous cells destruction by altering their DNA. In that specific context, DNA glycosylases repair the DNA of treated cells and induce unwanted resistance to treatments, making these enzymes interesting therapeutic targets. The purpose of this work is to deepen the repair mechanism knowledge of Fpg/Nei structural superfamily of DNA glycosylases using molecular modeling and designing inhibitors of these enzymes. Molecular dynamic simulations allowed us to study the « Lesion Capping Loop » (LCL) and to associate its role to substrate stabilization in the enzyme active site. We also studied some possible excision’s product release pathways and LCL implication in this phenomena by targeted molecular dynamic simulations (TMD-1). Furthermore, molecular dynamic simulations coupled to a blind molecular docking protocol allowed us to identify 2 possible main binding sites of potential inhibitiors. One of these binding sites corresponding to the hNEIL1 active site has been the object of a virtual screening of the Greenpharma database. This allowed us to identify potential inhibitors whom effects will be soon tested in vitro on the humain protein hNEIL1.

L'ADN peut être endommagé par des facteurs environnementaux ou intrinsèques au fonctionnement des cellules. Ces facteurs induisent différents types de lésions dont les cassures double brins (CDBs). Les CDBs sont particulièrement dangereuses pour les cellules et une réparation inefficace ou non précise de ces cassures peut entraîner des mutations ou des translocations qui peuvent être à l'origine de cancer. Afin d'éviter l'instabilité génétique que peuvent induire les CDBs, les cellules ont développé deux principaux mécanismes de réparation: la ligature d'extrémités non homologues (NHEJ pour non homologous end joining) et la recombinaison homologue (HR pour homologous recombination). L’utilisation de l’un ou de l’autre de ces mécanismes est finement régulée et une dérégulation de cet équilibre induit une importante instabilité génomique.Tous ces mécanismes ont lieu dans le noyau des cellules qui, chez les mammifères est fortement hétérogène, comportant différents compartiments et des régions où la chromatine est plus ou moins compacte. Cette hétérogénéité implique que la réparation de l’ADN doit pouvoir être efficace dans différents contextes nucléaires. Au cours de ma thèse, j’ai étudié l’influence de l’architecture nucléaire sur le choix des mécanismes de réparation des CDBs. J’ai montré d’une part que la protéine appartenant au pore nucléaire Nup153 influence l’équilibre entre HR et NHEJ et d’autre part que la position d’une CDB influe sur le choix du mécanisme de réparation.Mes résultats démontrent que l’organisation des gènes dans le noyau est un nouveau paramètre à prendre en compte dans l’étude des mécanismes de réparation de l’ADN et de tumorigénèse. / DNA is constantly assaulted by various damaging agents, leading to different types of lesions including double-strand breaks (DSBs). DSBs are the most harmful lesions to the cells and their inaccurate or inefficient repair can trigger genomic instability and tumorigenesis. To cope with DSBs, cells evolved several repair pathways, including non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). A fine regulation of the balance between these two pathways is necessary to avoid genomic instability.All of these mechanisms happen in the nucleus, which is highly heterogeneous in mammalian cells. Indeed, it encompasses several compartments and regions of various chromatin compaction levels. My PhD project focused on the influence of nuclear architecture on DNA repair pathway choice. I demonstrated on one hand that the nuclear pore protein Nup153 influences the balance between HR and NHEJ and on the other hand that the position of a DSB influences the choice of the repair pathway that will be used.My results demonstrate that gene positioning is a new important parameter in the study of DNA repair and tumorigenesis.

Chez les plantes, les méristèmes ont la capacité de se diviser tout au long de la vie de la plante, qui peut dépasser 1000 ans pour certaines espèces. De plus, la lignée germinale n'est pas définie dès l'embryogenèse mais provient des cellules méristématiques et s’individualise relativement tard au cours du développement. Il est donc crucial que le cycle cellulaire soit finement régulé afin d'éviter une accumulation de mutations au cours de la croissance végétative et de la reproduction. Chez tous les eucaryotes, les protéines CDT1 sont impliquées dans l’initiation de la réplication de l'ADN en permettant la formation du complexe de pré-réplication et l'ouverture de la fourche de réplication avant le recrutement des ADN polymérases. Leur activité est strictement régulée afin que chaque partie du génome soit répliquée une fois et une seule au cours de la phase S. Le génome d’Arabidopsis thaliana code pour deux protéines homologues du facteur d’initiation de la réplication CDT1 (CDC10 Target1) : AtCDT1a et AtCDT1b. La sur-expression de CDT1a stimule la réplication de l’ADN et, chez Arabidopsis, cette protéine aurait une double fonction dans la régulation du cycle cellulaire et dans la division des plastes. Nous avons étudié ici les fonctions respectives de AtCDT1a et AtCDT1b. En utilisant des approches génétiques, nous avons montré que ces deux protéines jouent des rôles partiellement redondants pour maintenir l’intégrité du génome et permettre le développement des gamétophytes. De plus, en réalisant une approche de TAP (Tandem Affinity Purification), nous avons montré qu’elles interagissent avec l’ADN polymérase ε, une ADN polymérase réplicative, ouvrant de nouvelles perspectives de recherche concernant le rôle des protéines CDT1de plantes lors de la réplication de l'ADN. En parallèle, nous avons essayé d'élucider les spécificités de CDT1a et plus précisément de son extension N-terminale qui est absente de CDT1b. Nous avons constaté que ce domaine de CDT1a est requis pour son interaction avec l'ADN pol ε, et que les mutants cdt1a complémentés par une version tronquée de la protéine présentent une croissance considérablement réduite, un arrêt prématuré du méristème racinaire, et un stress de l'ADN constitutif, ce qui suggère que l’interaction CDT1a/pol ε est indispensable à la progression normale de la phase S. L’ensemble de nos résultats ont révélé de nouvelles fonctions pour les homologues de CDT1 de plantes. Une question importante sera de déterminer si celles-ci sont caractéristiques du cycle cellulaire chez les plantes, ou si nous avons identifié de nouveaux mécanismes qui sont conservés chez tous les eucaryotes. / In plants, meristems retain the ability to divide throughout the life cycle of plants, which can last for over 1000 years in some species. Furthermore, the germline is not laid down early during embryogenesis but originates from the meristematic cells relatively late during development. Thus, accurate cell cycle regulation is of utmost importance to avoid the accumulation of mutations during vegetative growth and reproduction. In all eukaryotes, CDT1 proteins are involved in the onset of DNA replication by allowing the formation of the pre-replication complex and subsequent opening of the replication fork. Their activity is strictly regulated to ensure faithful duplication of the genome during S-phase. The Arabidopsis thaliana genome encodes two homologs of the replication licensing factor CDT1 (CDC10 Target 1): AtCDT1a and AtCDT1b. Overexpression of CDT1a stimulates DNA replication, and this protein would have a function both in cell cycle regulation and plastid division.Here, we have investigated the respective roles of Arabidopsis CDT1a and CDT1b. Using genetic approaches, we have shown that the two proteins function partially redundantly to maintain genome integrity and allow gametophyte development. In addition, using Tandem Affinity Purification, we have shown that they interact with DNA pol ε, a replicative DNA polymerase, opening further research prospects regarding the role of plant CDT1 proteins during DNA replication. In parallel, we have tried to elucidate the specificities of CDT1a and more precisely of its N-terminal extension that is absent from CDT1b. We have found that this domain of CDT1a is required for its interaction with DNA pol ε, and that cdt1a mutants complemented with a truncated version of the protein show drastically reduced growth, premature meristem arrest, and constitutive DNA stress, suggesting that the CDT1a/pol ε interaction is indispensible to the normal progression of S-phase. Together, our results have unraveled new functions for plant CDT1 homologues, and one important aspect of future research will be to determine whether these are features of the plant cell cycle, or if we have identified new mechanisms that are conserved in all eukaryotes.

Les systèmes CRISPR-Cas confèrent aux bactéries une immunité adaptative contre les éléments génétiques mobiles jouant ainsi un rôle important dans l’évolution bactérienne. Cependant, moins de la moitié des génomes bactériens encodent des systèmes CRISPR-Cas ; cela, malgré la protection qu’ils confèrent et leur haut taux de transfert horizontal. Des hypothèses telles que le coût des phénomènes d’auto-immunité ou de posséder des défenses adaptatives plutôt qu’innées ont été mises en avant pour expliquer ce paradoxe. Je propose une nouvelle hypothèse complémentaire : le contexte génétique jouerait un rôle important dans la fixation d’un système CRISPR-Cas après son transfert. Plus précisément, j’ai étudié comment les interactions entre les systèmes de réparation de l’ADN et les CRISPR-Cas influencent la distribution de ces derniers. Pour cela, j’ai d’abord examiné finement la distribution des systèmes CRISPR-Cas dans les génomes bactériens. J’ai ensuite analysé les co-occurences des systèmes de réparation de l’ADN et des CRISPR-Cas et démontré l’existence d’associations positives et négatives entre eux. Enfin, je me suis concentrée sur une des associations négatives découvertes pour valider mes prédictions expérimentalement et comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents. Mes travaux permettent de mieux comprendre les interactions complexes entre systèmes de réparation de l’ADN et CRISPR-Cas et démontrent la nécessite d’accommodation des CRISPR-Cas à un contexte génétique pour être sélectionnés et maintenus dans les génomes bactériens. / CRISPR-Cas systems confer bacteria and archea an adaptative immunity against phages and other invading genetic elements playing an important role in bacterial evolution. Only 47% of bacterial genomes harbor a CRISPR-Cas system despite their high rate of horizontal transfer. Hypothesis such as the cost of autoimmu- nity or the trade off between a constitutive or an inducible defense system have been put forward to explain this paradox. I propose that the genetic background plays an important role in the process of maintaining a CRISPR-Cas system af- ter its transfer. More precisely I hypothesized that CRISPR-Cas systems interact with DNA repair pathways. To test this idea, we detected DNA repair pathways and CRISPR-Cas systems in bacterial genomes and studied their co-occurences. We report both positive and negative associations that we interpret as poten- tial antagonistic or synergistic interactions. We then focused on one interaction to validate our result experimentally and explored molecular mechanisms behind those interactions. My findings give insights on the complex interactions between CRISPR-Cas systems and DNA repair mechanisms in bacteria and provide a first example on the necessity of accommodation of CRISPR-Cas systems to a specific genetic context to be selected and maintained in bacterial genomes.

Le but d’un traitement anticancéreux est d’être spécifique et efficacité dans la durée vis-à-vis des cellules tumorales. De nombreux agents chimiothérapeutiques ont rencontré des obstacles quant à leur utilisation en raison de leur toxicité pour les cellules saines ou de la résistance développée par les cellules cancéreuses. Cela souligne la nécessité de développer des médicaments alternatifs. Notre laboratoire a développé une classe d'inhibiteurs de réparation de l'ADN, Dbait, qui agissent en détournant et en hyperactivant les protéines de la réparation de l’ADN, telles que la protéine PARP et DNA-PK. Cela conduit en conséquence à des modifications de la chromatine, visualisées par la phosphorylation pan-nucléaire de l’histone H2AX, et en l’inhibition du recrutement aux sites des dommages de plusieurs protéines de réparation. AsiDNA, une forme active de Dbait, sensibilise les tumeurs aux radiations, à la chimiothérapie, à la thérapie ciblée, sans effet sur les cellules non tumorales et les tissus sains. Dans la mesure où la chimiothérapie consiste en des traitements cycliques de l'agent anti-cancéreux, l'objectif de cette étude était d'étudier in vitro les conséquences d’un traitement répété d’AsiDNA sur les cellules tumorales et non tumorales, plus particulièrement pour ce qui concerne l’émergence de clones tumoraux résistants ou inversement de clones non tumoraux devenus sensibles au traitement. Dans un premier temps, nous avons conçu des expériences dans le but d'isoler des clones résistants au traitement par AsiDNA. Nous montrons que des traitements cycliques ne conduisent pas à des clones résistants, mais au contraire à la sélection de cellules tumorales caractérisées par une hyper sensibilité à l'AsiDNA. Cette sensibilité acquise est stable dans le temps et n'a jamais été observée en traitant des cellules non tumorales. Afin d’identifier le(s) mécanisme(s) responsable(s) de cette sensibilité acquise, nous avons comparé des cellules de sein non tumorales (MCF-10A) et tumorales triples négatives (MDA-MB-231) après 3 trois cycles de traitement par AsiDNA. Nous montrons que les traitements cycliques d'AsiDNA causent une inhibition de l'expression génique, essentiellement au niveau de gènes impliqués dans la réparation de l'ADN, le cycle cellulaire et la prolifération. Néanmoins, aucune différence dans la capacité de réparation de l'ADN, la progression du cycle cellulaire et le taux de prolifération n'est observable. Les cellules cancéreuses augmentent les voies métaboliques énergétiques pour produire d’énergie nécessaire à leur prolifération. En tenant compte du fait que l’expression de certains gènes impliqués dans les voies métaboliques sont aussi dérégulées par le traitement cyclique d’AsiDNA, nous avons émis l’hypothèse que l’épuisement métabolique pouvait être responsable de la sensibilisation des cellules tumorales à l’AsiDNA. Une étude du métabolome a révélé une dérégulation de plusieurs métabolites incluant NAD+. Nous montrons que cette dérégulation bioénergétique est responsable de l'hypersensibilité acquise des cellules cancéreuses suite au traitement par AsiDNA. Une étude bioénergétique des cellules tumorales non traitées et sélectionnées après les traitements cycliques par AsiDNA confirment une diminution de glycolyse aérobique et de la phosphorylation oxydative dans ces dernières. En conséquence de cette réduction énergétique, les cellules cancéreuses ont perdu leur caractère malin, ce qui est démontré par une inhibition de la migration et de la formation de tumeur. Nous montrons que les cellules tumorales dérivées de traitements cycliques par AsiDNA sont dépourvues de cellules souches cancéreuses dont les caractéristiques sont leur résistance aux drogues et leur phénotype invasif. En conclusion, à côté de son rôle dans l'inhibition de la réparation de l'ADN, AsiDNA interfère également avec le métabolisme énergétique des cellules cancéreuses. / The goal of anti-cancer treatment is long term specificity and efficacy towards cancer cells. Many of the clinically available chemotherapy have encountered obstacles due to their toxicity towards healthy cells or to development of resistance by the cancer cells. This emphasizes the need for development of alternative drugs. Our laboratory developed an original class of DNA repair inhibitor, Dbait, that acts by hijacking and hyper activating DNA repair proteins involved in repairing DNA breaks, such as PARP and DNA-PK. Consequently, this leads to chromatin modification, as revealed by pan-nuclear phosphorylation of H2AX, and inhibition of the recruitment at the damage site of several DNA repair proteins at the damage site. AsiDNA, an active form of Dbait linked to a cholesterol moiety, sensitizes tumours, and not non-tumour cells, to radiation, chemotherapy, targeted therapy. As most of clinical protocols of chemotherapy involve cyclic treatments, the aim of this study was to investigate consequences of cyclic AsiDNA treatment in vitro on non-tumor and tumor cells, conditions that experience cancer patients during chemotherapy. Particular emphasis was paid to emergence of resistant clones during cyclic AsiDNA treatment of tumour cells and emergence of toxicity toward normal cells. At first, various tumor and non-tumor cells were exposed to cyclic treatments consisting of one week of treatment and one week of drug-free recovery. After few cycles of treatment, we didn’t observe toxicity toward normal cells and we failed to isolate resistant clones to AsiDNA from tumor cells. Importantly, this treatment protocol induced resistance of MDA-MB-231 cells to imatinib or PARPi. Unexpectedly, we observed that sensitivity to AsiDNA increased with repeated cycles in tumor cells. This acquired sensitization was stable over time and was never observed in non-tumor cells. In an attempt to understand the specific and acquired sensitization of tumor cells along treatment, we compared non-tumor (MCF-10A) and triple-negative breast cancer (MDA-MB-231) cells that were exposed (3CAsiDNA) or not (3CMT) to 3 rounds of AsiDNA. Transcriptome analysis of MDA-MB-231 revealed global downregulation of transcription after cyclic AsiDNA treatment. Although the expression of genes involved in DNA repair, cell cycle and proliferation, was highly affected, strikingly no clear difference in DNA repair capacity, cell cycle or proliferation rate was observed between MDA-MB-231_3CAsiDNA and MDA-MB-231_3CMT. In contrary, modification of gene expression was weakly affected in non-tumor cells.As impaired DNA repair capacity or cell cycle deregulation couldn’t explain this acquired sensitivity, therefore alternative mechanisms should account for the higher mortality of cyclic treated AsiDNA cells. Cancer cells upregulate energy metabolic pathways to produce enough energy for cell proliferation and repair. Noteworthy, AsiDNA is a PARP activator requiring NAD+ consumption. Based on the fact that metabolic pathways were also deregulated at the transcriptional level, we hypothesized that metabolic exhaustion may be responsible for AsiDNA induced sensitization. Metabolome study revealed deregulation of several metabolites including NAD+. We showed that this bioenergetics deregulation is responsible for increasing sensitivity to AsiDNA. Bioenergetics study confirmed low metabolic activity after repeated AsiDNA treatment due to deregulating aerobic glycolysis and oxidative phosphorylation. As a consequence of energetic deprivation, cancer cells deregulated their malignant behavior by inhibition of migration and tumor formation. We showed that 3CAsiDNA tumor cells are depleted of cancer stem cells, which features are responsible of drug resistance and cancer invasive phenotype. Altogether, we demonstrated that AsiDNA, beside its role in DNA repair inhibition, also interferes with energy metabolism in cancer cells.

La réparation de l’ADN par excision des nucléotides (NER) est un mécanisme capable de retirer une large variété de lésions causant une distorsion de la double hélice, comme celles causées par les rayons ultraviolets (UV). Comme toutes les voies de réparation de l’ADN, la NER contribue à la prévention de la carcinogénèse en prévenant la mutation de l’ADN. Lors de ce processus, il y a d’abord reconnaissance de la lésion par la protéine XPC/Rad4 (humain/levure) qui recrute ensuite TFIIH. Ce complexe déroule l’ADN par son activité hélicase et recrute l’endonucléase XPG/Rad2 ainsi que d’autres protéines nécessaires à l’excision de l’ADN. Lors de son arrivée au site de lésion, XPG/Rad2 déplace XPC/Rad4. TFIIH agit également lors de la transcription de l’ADN, entre autres par son activité hélicase. Outre cette similarité de la présence de TFIIH lors de la transcription et la réparation, il est possible de se demander en quoi les deux voies sont similaires. Nous nous sommes donc intéressés aux interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN. Nous avons donc entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de ces interactions. Nous avons découvert que Rad2 et Rad4 possèdent un motif d’interaction en nous basant sur d’autres interactions de la sous-unité Tfb1 de TFIIH. Par calorimétrie à titrage isotherme, nous avons observé que les segments de ces deux protéines contenant ce motif interagissent avec une grande affinité au domaine PH de Tfb1. Le site de liaison de ces segments sur Tfb1PH est très semblable au site de liaison du domaine de transactivation de p53 et au domaine carboxy-terminal de TFIIEα avec Tfb1PH, tel que démontré par résonance magnétique nucléaire (RMN). De plus, tous ces segments peuvent faire compétition les uns aux autres pour la liaison à Tfb1PH. Nous avons aussi démontré in vivo chez la levure qu’une délétion de Tfb1PH crée une sensibilité aux radiations UV. De plus, la délétion de multiples segments de Rad2 et Rad4, dont les segments d’interaction à Tfb1PH, est nécessaire pour voir une sensibilité aux rayons UV. Ainsi, de multiples interactions sont impliquées dans la liaison de Rad2 et Rad4 à TFIIH. Finalement, les structures des complexes Rad2-Tfb1PH et Rad4-Tfb1PH ont été résolues par RMN. Ces structures sont identiques entre elles et impliquent des résidus hydrophobes interagissant avec des cavités peu profondes de Tfb1PH. Ces structures sont très semblables à la structure de TFIIEα-p62PH. Ces découvertes fournissent ainsi un lien important entre la transcription et la réparation de l’ADN. De plus, elles permettent d’émettre un modèle du mécanisme de déplacement de XPC/Rad4 par XPG/Rad2 au site de dommage à l’ADN. Ces connaissances aident à mieux comprendre les mécanismes de maintient de la stabilité génomique et peuvent ainsi mener à développer de nouvelles thérapies contre le cancer. / The nucleotide excision repair pathway (NER) is a mechanism capable of removing a wide variety of helix-distorting lesions, such as those caused by ultraviolet irradiation (UV). As all DNA repair pathways, NER contributes to the prevention of carcinogenesis by preventing DNA mutation. During this process, the lesion is first recognized by the protein XPC/Rad4 (human/yeast), which then recruits TFIIH. This complex unwinds the DNA with its helicase activity and then recruits the endonuclease XPG/Rad2 and other proteins necessary for DNA excision. Upon arrival at the lesion site, XPG/Rad2 displaces XPC/Rad4. TFIIH also acts in DNA transcription, using its helicase activity. In addition to the similarity of the presence of TFIIH in transcription and DNA repair, it is possible to ask ourselves how the two pathways are similar. We were interested in the interactions involving TFIIH and the DNA repair machinery. We have therefore undertaken a structural and functional characterization of these interactions. We have found that Rad2 and Rad4 have a motif of interaction based on other interactions of the Tfb1 subunit of TFIIH. Using isothermal titration calorimetry, we found that segments of these two proteins containing this motif interact with high affinity to the PH domain of Tfb1. The binding site of these segments is very similar to Tfb1PH binding site of transactivation domain of p53 and the carboxyl-terminal domain of TFIIEα with Tfb1PH, as demonstrated by nuclear magnetic resonance (NMR). In addition, these segments can compete with each other for binding to Tfb1PH. We also demonstrated in vivo that deletion of Tfb1PH in yeast creates a sensitivity to UV irradiation. In addition, the deletion of multiple segments of Rad2 and Rad4, including segments of interaction Tfb1PH, is required to observe a sensitivity to UV. Thus, multiple interactions are involved in the binding of TFIIH to Rad2 and Rad4. Finally, the structures of the Rad2-Tfb1PH and Rad4-Tfb1PH complexes were solved by NMR. These structures are identical to each other and involve hydrophobic residues interacting with shallow grooves on Tfb1PH. These structures are very similar to the structure of TFIIEα-p62PH. These findings provide an important mechanistic link between transcription and DNA repair. In addition, they provide a model of the mechanism of the displacement of XPC/Rad4 by XPG/Rad2 at the damaged site. This knowledge helps to better understand the mechanisms of genomic stability and can lead to novel cancer therapies.

Comparativement au génome contenu dans le noyau de la cellule de plante, nos connaissances des génomes des deux organelles de cette cellule, soit le plastide et la mitochondrie, sont encore très limitées. En effet, un nombre très restreint de facteurs impliqués dans la réplication et la réparation de l’ADN de ces compartiments ont été identifiés à ce jour. Au cours de notre étude, nous avons démontré l’implication de la famille de protéines Whirly dans le maintien de la stabilité des génomes des organelles. Des plantes mutantes pour des gènes Whirly chez Arabidopsis thaliana et Zea mays montrent en effet une augmentation du nombre de molécules d’ADN réarrangées dans les plastides. Ces nouvelles molécules sont le résultat d’une forme de recombinaison illégitime nommée microhomology-mediated break-induced replication qui, en temps normal, se produit rarement dans le plastide. Chez un mutant d’Arabidopsis ne possédant plus de protéines Whirly dans les plastides, ces molécules d’ADN peuvent même être amplifiées jusqu’à cinquante fois par rapport au niveau de l’ADN sauvage et causer un phénotype de variégation. L’étude des mutants des gènes Whirly a mené à la mise au point d’un test de sensibilité à un antibiotique, la ciprofloxacine, qui cause des bris double brin spécifiquement au niveau de l’ADN des organelles. Le mutant d’Arabidopsis ne contenant plus de protéines Whirly dans les plastides est plus sensible à ce stress que la plante sauvage. L’agent chimique induit en effet une augmentation du nombre de réarrangements dans le génome du plastide. Bien qu’un autre mutant ne possédant plus de protéines Whirly dans les mitochondries ne soit pas plus sensible à la ciprofloxacine, on retrouve néanmoins plus de réarrangements dans son ADN mitochondrial que dans celui de la plante sauvage. Ces résultats suggèrent donc une implication pour les protéines Whirly dans la réparation des bris double brin de l’ADN des organelles de plantes. Notre étude de la stabilité des génomes des organelles a ensuite conduit à la famille des protéines homologues des polymérases de l’ADN de type I bactérienne. Plusieurs groupes ont en effet suggéré que ces enzymes étaient responsables de la synthèse de l’ADN dans les plastides et les mitochondries. Nous avons apporté la preuve génétique de ce lien grâce à des mutants des deux gènes PolI d’Arabidopsis, qui encodent des protéines hautement similaires. La mutation simultanée des deux gènes est létale et les simples mutants possèdent moins d’ADN dans les organelles des plantes en bas âge, confirmant leur implication dans la réplication de l’ADN. De plus, les mutants du gène PolIB, mais non ceux de PolIA, sont hypersensibles à la ciprofloxacine, suggérant une fonction dans la réparation des bris de l’ADN. En accord avec ce résultat, la mutation combinée du gène PolIB et des gènes des protéines Whirly du plastide produit des plantes avec un phénotype très sévère. En définitive, l’identification de deux nouveaux facteurs impliqués dans le métabolisme de l’ADN des organelles nous permet de proposer un modèle simple pour le maintien de ces deux génomes. / Compared to the nuclear genome, very little is known about the genomes of the two plant cytoplasmic organelles, the plastid and the mitochondria. Indeed, very few factors involved in either the replication or the repair of these genomes have been identified. Here we show the implication of the Whirly protein family in the maintenance of organellar DNA. Indeed, mutations in Whirly genes lead to DNA rearrangements in both Arabidopsis thaliana and Zea mays plastids. These rearrangements are the product of microhomology-mediated break-induced replication that rarely occurs in wild-type plants but increases in absence of Whirly proteins. In a mutant plant devoid of plastidial Whirly proteins, these new DNA molecules can be amplified up to fifty times the normal DNA level and cause a variegated phenotype. In the course of the study of the Whirly mutant plants, we developed a strategy, based on the use of the antibiotic ciprofloxacin, to induce DNA double-strand breaks specifically in plant organelles. The Arabidopsis mutant plants without Whirly proteins in the plastids are more sensitive to the antibiotic ciprofloxacin than wild-type plants. Accordingly, there is a much larger increase in the number of rearranged DNA molecules in the plastids of the mutant plants than in the control plants. Surprisingly, while the mutant plants devoid of Whirly proteins in the mitochondria do not show increased sensitivity to the drug, they do accumulate more rearrangements in their mitochondrial DNA compared to wild-type plants. These results suggest that the Whirly proteins are involved in the repair of DNA double-strand breaks in the plant organelle genomes. Our study of the plant organelle genome stability has lead us to a family of proteins homologous to the DNA polymerase I in bacteria. This family has been proposed to be responsible for most of the DNA-synthesis activity in the plant organelles. We bring genetic proof to support this hypothesis using mutants of the two PolI genes of Arabidopsis. The combined mutation of both genes is lethal and the single mutations cause a decrease in the relative DNA levels in the organelles, thus confirming the involvement of both genes in DNA replication. Interestingly, mutants of the PolIB but not PolIA gene shows increase sensitivity to ciprofloxacin suggesting a function in DNA repair. In line with these results, a cross between a PolIB mutant and the mutant of plastid Whirly genes resulted in plants with severe growth defects and numerous rearrangements in the plastid DNA. In conclusion, we have identified two factors involved in the metabolism of organelle DNA and proposed a simple model of how these genomes are maintained in the plant cell.