Titre de l'écran-titre (visionné le 13 décembre 2023) / Dans le domaine de la résistance aux antifongiques, il est important de comprendre la dynamique entre l'épistasie et les trajectoires évolutives afin de pouvoir prédire comment les pathogènes fongiques évoluent pour résister à ces traitements. Dans ce projet, nous avons voulu comprendre le lien entre épistasie au niveau des protéines et les mutations du gène FCY1 qui conduisent à la résistance à l'antifongique 5-fluorocytosine (5-FC). Nous avons utilisé le Deep Mutational Scanning pour systématiquement générer tous les variants de codons possibles à certaines positions du gène FCY1 de cinq champignons. Cette librairie de mutants a été criblée contre le 5-FC afin d'identifier les mutations qui conduisent à sa résistance ou qui maintiennent sa sensibilité. En comparant le phénotype lié à chaque mutation dans chaque orthologue de FCY1, nous avons pu identifier des mutations épistatiques : des mutations qui ont des effets différents entre les orthologues. En général, un faible pourcentage des mutations créées étaient des mutations épistatiques. De plus, plus deux orthologues divergent sur le plan évolutif, plus il y a de mutations épistatiques. Nous avons également observé des liens inattendus entre la divergence des orthologues de FCY1 et l'effet sur le fitness des mutations épistatiques. Des travaux comme les nôtres peuvent contribuer à orienter les futurs modèles de prédiction de la résistance en étoffant les bases de données de mutations causant la résistance et en nous informant sur le taux de confiance de l'effet d'une mutation dans un pathogène. / In the field of antifungal resistance, understanding the dynamics between epistasis and evolutionary trajectories is of importance to predict how fungal pathogens evolve to resist antifungals. In this project, we wanted to understand how epistasis at the protein level influences which mutations in the FCY1 gene lead to resistance to the antifungal 5- fluorocytosine (5-FC). We used Deep Mutational Scanning to systematically generate all possible codon variants at specific positions in the FCY1 gene of five fungi. This library of mutants was screened against 5-FC to identify which mutations lead to its resistance or maintained sensitivity. By comparing the phenotype related to each mutation in each FCY1 ortholog, we identified epistatic mutations: mutations that have different effects between orthologs. In general, a low percentage of mutations created were epistatic mutations. In addition, the more two orthologs diverge evolutionary, the more epistatic mutations there are. We also observed unexpected links between divergence of the FCY1 orthologs and the patterns of fitness effects of epistatic mutations. Work like ours can help guide future prediction models by making databases more robust and by informing us about the confidence rate of the effect of a mutation in a pathogen.

Les virus influenza A et B sont les agents étiologiques des infections grippales saisonnières. Ils sont à l'origine d'infections sévères qui peuvent requérir des mesures d'interventions thérapeutiques. Le baloxavir est le dernier agent antiviral approuvé pour le traitement de l'influenza. Il cible l'activité endonucléase de la polymérase acide (PA), une des sous-unités du complexe de l'ARN polymérase virale. Alors que le baloxavir s'est montré plus efficace dans la réduction de l'excrétion virale que l'oseltamivir, qui est le traitement standard de la grippe, il a néanmoins démontré une faible barrière de résistance. Les phases d'étude cliniques du baloxavir ont montré que l'émergence de la résistance au baloxavir était principalement médiée par des substitutions au codon 38 (I38T/S/M) de la protéine PA chez les virus influenza A. La résistance reste encore peu documentée dans le cas des virus influenza B. Ce projet de recherche vise à générer et à caractériser la résistance au baloxavir *in vitro*, *ex vivo* et *in vivo* chez des virus influenza B contemporains représentant les deux lignées principales B/Yamagata/16/1988 et B/Victoria/2/1987. Dans le but d'induire la résistance au baloxavir, les virus B/Phuket/2073/2013 (Yamagata) et B/Quebec/MCV-11/2019 (Victoria) ont subi des passages successifs sur cellules MDCK-ST6-Gal1 en présence de concentrations croissantes de baloxavir. A des passages séctionnés, le gène codant pour PA a été séquencé pour identifier d'éventuelles mutations associées à la résistance. Le phénotype de résistance au baloxavir a été évalué par le test de réduction des plaques (CI50). Un système de génétique inverse a été mis au point pour la souche vaccinale contemporaine B/Washington/02/2019 (Victoria) pour confirmer l'effet des mutations de résistance identifiées. Dans un second temps, des virus recombinants B/Washington/02/2019 et B/Phuket/2073/2013 ont été utilisés pour évaluer les capacités réplicatives des virus sauvages et de leurs mutants PA-I38T respectifs, *in vitro*, sur des lignées cellulaires de poumons humains (A549 et Calu-3), puis *ex vivo* en utilisant un modèle d'épithélium nasal humain (MucilAir®). L'infectivité a été mesurée en titrant les lavages nasaux de cobayes infectés avec les différents virus. Chez la souche B/Quebec/MCV-11/2019, la mutation PA-I38T a été générée après 6 passages en présence d''une concentration finale de baloxavir de 200 nM. Les capacités réplicatives *in vitro*, *ex vivo* et *in vivo* ont montré que la mutation PA-I38T n'impacte pas le fitness viral de manière significative chez les virus influenza B à l'étude. Ces résultats démontrent une similitude des mécanismes de résistance au baloxavir chez les virus influenza A et B. L'absence d'effet délétère sur la réplication et le fitness viral relativement préservé des mutants arborant la substitution PA-I38T met en garde contre d'éventuelles éclosions de tels variants, ainsi qu'un risque de dissémination dans la population générale. Il est donc nécessaire de surveiller activement sa présence en clinique. / Influenza A and B viruses are the causative agents of seasonal flu infections, often leading to severe illnesses and necessitating therapeutic interventions. Baloxavir is the latest antiviral agent approved for influenza treatment. It targets the endonuclease activity of the polymerase acidic (PA) protein, one of the subunits of the viral RNA polymerase complex. While Baloxavir has demonstrated greater efficacy in reducing viral shedding than oseltamivir, the standard flu treatment, it has shown a low resistance barrier. Clinical trials have revealed that resistance to Baloxavir primarily arises through substitutions at codon 38 (I38T/S/M) of the PA protein in Influenza A viruses. Resistance in Influenza B viruses remains poorly documented. This research project aims to generate and characterize Baloxavir resistance *in vitro*, *ex vivo*, and *in vivo* in contemporary Influenza B viruses of both B/Yamagata/16/1988-like and B/Victoria/2/1987-like lineages. To induce Baloxavir resistance, B/Phuket/2073/2013 (Yamagata) and B/Quebec/MCV-11/2019 (Victoria) viruses underwent serial passages on MDCK-ST6-Gal1 cells in the presence of increasing Baloxavir concentrations. At selected passages, the PA gene was sequenced to identify potential resistance-associated mutations. The resistance phenotype was assessed by plaque reduction assays (IC50). A reverse-genetics system was developed for the B/Washington/02/2019 vaccine strain (Victoria) to confirm the effect of identified resistance mutations. Subsequently, recombinant viruses of recent B/Washington/02/2019 and B/Phuket/2073/2013 strains were used to evaluate the replicative abilities of wild-type and their respective PA-I38T mutant viruses in vitro using human lung cell lines (A549 and Calu-3) and *ex vivo* using a human nasal epithelium model (MucilAir®). Infectivity was measured by titrating nasal washes from experimentally-infected guinea pigs. In the B/Quebec/MCV-11/2019 strain, the PA-I38T mutation was generated after 6 passages in the presence of 200 nM Baloxavir. Replicative abilities in vitro, ex vivo, and in vivo showed that the PA-I38T mutation does not significantly impact the viral fitness of the studied Influenza B viruses. These results demonstrate similarity in Baloxavir resistance mechanisms between influenza A and B viruses. The lack of deleterious effects on viral replication and the relatively preserved fitness of the PA-I38T mutation raise concerns about potential outbreaks of such variants and their dissemination in the general population. Hence, active surveillance of its presence in clinical settings is essential.

Dans ce mémoire, les capacités réplicatives de virus saisonniers de sous-types N H1N1 et A/H3N2 résistants à l'oseltamivir ont été étudiées au moyen d'expériences in vitro simples et de modélisation mathématique. Pour la souche A/Brisbane/ 59/2007 (H1N1) nous avons démontré que la mutation H274Y de la neuraminidase (NA), responsable de la majorité des cas de résistance à l'oseltamivir, cause une augmentation de la latence d'environ 7 h comparé à seulement 1 à 3 h pour le virus sauvage. Cette latence augmentée est compensée par une infectivité augmentée d'environ 12 fois par rapport au virus sauvage. Ces résultats, obtenus à l'aide d'un modèle mathématique, fournissent une explication sur la dissémination de la mutation H274Y dans les souches saisonnières de virus A/ H1N1 depuis 2007-2008. Nous avons aussi étudié les capacités réplicatives in vitro pour des souches A/California/7/2004 (H3N2) résistantes à l'oseltamivir isolées d'un patient immunosupprimé. La perte de capacité réplicative causée par le simple mutant E119V est partiellement compensée chez le double mutant E119V-I222V La croissance du double mutant E119V-I222V en milieu liquide est similaire à celle du virus sauvage alors que le simple mutant accuse un retard de croissance d'environ 12 h. Les tailles des plages de lyses en milieu semi-solide sont systématiquement plus petites pour le simple mutant E119V et plus grosses pour le double mutant E119V-I222V L'effet cytopathique commence entre 24 et 36 h pour le virus sauvage et le double mutant mais seulement à 48 h pour le simple mutant. Finalement, l'activité enzymatique de la NA du double mutant (ratio Vmax : 0,51 par rapport à la souche sauvage) est augmentée de 47% comparé à celle du simple mutant (ratio Vmax : 0,04).

La leishmaniose est une menace pour la santé d'environ 1 milliard d'individus globalement et son contrôle est précaire. L'un des points culminants de ce contrôle est le traitement des cas par la chimiothérapie. Seulement 4 composés sont actuellement recommandés pour traiter la leishmaniose. L'utilisation de ces composés est restreinte par leur coût, la complexité d'administration et par l'émergence de résistance. Il y a donc un besoin urgent de nouvelles molécules pour traiter la leishmaniose. L'étude de la résistance fourni une multitude d'informations qui peut permettre d'ajuster les traitements et le développement de nouvelles molécules. En effet l'étude de la résistance permet l'identification de marqueurs de résistance, de choisir les composantes d'une multithérapie de façon à contrer l'émergence de résistance et même de dévoiler les cibles thérapeutiques de certains composés. Dans le cadre de la présente thèse, deux méthodes génomiques pour faire l'étude de la résistance ont été utilisées, soit le séquençage de génomes de souches cliniques résistantes et l'application du Cos-Seq (un criblage génomique par gain de fonction) sur des molécules nouvelles ou repositionnées ayant une activité anti-Leishmania. Cela a permis l'identification de marqueurs de résistance, et de cibles thérapeutiques. Le séquençage de génomes de parasite résistants a mis en lumière une insertion de 2 nucléotides dans le gène de l'aquaglycéroporine AQP1. Des expériences d'édition de l'ADN ont validé AQP1 comme marqueur de la résistance à l'antimoine chez les souches cliniques. La technique de Cos-seq a été utilisé avec un composé GSK TCMDC 143295 et a mis en lumière la sous-unité régulatrice RPN1, une composante clé du protéasome. Le niveau de résistance observé suite à la transfection de RPN1, l'interaction drogue-RPN1 telle qu'observée par protection à la trypsine, et l'essentialité du gène RPN1 nous porte à croire qu'il s'agit de la cible thérapeutique de TCMDC 143295. L'approche Cos-seq a également été utilisée avec six drogues repositionnées et actives contre le Leishmania. Les résultats les plus probants sont les suivants. Nous avons réussi à isoler la cible de la terbinafine soit la squalene époxydase ERG1. Cette même époxydase conférait une hyper susceptibilité au kétoconazole. Nous avons isolé un cosmide enrichi avec une sélection avec la tafenaquine qui code pour une NAD synthase et qui pourrait s'avérer sa cible. Finalement nous avons isolé des cosmides, suite à une sélection avec le tamoxifène et l'allopurinol, qui codent respectivement pour des transporteurs ABC et des transporteurs membranaires. Des études supplémentaires détermineront si ces différents gènes enrichis lors du crible sont des cibles ou des mécanismes de résistance. Bien que de plus amples expérimentations seront nécessaire afin de consolider les informations recueillies dans la présente thèse, elles sont tout de même déjà des pistes solides pour mieux orienter le développement ou l'amélioration de nouvelles molécules ainsi que l'approche de traitement des leishmanioses. Cela démontre une fois de plus l'utilité d'étudier la résistance pour permettre une meilleure approche du contrôle de la leishmaniose.

Thèse en cotutelle, doctorat en sciences des aliments : Université Laval, Québec, Canada, Philosophiæ doctor (Ph. D.) et Museum national d'histoire naturelle,75005 Paris, France / L'émergence de bactéries multirésistantes (BMR) est un risque majeur pour la santé humaine et animale. Le problème est exacerbé par le besoin croissant de produits alimentaires, poussant l'industrie agricole à utiliser de plus en plus d'antibiotiques en réponse à la demande. De multiples pistes de recherche sont explorées pour répondre à l'urgence croissante de la situation, dont celle des bactériocines. Ces peptides antimicrobiens d'origine bactérienne présentent des spectres d'activité étroits et leur présence naturelle dans le microbiote de nombreux mammifères en font des candidats prometteurs. Actuellement, le potentiel des microcines, bactériocines des Enterobacteriaceae, est peu étudié. Ces peptides exercent leur activité antibactérienne sur d'autres Enterobacteriaceae qui sont considérées comme des menaces urgentes et sérieuses par le « Centre for Disease Control » (CDC). Par conséquent, l'objectif principal de cette thèse est de déterminer si les microcines sont une solution pertinente à la crise des antibiotiques, que ce soit comme remède provisoire ou comme mesure plus durable. Quatre microcines différentes ont été choisies pour ce projet : la microcine C (McC= un peptide nucléotidique inhibiteur de l'aspartyl ARNt synthase ; la microcine B17 (MccB17) un peptide portant des cycles thiazole et oxazole inhibiteur de l'ADN gyrase ; la microcine J25 (MccJ25) un peptide lasso inhibiteur de l'ARN polymérase et enfin la microcine E492 (MccE492) un peptide sidérophore qui cible la membrane interne par association avec le transporteur de mannose ManYZ. Dans un premier temps, nous avons produit et purifié les microcines. Ensuite, nous avons caractérisé l'efficacité des microcines contre une collection d'Enterobacteriaceae composée de différents pathogènes et BMR. Ces dernières regroupaient des souches Escherichia coli, Salmonella enterica et Klebsiella pneumoniae provenant de différents environnements, humain, animal, hôpitaux etc... Il a été observé qu'aucune des souches utilisées dans l'étude n'ait capable de résister aux quatre microcines, dans la marge de concentrations testée (jusqu'à 50 μg/mL). McC a montré le spectre d'activité le plus large, alors que la MccJ25 a montré la plus faible concentration minimale inhibitrice. Nous avons ensuite testé l'activité inhibitrice de différentes combinaisons de microcines ou de microcines avec des antibiotiques ayant des mécanismes d'action différents dont le but d'identifier des consortia à effet synergique ou additif. Aucun antagonisme n'a été observé alors que plusieurs combinaisons ont présenté des effets partiellement synergiques. Sur la base de cette étude phénotypique, aucune corrélation n'a été observée entre la résistance aux microcines et les phénotypes de résistance aux antibiotiques. Une étude génomique a été menée pour mieux évaluer la relation entre la résistance aux antibiotiques et la résistance aux microcines. Les séquences des génomes globaux de toutes les souches cibles ont été déterminées et analysées en utilisant différents programmes bio-informatiques. Les séquences de tous les gènes codant des protéines impliquées dans la biosynthèse des microcines et leurs mécanismes d'action ont été comparées. On a constaté que 48,5% de tous les phénotypes résistants aux microcines observés sont corrélés avec des changements significatifs des gènes codant pour les cibles de la microcine dans la cellule inhibée. Une étude non ciblée a été menée pour explorer tout nouvel élément génétique responsable de la résistance aux microcines. Il a été confirmé qu'aucun gène de virulence ou AMR n'était impliqué dans la résistance aux microcines. En outre, 28,5% de tous les phénotypes de résistance aux microcines observés étaient liés à de nouveaux éléments génétiques impliqués dans la réponse au stress, le métabolisme du sucre et / ou les systèmes toxine/anti-toxine. Enfin, nous avons analysé l'impact des microcines et par extension des bactériocines sur l'hôte dans un modèle in vivo porcin. L'impact de la microcine J25 et la nisine ont été étudié sur des porcelets en sevrage en comparaison avec deux traitements contrôles (antibiotique et sans traitement). Les traitements par antibiotique et MccJ25 ont montré les meilleures performances de croissance chez les porcelets, suivi du traitement par la nisine. Aucune différence significative dans la composition du microbiote n'a été observée au niveau des phyla. Cependant, le traitement nisine a présenté un impact négatif sur le genre Streptococcus. Parallèlement, les différents traitements n'avaient pas d'impact sur la composition des acides gras à chaîne courte. Le traitement ATB a montré le plus fort impact au niveau du métabolome fécal des porcelets. En conclusion, cet ensemble de travaux représente une approche holistique de l'évaluation du potentiel des microcines en tant qu'alternative aux antibiotiques. Ainsi, les spectres d'activité, les mécanismes de résistance et l'impact des microcines ont été caractérisés avec un haut niveau de précision, plus approprié pour les antimicrobiens à spectre étroit. / The emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria is a major risk to human and animal health. The problem is exacerbated by the growing need for food, pushing the agricultural industry to use more and more antibiotics in response to an increasing human population. Multiple avenues of research are being explored to respond to the growing urgency of the situation, including bacteriocins. They exhibit narrow activity spectra and their natural presence in the microbiota of many mammals make them promising candidates. Currently the potential of microcins, a member of the bacteriocin family, is poorly studied. They are generally produced from Enterobacteriaceae to target other Enterobacteriaceae that are considered urgent and serious threats by the (CDC) Center for Disease Control. Therefore, the main objective of this thesis is to determine whether microcins are a plausible solution to the antibiotic crisis, either as an interim remedy or as a more durable measure. Four different microcins were chosen for this project; McC a nucleotide peptide and inhibitor of tRNA synthase; MccB17 a thiazole oxazole modified microcin (TOMM) that inhibits DNA Gyrase; MccJ25 a lasso peptide and RNA polymerase inhibitor and finally MccE492 a siderophore peptide that targets the inner membrane through stable association with the mannose transporter ManYZ. Initially, the effectiveness of microcins was characterized against a collection of Enterobacteriaceae composed of different pathogens and MDR strains. These were natural isolates of the medically pertinent Escherichia coli, Salmonella enterica and Klebsiella pneumoniae species, and from a variety of environments such as human, animal, hospitals, etc. It was observed that none of the strains used in the study were able to with stand all four microcins, within the tested range of concentrations (up to 50 μg/mL). McC had the widest activity spectra and MccJ25 had the lowest minimum inhibitory concentration. Furthermore, microcin inhibition varied between bacteriostatic and bactericidal for all tested microcins. Moreover, we tested whether these microcins can be combined with each other or with other antibiotics of different mechanisms of action to increase their activity. No antagonism was observed, and multiple partially synergistic effects were recorded, mostly in microcin antibiotic consortia. Based on this phenotypic study, no correlation was observed between microcin resistance and antibiotic resistance phenotypes. Second, a genomic study was conducted to better assess the relationship between antibiotic resistance and microcin resistance to confirm whether there is potential crossover. The genetic sequences of all genes involved in microcin biosynthesis, and their mechanisms of action were compared. It was found that 48.5% of all observed microcin-resistant phenotypes correlated with significant changes in genes encoding microcin partners in the target cell. Then a (GWAS) Genome Wide Association Study was conducted to explore any novel genetic element responsible for resistance to microcins. It was confirmed that no virulence or (AMR) antimicrobial resistance genes were involved in microcin resistance. In addition, 28.5% of all microcin resistance phenotypes observed were related to novel genetic elements involved in stress response, sugar metabolism and/or (TA) toxin-antitoxin systems. Finally, we sought to analyse the impact of microcins and by extension bacteriocins on the host in an in vivo porcine model. The impact of two bacteriocin treatments (NIS, Nisin and MIC, MccJ25) were studied on weaning piglets compared with two control treatments (ATB, antibiotic) and (SAB, without treatment). The ATB and MIC treatments showed the strongest growth in piglet weights, followed by the NIS and SAB treatment. No significant shifts to the microbiota compositions were observed on the phyla level, albeit with a negative impact of NIS on the Streptococcus genus. Additionally, there was no significant impact of the treatments on the composition of Short Chain Fatty Acids(SCFAs), yet the ATB treatment presented the most distinct metabolome profile. This suggest that both MccJ25 and Nisin are able to yield similar health benefits to weaning pigs as antibiotics while better preserving their gut homeostasis. In conclusion, this body of work represents a holistic approach to the evaluation of the potential of microcins as an alternative to antibiotics. Whereby, the activity spectra, resistance mechanisms and impact of microcins was characterised with a high level of precision, more appropriate for narrow spectrum antimicrobials.

Streptococcus pneumoniae est le pathogène bactérien le plus important des voies respiratoires chez les adultes et les enfants causant la pneumonie, la bronchite et l’otite de l’oreille moyenne. Cette bactérie est responsable d’une morbidité et d’une mortalité importante, entre autres, chez les jeunes enfants. La prévalence générale des souches de pneumocoques résistants et multirésistants est en hausse dans le monde compliquant la thérapie antimicrobienne vis-à-vis cette bactérie. Face à cette problématique, nous avons voulu caractériser les mécanismes de résistance à la ciprofloxacine (CIP), la tétracycline (TC) et la tigécycline (TGC) chez des mutants sélectionnés en laboratoire et des souches cliniques afin de potentiellement découvrir de nouvelles cibles diagnostiques de la résistance vis-à-vis ces molécules. L’approche génomique utilisée dans cette thèse (séquençage de génome et transformation) a permis de faire la caractérisation génotypique et phénotypique des mutants résistants aux trois antibiotiques utilisés dans l’étude. Cette approche, en plus de préciser le rôle des mutations dans les gènes parC et gyrA dans la résistance à la CIP, a permis de déterminer que le pneumocoque peut mettre en place des mécanismes de résistance secondaires le rendant résistant à la CIP et à la TC. En effet, l’acquisition d’une mutation dans le gène spr1902 protège la bactérie contre les dérivés réactifs à l’oxygène (ROS) induit par la CIP. De plus, la surexpression de PatA/PatB ainsi que la présence de mutations dans l’opéron du transporteur PatA/PatB induit de faibles niveaux de résistance à la CIP et à la TC, en absence de tetM et tetO. Un lien a également été établi entre la résistance à la TC et la surexpression de gènes de la voie de biosynthèse de la thiamine chez des souches de S. pneumoniae non-sensibles à la TC. Finalement, les mécanismes de résistance à la TGC ont été décrit, pour la première fois, chez le pneumocoque (mutations dans la protéine ribosomale S3 (rpsC ; spr0195), S10 (rpsJ; spr0187), l’ARNr 16S et une méthyltransférase de l’ARNr 16S hypothétique (spr1784). Ceuxi-ci causent une résistance croisée aux TCs de première et deuxième génération. Dans cette thèse, nous avons mis en lumière de nouveaux marqueurs de la résistance aux antibiotiques chez S. pneumoniae. / Streptococcus pneumoniae is a Gram-positive pathogen responsible for pneumonia, bronchitis and otitis media leading to considerable morbidity and mortality among children and adults. The prevalence of resistant and multi-resistant strains increases worldwide impairing antimicrobial treatments toward this bacterium. We characterised resistance to ciprofloxacin (CIP), tetracycline (TC) and tigecycline (TGC) in laboratory-derived resistant mutants and unsusceptible clinical isolates to further our comprehension of resistance mechanisms and potentially uncover new therapeutic and diagnostic targets toward these drugs. The genomic approaches used in this thesis (genome sequencing and DNA transformation) allowed the phenotypic and genotypic characterisation of mutants resistant to three antibiotics. By this approach, the role of parC and gyrA mutations in CIP resistance was confirmed and even extended and it was also possible to determine that S. pneumoniae may select secondary mechanisms of resistance to CIP and TC besides target-site mutations. Acquisition of a mutation in spr1902 is shown to protect the bacteria against oxygen-reactive species induced by CIP. Furthermore, overexpression of the ABC transporter PatA/PatB and mutations in the coding region of this transporter confer low-level resistance to CIP and TC. A link was also established between TC resistance and overexpression of genes involved in the thiamine biosynthesis and salvage pathway in S. pneumoniae TC non-susceptible isolates. Finally, for the first time, the mechanisms of resistance to TGC in S. pneumoniae were described (mutations in ribosomal protein S3 (rpsC; spr0195), S10 (rpsJ: spr0187), 16S ribosomal RNA (rRNA) and a putative 16S rRNA methyltransferase). These confer cross-resistance to first and second generation TCs. This work highlights new markers of antibiotic resistance in S. pneumoniae.

Les virus influenza ont toujours eu un impact considérable sur l’humanité. Les virus influenza B (IB) ont longtemps été négligés et sous-estimés par rapport aux virus influenza A (IA). Ils ne représentent que 10 à 20% des infections annuelles par les virus influenza, mais peuvent devenir majoritaire certaines années et entrainer des symptômes similaires à ceux des virus IA. Les inhibiteurs de la neuraminidase (INA) sont les principaux traitements disponibles contre les virus influenza. Cependant, à la suite de mutations, certains virus influenza ont développé des mécanismes de résistance limitant dangereusement les options thérapeutiques. Actuellement, très peu de souches résistantes sont isolées en clinique car le fitness de ces virus résistants, c’est-à-dire leur capacité à se répliquer et se transmettre, est altéré. Or, il a été montré que des virus IA peuvent améliorer leur fitness et propager le phénotype de résistance. L’objectif de ce projet de thèse est de mieux comprendre la résistance des virus influenza B et son impact sur le fitness viral afin de mieux prévenir l’émergence de souches résistantes. Nous avons, dans un premier temps, étudié la résistance des virus influenza A et B au peramivir, le plus récent des INA. Nous avons confirmé que cette molécule est hautement active contre les souches saisonnières A et B. De plus, elle conserve une activité antivirale in vitro contre certaines souches virales ayant une sensibilité réduite ou hautement réduite contre d’autres INA (l’oseltamivir et le zanamivir). Dans un second temps, nous avons étudié le fitness de virus influenza B contemporains résistants in vitro et chez la souris. Nous avons montré que certains virus influenza B, ayant un phénotype de résistance croisée, peuvent maintenir un fitness similaire à celui du virus sauvage in vitro et in vivo. De plus, nous avons pu décrire et analyser un nouveau mécanisme de résistance chez les virus influenza B observé chez un cas clinique. Ces résultats soulignent la dangerosité de notre dépendance aux INA et nous encouragent à faire évoluer les stratégies thérapeutiques.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le projet de recherche vise à répondre aux nécessités des productions avicoles. La coccidiose aviaire cause chaque année de lourdes pertes économiques. En plus d'être un facteur de risque important de l'entérite nécrotique, elle diminue les performances zootechniques des poulets de chair (Gallus gallus). Elle est d'autant plus préoccupante qu'elle engendre des fientes liquides infectantes, ce qui demande aux aviculteurs une gestion de leur production plus consciencieuse. Avec les anticoccidiens toujours utilisés aujourd'hui, les phénomènes de résistance sont de plus en plus fréquents chez le parasite Eimeria. Aujourd'hui, de nombreuses alternatives naturelles sont en cours de caractérisation. Cette étude a permis l'évaluation de nouveaux produits ainsi que d'outils permettant aux aviculteurs de mieux évaluer l'efficacité des traitements en fonction du statut de résistance observé dans leur production. Le projet de recherche a permis de montrer l'efficacité anticoccidienne du produit naturel Entero-V, un produit commercialisé contenant un mélange d'huiles essentielles. Le produit a permis de montrer son efficacité en combinaison avec un programme de vaccination. Il a aussi permis de mettre en application de nouvelles méthodes d'analyse in vitro, telles que les tests d'invasion, de viabilité, mais aussi de sporulation, et de prouver leur utilité pour évaluer l'efficacité anticoccidienne d'un produit. Il a été montré que les souches de champs à l'étude avaient un risque d'être devenues au cours du temps résistantes à différents traitements : l'amprolium et le zoalène. / The research project aims to meet the needs of poultry production. Avian coccidiosis causes heavy economic losses every year. In addition to being an important risk factor for necrotic enteritis, it decreases the zootechnical performance of broiler chickens (Gallus gallus). It is even more worrying as it generates infective liquid droppings, which requires poultry farmers to manage their production more conscientiously. Anticoccidials are still used today, but resistance phenomena are more and more frequent with the Eimeria parasite. Today many natural alternatives are being characterized. This study allowed the evaluation of new products and tools for poultry farmers to better assess the anticoccidials efficacy according to the resistance status observed in their production. The research project demonstrated the anticoccidial efficacy of the natural product Entero-V, an essential oil blend. It has demonstrated its effectiveness in conjunction with a vaccination program. It also made it possible to use in vitro tests for the anticoccidial property of a natural product. Regarding the resistance status of the Eimeria field strains, it was shown that the field strains had a risk of becoming resistant to different treatments over time: amprolium and zoalene.

Les inhibiteurs de neuraminidase (INAs) sont présentement la seule classe d’antiviral disponible commercialement pour traiter et prévenir les infections à virus influenza saisonnières et pandémiques. Le virus pandémique de 2009 était naturellement résistant aux adamantanes, mais sensible à l’oseltamivir et au zanamivir. Toutefois, plus de 1.5% de cas de résistance à l’oseltamivir ont été recensés suite à l’utilisation de l’antiviral en traitement ou en prophylaxie. La plupart d’entre eux possèdent une mutation ponctuelle (cytosine par thymidine) à la position 823, qui est à l’origine de la substitution d’une histidine par une tyrosine à la position 275 dans la séquence d'acides aminés de la neuraminidase (H275Y). Étant donné que le nombre d'antiviraux disponibles pour traiter et prévenir les infections à virus influenza est très limité (le zanamivir est le seul antiviral disponible commercialement pour traiter les souches pandémiques résistantes aux adamantanes et à l'oseltamivir), il est très important de comprendre les mécanismes qui causent la résistance aux INAs et d'établir un programme qui permet de surveiller l'évolution des souches résistantes aux antiviraux. / One class of anti-influenza agents; the neuraminidases inhibitors (NAIs), is the only choice commercially available for treatment and prophylaxis of seasonal and pandemic influenza infections. The pandemic 2009 Influenza virus, A(H1N1)pdm09, was naturally resistant to adamantanes but susceptible to the NAI: oseltamivir and zanamivir. However, more than 1.5% of cases of oseltamivir resistance have been reported during treatment and prophylaxis and most of them carried a single nucleotide mutation (cytosine to thymidine) at position 823 that resulted in a histidine to tyrosine mutation at position 275 in the neuraminidase sequence (H275Y). Considering that the number of available anti-influenza drugs is very restricted (zanamivir is now the only commercially available drug for treatment of the adamantane- and oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 strains), it is important to understand mechanisms of resistance to NAIs and to perform a surveillance program for evolution of such drug-resistant variants.

Les méthodes classiques de traitement contre le cancer, telle que la chimiothérapie (CT), sont utilisées dans le but d'enrayer la tumeur. L'Adriamycine (ADR ou doxorubicine), un agent anticancéreux, agirait entre autres en s'intercalant entre les bases d'ADN, en inhibant la topoisomérase II et en causant la production de stress oxydatif. Plusieurs effets secondaires indésirables seraient reliés à l'utilisation de ADR comme par exemple la cardiotoxicité à des doses cumulatives de 500 mg/m². Une autre limite importante du traitement de CT est la résistance pléiotropique aux médicaments (MDR), qui peut être causée entre autres par la surexpression de protéines de résistance aux médicaments tel que la MRP, Les protéines MRP, comme la MRP l, expulseraient ADR hors des cellules tumorales ce qui diminuerait son efficacité et nécessiterait l'élévation de la dose optimale de traitement, causant ainsi une augmentation de la toxicité aux tissus sains. L'hyperthermie (HT) qui consiste à élever artificiellement la température tumorale (40 à 45°C), permettrait de contourner ce phénomène MDR et ciblerait les cellules tumorales sans affecter les cellules saines. HT sensibiliserait les cellules résistantes et non résistantes aux agents anticancéreux, en augmentant la perméabilité membranaire, l'accumulation intracellulaire des agents de CT, et en inhibant la réparation de l'ADN. CT et HT mèneraient à la mort des cellules cancéreuses par activation de l'apoptose. Cependant, les mécanismes apoptotiques spécifiquement impliqués dans la mort des cellules cancéreuses lors de traitement par ADR et/ou HT ne sont pas entièrement connus et ont tenté d'être éclaircis dans le cadre de ce projet tant chez les cellules d'adénocarcinomes cervicaux non résistants (HeLa) que résistants (HeLa MRP+). Dans cette étude, la voie du récepteur de mort Fas a été la voie apoptotique d'intérêt. C'est pourquoi l'implication des différentes protéines apoptotiques de cette voie ont été étudiées comme le récepteur Fas ainsi que son ligand (FasL), la protéine adaptatrice de domaine de mort associée à Fas (FADD), les caspases 8 et 3. De plus, la recherche des causes d'activation de la voie du récepteur Fas a mené à l'investigation des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Lors de la présente étude, une augmentation de l'expression membranaire de FasL, de FADD ainsi que de l'activité de la caspase 8 ont été observées suite au traitement par ADR (après 1, 2 et 8 h respectivement). Les résultats obtenus montrent une activation précoce de la voie des récepteurs de mort après 1 à 2 h, contrairement à celle de la voie mitochondriale qui serait plus tardive après 18 h. La phase d'exécution de l'apoptose se produit après 18 h d'exposition. La quantification des ROS chez les HeLa exposées à ADR a montré que l'anion superoxyde (O2°-) serait le ROS principalement produit. Cette production pourrait activer la voie des récepteurs de mort puisqu'elle serait la cause de l'augmentation de l'expression de FasL. En effet, l'ajout d'un antioxydant (Mn TBAP) mène à l'inhibition de la production d'O2°-, de l'expression de FasL et diminue l'activité de la caspase 8. Les résultats démontrent également que l'utilisation de HT favoriserait l'apoptose des cellules HeLa et HeLa MRP+ exposées à ADR, via un mécanisme apoptotique induit par l'augmentation de la production d'O2°-. Les résultats obtenus ont permis de mieux comprendre les mécanismes apoptotiques impliqués par l'exposition à l'ADR et/ou HT. La compréhension de ces mécanismes est critique dans le développement de nouvelles stratégies, visant à augmenter l'efficacité des traitements contre le cancer. De plus, cette étude démontre également que HT peut augmenter l'efficacité du traitement par l' ADR en sensibilisant les cellules cancéreuses résistantes et non résistantes. Ce qui fait de HT, un traitement adjuvant prometteur qui permettrait de contrer le phénotype MDR et d'augmenter l'efficacité du traitement de CT, tout en diminuant les doses optimales, la toxicité aux tissus sains et les effets secondaires indésirables qui compromettre sérieusement la qualité de vie du patient. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Chimiothérapie, Adriamycine, Résistance pléiotropique aux médicaments, MRP1, Hyperthermie, Apoptose.