Les séquences d'insertion sont des parasites moléculaires d'ADN codant uniquement pour leur machinerie de transposition et sont retrouvées majoritairement dans les génomes et les plasmides des procaryotes. Le séquençage génomique massif de la dernière décennie nous a permis de détecter chez des souches bactériennes cliniques plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques associés aux séquences d'insertion sous forme de transposons composés. Il a été suggéré que les séquences d'insertion jouent un rôle prépondérant dans l'évolution bactérienne et qu'elles possèdent un pouvoir recruteur permettant de sélectionner, réorganiser et propager des gènes conférant un avantage sélectif à l'hôte. Nous avons partiellement caractérisé le potentiel recruteur de deux séquences d'insertion associées à des gènes de résistance, la séquence IS26 de Proteus vulgaris et la séquence ISJO de Salmonella typhimurium, en observant les étapes de recrutement d'un gène chromosomique et leurs distributions épidémiologiques en consultant les banques de données. / Insertion sequences are DNA molecular parasites encoding exclusively their transposition function, and are mainly found within the genomes and plasmids of prokaryotic organisms. The massive genomic sequencing we have witnessed in the last decade has allowed us to detect in clinical bacterial isolates many antibiotic resistance genes associated with insertion sequences in the form of composite transposons. It has been suggested that insertion sequences may act as a primary modulator of bacterial evolution, and that they possess a recruitment capacity allowing them to select, reorganize and spread genes encoding adaptation functions for their hosts. We have partially characterized the recruitment potential of two insertion sequences well known for their association with antibiotic resistance genes, IS10 from Salmonella typhimurium and 1S26 from Proteus vulgaris, by observing the steps involved in the recruitment process of a chromosomal gene and their epidemiological distribution by consulting various databanks.

Les virus influenza comptent parmi les agents pathogènes les plus importants à l'origine d'infections respiratoires graves. Les antiviraux jouent un rôle important dans les infections grippales sévères. Cependant, un usage monothérapeutique de l'oseltamivir (OS), un inhibiteur de la neuraminidase (INA), chez les personnes immunosupprimées (IS) favorise l'émergence fréquente de résistance à ce médicament, ce qui entraîne une mortalité importante chez les individus IS. En revanche, les inhibiteurs du complexe polymérase (baloxavir marboxil (BXM) et/favipiravir (FA)) n'ont pas été bien étudiés en tant que traitement chez les hôtes IS. Par conséquent, une nouvelle stratégie thérapeutique permettant d'éradiquer rapidement les virus influenza chez les patients IS est nécessaire. La combinaison d'antiviraux ciblant différentes étapes du cycle de vie viral peut augmenter l'efficacité antivirale et réduire la fréquence de la résistance aux médicaments par rapport à la monothérapie. Nous avons, dans un premier temps, adapté une souche contemporaine A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) chez des souris C57BL/6 après 15 passages. La caractérisation moléculaire du variant adapté a démontré que la combinaison des mutations dans les gènes PA (K615E) et HA (N122D, N144E, N246K et A304T) constituent des marqueurs important de virulence dans ce modèle. Dans un second temps, nous avons évalué l'efficacité de la combinaison d'OS avec des inhibiteurs de polymérase (BXM et/ou FA) contre le virus influenza A/H3N2 chez des souris pharmacologiquement IS. Nous avons trouvé que les approches de monothérapies avec l'OS ou le FA ont seulement retardé la mortalité, alors qu'un effet synergique sur la survie (80 % de survie) et une réduction des titres viraux pulmonaires ont été observés dans le groupe de la thérapie combinée (OS/FA) comparativement à l'OS. Le BXM simple ou en combinaison avec l'OS et/ou FA a engendré une protection complète (100 % de survie) et une réduction significative des titres viraux pulmonaires. Nous avons également observé que les traitements monothérapeutiques avec l'OS et le BXM ont induit les mutations E119V dans et I38T dans les gènes de la neuraminidase et de la polymérase acide (PA), respectivement, alors que les combinaisons n'ont pas induit de mutation de résistance. Mon projet de thèse démontre que le régime thérapeutique à doses multiples du BXM seul offrait des avantages supérieurs à ceux des monothérapies à base d'OS et de FA contre les virus A/H3N2. De plus, nous avons confirmé le potentiel de la thérapie combinée pour réduire le risque d'émergence de la résistance au sein des populations IS. Le BXM, approuvé en octobre 2018 par la FDA, est un antiviral ciblant la PA des virus influenza. La substitution I38T dans la PA est le marqueur moléculaire de résistance au baloxavir le plus répandu chez les virus de la grippe saisonnière. Le risque pour la santé publique posé par les variants présentant une sensibilité réduite au baloxavir dépend de leur capacité à se répliquer et à se transmettre dans la communauté par rapport aux virus sensibles. Nos objectifs étaient d'étudier : (1) L'impact de la mutation PA/I38T sur la capacité réplicative et la virulence des virus A/Québec/144147/09 (H1N1) et A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) in vitro et in vivo. (2) Le potentiel de transmission par contact direct des virus A/H3N2 de type sauvage (PA/I38) et mutant (PA/I38T) dans un modèle de cochon d'inde afin de prédire la transmissibilité dans la communauté. Nous avons trouvé que la substitution PA/I38T ne modifiait pas la capacité de réplication in vitro dans les cellules ST6GalI-MDCK et A549 dans les deux backgrounds génétiques. Chez les souris, les virus A/H1N1pdm09 et A/H3N2 recombinants portant la mutation PA/I38T ont induit des titres viraux pulmonaires et des pertes de poids comparables au virus sauvage. La substitution PA/I38T-H3N2 a également induit des titres comparables à ceux des virus sauvages dans les lavages naseaux des cochons d'inde et les deux virus se sont transmis de manière équivalente par contact direct. Nous avons trouvé une légère dominance du génotype sauvage (I38) par rapport au génotype mutant (38T) chez des cochons d'inde co-infectés par des mélanges de virus de type sauvage et mutant. Cependant, chez les souris, le génotype mutant a plutôt dominé le génotype sauvage. Collectivement, les virus influenza A contemporains portant la mutation PA/I38T peuvent conserver un niveau significatif de fitness viral, ce qui justifie la surveillance de leur dissémination. / Influenza viruses are among the most important pathogens causing severe respiratory diseases. Antiviral agents are recommended for treatment of severe influenza infections. Virus clearance is usually delayed among high-risk populations, including immunosuppressed (IS) patients. To inhibit virus replication in these individuals, the prolonged use of Oseltamivir (OS), a NA inhibitor (NAI), is required, which frequently leads to the emergence of drug-resistant viruses. In contrast, polymerase inhibitors (baloxavir marboxil (BXM) and favipiravir (FA)) have not been well studied as treatment in IS individuals. Therefore, a new therapeutic strategy to rapidly eradicate influenza viruses in IS patients is needed. Combination therapy with compounds targeting multiple steps in the viral life cycle may improve treatment outcomes and prevent the emergence of resistance. First, we generated a mouse-adapted A/H3N2 virus (A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) by 15 serial passages of mouse lungs. Molecular characterization of the adapted variant demonstrated that the combination of PA (K615E) and HA (N122D, N144E, N246K and A304T) mutations were critical markers of virulence in this model. In a second step, we evaluated the efficacy of OS and polymerase inhibitors (BXM and/or FA) combinations against influenza virus A/H3N2 infections in pharmacologically IS mice. We found that all untreated animals died. OS and FA monotherapies only delayed mortality, while we observed a synergistic improvement on survival (80 %) and lungs viral titers reduction in the OS/FA group compared to OS. BXM alone or in double/triple combination provided a complete protection and significantly reduced lungs viral titers. OS and BXM monotherapies induced the NA/E119V and PA/I38T substitutions, respectively, while we did not detect mutation with combinations. Our study confirms that the multiple dose regimen of BXM alone provided superior benefits compared to OS and FA monotherapies and suggests the potential for drug combinations to reduce the incidence of resistance. BXM, licensed in 2018 by the FDA, is an antiviral targeting the highly conserved cap-dependent endonuclease region of the PA gene. The PA/I38T substitution is the most common molecular marker of BXM resistance in seasonal influenza viruses. The public health risk posed by viruses with reduced susceptibility to BXM depends on their potential capacity to replicate and transmit in the community compared to susceptible viruses. We have two principal objectives: (1) To evaluate the impact of the PA/I38T substitution on the replicative capacity and virulence of A/Quebec/144147/09 (H1N1) and A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) viruses in vitro and in vivo. (2) To evaluate direct contact transmission of wild-type (PA/I38) and mutant (PA/I38T) A/H3N2 viruses in a guinea pig model to predict transmission in the community. We found that the PA/I38T substitution did not alter the in vitro replication capacity in ST6GalI-MDCK and A549 cells in both genetic backgrounds (A/H1N1pdm09 and A/H3N2). In mice, recombinant A/H1N1pdm09 and A/H3N2 viruses carrying the PA/I38T substitution induced viral titers and weight losses comparable to wild-type virus. The PA/I38T-H3N2 substitution also induced titers comparable to wild-type viruses in guinea pig nasal wash samples and both viruses were transmitted equivalently by direct contact. We found a slight dominance of the wild type (I38) over the mutant (38T) genotype in guinea pigs co-infected with mixtures of wild type and mutant viruses. However, in mice, the mutant genotype rather dominated the wild type virus. Collectively, contemporary influenza A viruses carrying the PA/I38T mutation may retain a significant level of viral fitness, warranting their monitoring in the community.

La résistance aux antibiotiques est l'une des principales menaces à la médecine moderne selon l'Organisation mondiale de la santé. Des études effectuées sur l'eau d'usines de traitement des eaux usées (UTE) ont montré qu'elles sont une importante source de gènes de résistance aux antibiotiques (GRA). Cependant, l'air entourant les bassins de traitement d'eaux usées a peu été étudié. Les bioaérosols émis lors de ces traitements ont le potentiel de propager des GRA sur de très longues distances. Ce projet a comme objectif de préciser le rôle des bioaérosols émis par les bassins extérieurs de traitement des eaux usées dans la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques. Des échantillons d'air ont été prélevés en amont et en aval de bassins extérieurs de boues activées et de bassins extérieurs d'aération d'eaux usées. Des échantillons ont également été prélevés à proximité de bassins de décantation intérieurs. Ces échantillons d'air ont été récoltés avec un SASS 3100 Dry Air Sampler ainsi qu'avec un SASS 4100 Two-Stage Aerosol Collector. Les bactéries totales ont été quantifiées par amplification PCR. La PCR quantitative a aussi été réalisée pour 38 gènes de résistance aux antibiotiques et éléments génétiques mobiles sur chaque échantillon. Les gènes conférant des résistances aux Bêta-lactamines, aux tétracyclines, aux sulfamides ainsi qu'aux macrolides ont été retrouvés dans l'air entourant les bassins de traitement des eaux usées. Les bassins de boues activées semblent émettre plus de GRA que les étangs aérés. / Antibiotic resistance is one of the main threats to modern medicine according to the World Health Organization. Studies carried out on water from sewage treatment plants have shown that they are an important source of antibiotic resistance genes (ARGs). However, the air surrounding wastewater treatment ponds has been little studied. The bioaerosols emitted during these treatments have the potential to spread GRAs over very long distances. This project aims to precise the role of bioaerosols emitted by outdoor wastewater treatment ponds in the spread of antibiotic resistance genes. Air samples were taken upstream and downstream of outdoor activated sludge ponds and outdoor wastewater aeration ponds. Samples were also taken near indoor settling ponds. There air samples were collected with a SASS 3100 Dry Air Sampler as well as with a SASS 4100 Two-Stage Aerosol Collector. Total bacteria were quantified by PCR amplification. Quantitative PCR was also performed for 38 antibiotic resistance genes and mobile genetic elements on each sample. Genes conferring resistance to beta-lactams, tetracyclines, sulfamides and macrolides have been found in the air surrounding wastewater treatment ponds. Activated sludge seems to emit more ARGs than aerated ponds.

Depuis la découverte de la pénicilline par Sir Alexander Fleming, les antibiotiques ont joué un rôle primordial et incontestable en médecine moderne en aidant à combattre les infections bactériennes. Cependant, les bactéries ont la capacité de se protéger par différents moyens des molécules antibiotiques. La surutilisation de ces molécules a accéléré le phénomène de résistance aux antibiotiques, rendant difficile, voire impossible, le traitement de certaines maladies infectieuses par cette approche. La résistance aux antibiotiques est une problématique d’envergure mondiale qui touche aussi négativement l’aquaculture, où les infections bactériennes peuvent causer d’importantes pertes économiques. L’une de ces bactéries est Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, l’agent étiologique de la furonculose. Bien qu’il fût déjà connu que plusieurs souches de cette bactérie étaient porteuses de plasmides conférant des résistances aux antibiotiques, l’ampleur de la problématique était encore inconnue. Les bactériophages (phages) sont des virus infectant spécifiquement les bactéries. Cette capacité à lyser les bactéries leur a valu d’être utilisés dans un contexte thérapeutique presque dès leur découverte au début du 20e siècle. Cependant, l’avènement des antibiotiques a fait en sorte que la thérapie par les phages a été oubliée dans plusieurs pays occidentaux. Maintenant que la résistance aux antibiotiques est devenue une inquiétude pour la pérennité de notre société, plusieurs études suggèrent que la thérapie par les phages pourrait être une alternative ou un complément aux traitements par antibiotiques. La présente thèse avait comme objectifs : (1) d’explorer la diversité génomique causant une résistance aux antibiotiques chez A. salmonicida subsp. salmonicida et (2) d’investiguer le potentiel d’un traitement par les phages pour contrer les infections causées par cette bactérie. Il a été possible de mettre à jour et de caractériser cinq nouveaux plasmides avec des gènes de résistance aux antibiotiques chez A. salmonicida subsp. salmonicida. De plus, la présence de deux de ces plasmides (pAB5S9b et pSN254b) causent une résistance à tous les antibiotiques approuvés par le gouvernement canadien pour une utilisation par l’industrie piscicole. Avant d’investiguer la diversité des phages infectant A. salmonicida subsp. salmonicida, il était crucial de mieux connaître la bactérie d’intérêt. Plusieurs phages sont connus pour avoir un spectre lytique étroit, n’infectant ainsi que certaines souches ou certaines sousespèces d’une bactérie. Or, la structure intra-espèce d’A. salmonicida était encore mal définie. De plus, l’une des sous-espèces d’A. salmonicida, pectinolytica, est considérée comme mésophile avec la capacité de croître à 37°C, alors que les autres sous-espèces, comme salmonicida, sont limitées à des températures d’environ 20°C et sont par conséquent qualifiées de psychrophiles. En caractérisant de nouvelles souches mésophiles, mes travaux ont mis en lumière que les séquences d’insertion peuvent être une raison pour expliquer cette dichotomie. De plus, il a été possible de démontrer une grande diversité génétique chez les souches mésophiles, comparativement à celles psychrophiles. Afin de vérifier le potentiel d’un traitement par les phages contre la furonculose, trois phages spécifiques à A. salmonicida subsp. salmonicida ont été isolés de l’environnement. L'ADN de ces phages, en plus de celui de neuf autres disponibles à la collection Félix d’Hérelle, a été séquencé à haut-débit sur un appareil MiSeq d’Illumina. En comparant ces séquences génomiques à celles déjà disponibles publiquement, il a été possible de déterminer six groupes génomiques de phages contre A. salmonicida subsp. salmonicida. Les 12 phages disponibles pour la présente étude ont été testés sur 65 souches d’A. salmonicida (incluant des sous-espèces autres que salmonicida), permettant de dresser un portrait de la capacité lytique de chacun de ces virus. Cette analyse a mis en lumière trois groupes de phages ayant des capacités lytiques variables. De plus, il a été possible de montrer que d’autres sous-espèces d’A. salmonicida psychrophiles peuvent être infectées par les phages isolés à partir de la sous-espèce salmonicida. Cependant, les souches mésophiles d’A. salmonicida sont insensibles à ces phages. Cette étude doctorale a montré que la résistance aux antibiotiques est un problème d’envergure dont l’ampleur était insoupçonnée chez A. salmonicida subsp. salmonicida. Elle a aussi permis d’investiguer le potentiel de la thérapie par les phages. / Since the discovery of penicillin by Sir Alexander Fleming, antibiotics have played a paramount and indisputable role in modern medicine in helping to treat bacterial infections. However, bacteria have the ability to protect themselves against antibiotics by various mechanisms. The overuse of these molecules has accelerated the phenomenon of antibiotic resistance, making it difficult, if not impossible, to treat certain bacterial infections. Antibiotic resistance is a global problem that also negatively affects aquaculture, where bacterial infections can cause significant economic losses. One of these bacteria is Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, the etiologic agent of furunculosis. Although it was already known that several strains of this bacterium were carriers of plasmids conferring resistance to antibiotics, the extent of the problem was still unknown before this study. Bacteriophages (phages) are viruses specifically infecting bacteria. Their ability to lyse bacteria has been used in a therapeutic context almost as soon as they were discovered at the beginning of the 20th century. However, the advent of antibiotics has meant that phage therapy was forgotten in several Western countries. Now that antibiotic resistance has become a significant concern for the sustainability of our society, several studies suggest that phage therapy could be an alternative or supplement to antibiotic treatments. The objectives of this thesis were: (1) to explore the genomic diversity causing resistance to antibiotics in A. salmonicida subsp. salmonicida and (2) to investigate the potential of phage therapy to treat infections caused by this bacterium. Five new plasmids conferring antibiotic resistance to A. salmonicida subsp. salmonicida were discovered and characterized. Two of these plasmids, pAB5S9b and pSN254b, cause resistance to all antibiotics approved by the Canadian government for use in the fish industry. Before investigating the diversity of phages infecting A. salmonicida subsp. salmonicida, it was crucial to better know the bacterium of interest. Several phages are known to have a narrow host spectrum, infecting certain strains or subspecies. Until the present doctoral study, the intra-species structure of A. salmonicida was poorly defined. In addition, one of the subspecies of A. salmonicida, pectinolytica, is considered mesophilic with the ability to grow at 37°C, while other subspecies, such as salmonicida, are limited to growth temperatures around 20°C and are therefore considered psychrophilic. By characterizing new mesophilic strains, we found that insertion sequences may be a reason for this dichotomy. In addition, it was possible to demonstrate a high genetic diversity in mesophilic strains compared to psychrophilic strains. In order to verify the potential of phage treatment against furunculosis, three phages specific to A. salmonicida subsp. salmonicida were isolated from the environment. The genomic DNA of these phages, in addition to that of nine other phages available at the Felix d'Hérelle collection, was sequenced on an Illumina MiSeq device. By comparing these genomic sequences to those already available publicly, it was possible to determine six genomic groups of phages infecting A. salmonicida subsp. salmonicida. The 12 phages available were tested on 65 strains of A. salmonicida (including subspecies other than salmonicida), providing the host range of each virus. This analysis revealed three groups of phages with variable lytic capacities. In addition, it was possible to show that other psychrophilic subspecies of A. salmonicida can be infected by phages isolated from the subspecies salmonicida. However, the mesophilic strains of A. salmonicida are insensitive to these phages. This doctoral study showed that resistance to antibiotics is a large-scale problem in A. salmonicida subsp. salmonicida, and that phage therapy may represent one of the solutions to the growing concern

Les intégrons sont des éléments génétiques capables d'intégrer et de disséminer, par un mécanisme de recombinaison spécifique de site, des gènes de résistance aux antibiotiques trouvés sous la forme de cassettes. Ils contiennent un gène qui code pour une intégrase (intl) qui effectue la recombinaison en agissant sur deux sites cibles : le site attl en cis avec le gène d'intégrase et le site palindromique attC d'une cassette. Les intégrases d'intégrons sont donc directement impliquées dans l'accumulation et la formation de nouvelles combinaisons de cassettes de résistance dans la région variable des intégrons plasmidiques et il est donc important de mieux comprendre leur fonctionnement. Les travaux présentés à l'intérieur de cette thèse visent l'étude des interactions entre les intégrases d'intégrons et leurs sites d'attachement. Le premier objectif est de vérifier si la substitution de certains résidus peut permettre de modifier la capacité d'une intégrase d'intégron à exciser différentes cassettes. Pour ce faire, nous avons étudié l'intégrase chromosomique, SamlntLA, trouvée chez Shewanella amazonensis SB2BT afin de déterminer si cette enzyme est capable d'exciser différentes cassettes, de comparer son activité avec celles des intégrases SonIntIA et IntI2*179E et finalement de comparer les propriétés de l'enzyme sauvage avec celles de quelques enzymes mutantes. Nous avons donc testé la capacité de ces trois intégrases sauvages et de quelques mutantes à exciser plusieurs cassettes contenant différents sites attC. Les résultats démontrent que l'intégrase SamlntLA est beaucoup moins active que les intégrases SonIntIA et IntI2*179E pour effectuer l'excision des cassettes. Ils démontrent aussi que les substitutions V206R, V206K et V206H permettent d'augmenter l'efficacité de SamlntLA à exciser certaines cassettes mais que l'activité de ces intégrases mutantes est inférieure à celle montrée par les intégrases SonIntIA et IntI2*179E. Le deuxième objectif est d'analyser l'influence de l'identité des bases protubérantes et de l'espacement qui les sépare sur l'excision des cassettes par les intégrases d'intégrons. Nous avons ainsi effectué la mutagenèse du site attCdfrAi en amont de la cassette sat2 pour obtenir des variantes de séquences et d'espacement entre les bases protubérantes afin de déterminer comment ces modifications influencent la capacité des intégrases Intll, IntI2*179E, IntI3 et SonIntIA à exciser les cassettes. Nous avons ainsi démontré que l'intégrase Intll est plus efficace pour exciser les cassettes contenant des sites attC caractérisés par des bases protubérantes T et G séparées par 6 nucleotides tandis que l'intégrase IntI3 excise les cassettes contenant un nombre limité de sites attC. Nous avons aussi démontré que les intégrases IntI2*179E et SonIntIA tolèrent les changements de bases protubérantes et qu'elles excisent une plus grande variété de cassettes que les intégrases Intll et IntI3.

La résistance croissante et alarmante aux antimicrobiens chez de nombreuses bactéries pathogènes humaines telles que Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa représente un problème majeur de santé publique. Ce problème est aggravé par l’apparition de souches multirésistantes et par le nombre limité d’antibiotiques en développement. Il devient donc impératif de s’affairer à protéger l’efficacité des molécules disponibles. Par ailleurs, une meilleure compréhension du mode d’action des antibiotiques et de la réponse induite par ceux-ci pourrait être bénéfique pour identifier de nouvelles cibles bactériennes pour le développement d’adjuvants chimio-thérapeutiques. Notre étude de la réponse transcriptomique par la technique d’ARN-Seq de trois souches de S. pneumoniae sensibles à la pénicilline (PEN) a montré un nouveau lien entre le métabolisme de la glutamine et la sensibilité à la PEN. En effet, les gènes des opérons glnRA et glnPQ impliqués dans la synthèse et l’absorption de la glutamine étaient parmi les gènes les plus sous-exprimés chez les trois souches traitées avec la PEN. Nous avons aussi détecté une augmentation des concentrations intracellulaires de la glutamine à la suite du traitement à la PEN. En outre, l’inhibition chimique de la glutamine synthétase codée par glnA sensibilise S. pneumoniae à la PEN, et ceci a aussi été observé chez des isolats cliniques résistants à la PEN. En résumé, une combinaison d’études transcriptomique et métabolomique a démontré que la PEN interfère avec le métabolisme de la glutamine, suggérant des stratégies qui pourraient être exploitées en bithérapie. Chez les bactéries à Gram négatif, la résistance aux carbapénèmes devient de plus en plus menaçante pour la santé mondiale. L'efficacité de l’imipénème (IMP) diminue avec l'apparition de la résistance. Notre criblage chimiogénomique chez E. coli, K. pneumoniae et P. aeruginosa a mis en évidence des réponses communes et spécifiques à l’IMP à chaque espèce. Une analyse comparative de 145 mutants a montré que les gènes les plus mutés codaient pour des protéines impliquées dans la biogenèse de la membrane et de l'enveloppe cellulaires, la transcription et la transduction de signal. iii Nos résultats ont montré que le gène rpoD codant pour un facteur sigma d'ARN polymérase était muté chez les trois espèces et le rôle de ce gène dans la résistance a été validé expérimentalement chez E. coli. En outre, de nombreux gènes codant pour des amidases, transférases et transglycosidases ont conféré un faible niveau de résistance aux entérobactéries, alors que les mutations d'OprD étaient fréquentes chez P. aeruginosa, mais divers systèmes de transduction de signal à deux composants étaient également susceptibles d'être impliqués dans la résistance à l'IMP. De façon intéressante, certains gènes identifiés tels que rpoD, slt codant pour une transglycosylase lytique, ainsi que les histidines kinases sont déjà envisagés comme des cibles thérapeutiques prometteuses. Finalement, cette étude a confirmé le pouvoir de diverses approches omiques quant à la compréhension des modes d’action des antibiotiques et à la prédiction des mécanismes de résistance développés contre eux. Ceci nous permettra de mettre en place des stratégies pour protéger l’efficacité des antibiotiques actuellement utilisés mais aussi celle de nouvelles molécules développées.

Le phénomène de multirésistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram positif causant des infections sévères du sang est un problème mondial grandissant. La détection du niveau de sensibilité aux antibiotiques avec des tests phénotypiques requière un minimum de 48 h avant l'obtention des résultats. Il est donc nécessaire de développer des tests de diagnostic rapides, sensibles, spécifiques et ubiquitaires pour améliorer le traitement des septicémies. Ce mémoire de maîtrise présente le développement d'un test de diagnostic moléculaire permettant la détection rapide des gènes de résistance aux antibiotiques cliniquement importants associés aux bactéries à Gram positif causant des septicémies. Ce test comprend 4 essais PCR multiplex combinés à une hybridation microfluidique sur puces à ADN intégrées à un disque compact. Les corrélations obtenues entre les résultats génotypiques et phénotypiques étaient de 98% pour les P-lactamines et de 100% pour la vancomycine, la clindamycine et la gentamicine. Cette approche moléculaire pourrait éventuellement être utilisée pour le diagnostic clinique afin de guider l'antibiothérapie des patients atteints d'une septicémie.

La résistance du virus herpes simplex (VHS) aux antiviraux, particulièrement chez des sujets immunosupprimés, et sa capacité d’envahir le système nerveux central soulèvent de nombreuses questions au niveau clinique. Des mutations au sein du gène de la thymidine kinase et de l’ADN polymérase virale sont responsables de la résistance aux traitements antiviraux. Il est donc important d’élucider davantage les différents mécanismes moléculaires à l’origine de ces évènements de résistance et de développer de nouvelles avenues thérapeutiques. De plus, le VHS est la cause la plus fréquente d’encéphalite sporadique et potentiellement fatale dans les pays de l’ouest. Ce type de pathologie est occasionné en partie par une intense réplication virale mais également par une réponse immunologique encore incomprise jusqu’à maintenant. Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat ont pour but de développer de nouveaux modèles in vitro et in vivo permettant d’étudier ces deux facettes importantes du VHS. L’impact de certaines mutations et l’effet d’un nouveau traitement dans la résistance du VHS aux antiviraux ont été évalués. La réponse immunitaire innée cérébrale de même qu’une nouvelle approche thérapeutique en rapport avec une encéphalite à VHS ont également été caractérisées. / Herpes simplex virus (HSV) resistance to antiviral treatment is a real concern among immunocompromised population. Mutations localized in the thymidine kinase (TK) and/or the DNA polymerase (pol) genes are mainly responsible for those resistance issues. Thus, it is becoming important to increase knowledge in this area and to develop new therapeutic strategies. Also, HSV has this unique biological property to invade the nervous central system and causes encephalitis. During this type of infection, an important immunological process occurs. However, this inflammatory response is still very controversial and needs to be elucidated. The main objectives of this doctoral thesis consisted of: 1- the characterization of antiviral resistance and 2- the elucidation of the brain inflammatory response to HSV. The first part consisted in the development of an in vitro system allowing the characterization of several mutations in the TK and/or the DNA pol genes responsible for antiviral resistance and the elaboration of a new antiviral strategy. The second part was to characterize the inflammatory response following the induction of HSV-1 encephalitis in a mouse model and to develop an alternative immunomodulatory approache. Mutations localized in conserved and non-conserved regions of the TK are associated with ACV resistance. Hydroxyurea increases the activity of nucleoside (ACV) and nucleotide (CDV) analogues. A delayed glucocorticoid treatment is highly beneficial by decreasing the brain viral load as well as pro-inflammatory cytokine production in the brain of infected mice. TNF- and IL-1permit the initiation of an innate immune response allowing a control of the viral replication and an efficient transition to the adaptive immune response required for viral clearance during HSV-1 encephalitis. A prophylactic treatment with a TLR3 agonist significantly increases the mean life expectancy and survival rate of mice infected with HSV-1 compared to non-treated mice. The experimental models developed during this Ph. D. allow a better understanding of the molecular mechanisms of resistance and of the brain inflammatory response to the HSV.

À la suite d'un diagnostic de cancer de l'ovaire, la prise en charge thérapeutique constitue une étape déterminante dans la survie des patientes atteintes. Actuellement, la plupart de celles-ci subiront une cytochirurgie suivie d'une chimiothérapie standard comprenant du Cisplatin (ou Carboplatin) et du Paclitaxel. Malgré une réponse initiale adéquate, il a été démontré que 75-80% d'entre elles récidiveront peu de temps après la fin de leurs ("leurs" prend un "s" si chaque femme à plusieurs traitements) traitements. Dans ces cas de récidive, la plupart des patientes développeront aussi une résistance à la chimiothérapie. A ce stade, l'administration d'un traitement efficace devient donc un problème de taille pour les oncologues. La technologie des micropuces à ADN est grandement utilisée au niveau de la recherche sur le cancer, y compris celles portant sur les mécanismes et les biomarqueurs associés à la chimiorésistance dans les cancers ovariens. Dans notre programme de recherche, nous avons évalué le profil d'expression génique de six paires de tumeurs prélevées avant et après la chimiothérapie (CT) de six patientes atteintes d'un cancer épithéliale de l'ovaire (CEO), dans le but de pouvoir caractériser moléculairement les récidives résistantes de l'ovaire. Nos résultats ont montré la présence d'une signature moléculaire spécifique dans les tumeurs post-CT présentant une surexpression de gènes associés à des mécanismes connues de chimiorésistance et à la régulation négative de la prolifération. D'autres gènes liés à la réponse aux traitements, à l'apoptose, au contrôle du cycle cellulaire et à la régulation positive de la prolifération sont sous-exprimés dans ces mêmes tumeurs. Nous avons aussi analysé le profil d'expression génique de tumeurs primaires de l'ovaire de type séreux présentant différentes réponses aux agents chimiothérapeutiques, dans le but d'identifier une signature moléculaire spécifique associée à la réponse aux traitements primaires. Nos résultats suggèrent que la chimiorésistance innée peut être attribuée à une action combinée de différents facteurs liés au transport de la drogue (acquisition/excrétion), à la prolifération cellulaire ainsi qu'à des altérations dans le métabolisme, la réponse inflammatoire et l'apoptose. Une liste prédictive contenant 43 gènes a été développée et possède la capacité de pouvoir classifier les patientes ayant une tumeur séreuse de l'ovaire selon leur risque de récidiver tôt ou tard à la suite de leurs CT Découlant de ces études, plusieurs biomarqueurs associés à la chimiorésistance ont été identifiés. L'expression de certains d'entre eux a été validée dans une cohorte contenant 166 patientes atteintes de CEO présentant différents temps de survie (survie avec ou sans progression de la maladie) suivant leurs (idem) traitements de CT initiaux. Sur une liste contenant 15 candidats potentiels, nous avons observé qu'une plus faible expression protéique du biomarqueur HSP10 ainsi qu'une diminution de la prolifération cellulaire (via une plus faible expression du marqueur Ki67) prédisent une plus faible survie sans progression de la maladie et donc, par déduction, une plus grande chance de développer une chimiorésistance. L'expression protéique d'autres biomarqueurs (CTSL2 et MUC1) a été évaluée dans notre cohorte et nous avons trouvé que ceux-ci montraient une tendance à être associés avec la survie des patientes. Ceux-ci devront cependant être revalidés dans une plus grande cohorte de patientes. L'analyse des profils d'expression génique des tumeurs chimiorésistance de l'ovaire a aussi mené à l'identification de l'utilisation de médicaments anti-inflammatoires (Célébrex) en termes de traitement potentialisateurs pouvant augmenter l'effet cytotoxique du Cisplatin sur les cellules de cancer de l'ovaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la réponse immédiate des cellules de cancer de l'ovaire aux traitements de CT ainsi que l'émergence d'une chimiorésistance précoce, nous avons étudié les profils d'expression génique de sphéroïdes dérivés de six lignées cellulaires de cancer de l'ovaire suivant un traitement avec des agents chimiothérapeutiques couramment utilisés dans le traitement des CEO (Cisplatin, Paclitaxel et Topotecan). Nous avons trouvé que l'induction de gènes liés aux mécanismes de réplication et de réparation de l'ADN dans les sphéroïdes traités avec du Cisplatin et du Topotecan pourraient être associée avec la réponse immédiate aux traitements et pourrait être liée à un mécanisme précoce de résistance. De façon similaire, la surexpression de différents isotypes de tubulines suivant un traitement des sphéroïdes avec du Paclitaxel pourrait représenter un effet compensatoire précoce à l'action de cette drogue. Finalement, les conditions de croissance en sphéroïde, condition reconnue pour altérer l'expression génique, pourrait substantiellement contribuer à réduire l'efficacité des agents chimiothérapeutiques sur les sphéroïdes de cancer de l'ovaire. Pris ensemble, les résultats présentés dans cette thèse aideront à mieux comprendre les mécanismes moléculaires associés à la chimiorésistance dans les cancers ovariens et aideront à définir de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour ce type de patientes.

YB-1 (Y-Box-binding Protein 1) est une protéine multifonctionnelle qui affecte plusieurs processus biologiques incluant la transcription, la traduction, la réparation de l’ADN et le développement embryonnaire. YB-1 appartient à une large famille de protéines liant l’ADN / l’ARN avec un motif très conservé à travers l’évolution appelé CSD (Cold Shock Domain). YB-1 est une protéine surexprimée dans plusieurs tumeurs et affecte les différentes voies de développement des cancers. Une surexpression de la protéine YB-1 rend les cellules des cancers du sein, ovariens et colorectaux résistants aux composés à base de platine. La protéine YB-1 présente beaucoup d’intérêts thérapeutiques pour lutter contre les cancers. Bien que plusieurs approches visant à cibler la protéine YB-1 aient été développées pour prévenir et traiter des patients, un effort substantiel reste nécessaire puisque la fonction multiple de la protéine YB-1 doit être prise en considération. Les buts de ce projet sont d’identifier les partenaires de la protéine YB-1 impliqués au niveau de la chimiorésistance dans différents types de cancers aux composés à base de platine et de développer de nouvelles approches thérapeutiques potentielles. Pendant cette étude, nous avons identifié les protéines NONO et RALY comme nouveaux partenaires de la protéine YB-1 dans les cellules des cancers colorectaux. Nous avons démontré que les protéines NONO et RALY sont impliquées au niveau de la chimiorésistance des cellules des cancers colorectaux aux composés à base de platine. Cette étude a aussi permis d’identifier RPS4X comme nouveau partenaire de la protéine YB-1 impliqué au niveau de la chimiorésistance des cellules du cancer du sein et ovarien au cisplatine. La protéine RPS4X est un nouveau biomarqueur prédictif et pronostic pour les patientes atteintes du cancer de l’ovaire et traitées au cisplatine. Le biomarqueur RPS4X représente ainsi, une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrecarrer la chimiorésistance des cancers aux composés à base de platine incluant les tumeurs avec une surexpression de la protéine YB-1. Le niveau d’expression de la protéine RPS4X pourrait être utilisé en première ligne pour la sélection des thérapies pour des patientes atteintes des cancers ovariens et du sein. / YB-1 (Y-Box-binding Protein 1) is a multifunctional protein involved in several cellular processes including transcription, translation and DNA repair. YB-1 is important for late-stage embryonic development and belongs to the family of DNA/RNA-binding proteins with an evolutionarily ancient conserved Cold Shock Domain (CSD). YB-1 is overexpressed in many malignant tissues and plays an important role in the development of cancer. Many studies reported that high expression of YB-1 protein is associated with a worse prognosis in cancer patients. Moreover, an overexpression of YB-1 protein in breast, colorectal and ovarian cancer cell lines induced chemoresistance to platinum agents. YB-1 protein is a good therapeutic target to counteract platinum resistance in cancer. Different strategies for novel therapeutic approaches targeting YB-1 protein were used to prevent and treat people with cancer. The use of YB-1 as a therapeutic targets is still a big challenge in research and its multifunctional properties should be taken into consideration when developing a new therapy against YB-1. The goals of this project are to identify YB-1-interacting proteins required for platinum agents resistance in cancer cell lines and to develop a potential therapeutic target to treat cancers. During this study, NONO and RALY proteins were identified as new partners of YB-1 protein in colorectal cancer cell lines. We proved that NONO and RALY are significant potential target to counteract oxaliplatin resistance in colorectal cancers including tumors overexpressing the YB-1 protein. In addition, we found RPS4X protein as new a partner of YB-1 involved in cisplatin resistance in beast and ovarian cancers. These results suggest that the RPS4X protein is a significant potential target to counteract cisplatin resistance in breast and ovarian cancers. Also, we have established that RPS4X is a new promising prognostic marker for patients with high-grade serous ovarian cancer. More importantly, RPS4X is shown to be predictive of cisplatin response. RPS4X could thus be useful when selecting the first line therapies for patients with breast and ovarian cancer.