Le lymphome à cellules du manteau (LCM) est un cancer lymphoïde agressif caractérisé par des rechutes itératives et un mauvais pronostique. Le LCM est associé à une génétique complexe et à des dérégulations de gènes tissu-spécifiques, potentiellement liées à des perturbations de la marque épigénétique H3K9me3. En criblant les niveaux d’H3K9me3 dans une cohorte de 120 cas de LCM, nous avons montré une perte de cette marque dans 30% des cas. Cette perte d’H3K9me3 a été reliée à une diminution de l’expression ou de l’activité des histones methyltransferases SUV39H1 et SETDB1, et à l’expression différentielle de programmes d’expression génique associés aux cellules souches embryonnaires ou hématopoïétiques, à la différentiation B et la réponse aux dommages à l’ADN. Un séquençage à haut-débit ciblé n’a pas permis de mettre en évidence de mutations associées à cette perturbation épigénétique.Nous avons également montré qu’une invalidation de l’expression de SUV39H1 causait une augmentation du volume tumoral dans un modèle de xénogreffe et qu’une perte de SETDB1 induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G1/S, associé à une reprogrammation cellulaire vers un phénotype pré-B. L’ensemble de ces données suggère une convergence des voies de signalisation associées à H3K9me3 vers des cibles essentielles à la pathogénèse du LCM. Les mécanismes épigénétiques associées à la régulation de ces cibles sont actuellement étudiés par immunoprécipitation de la chromatine associée à H3K9me3. Des analyses de survie dans le cadre d’un essai clinique prospectif permettront également d’établir l’impact pronostique des pertes d’H3K9me3 dans le LCM. / Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive lymphoid cancer characterised by iterative clinical relapses and short survival. MCL displays complex genetics and hallmarks of misregulated expression of lineage specific genes. We have hypothesized that the latter might result from corruption of H3 lysine 9 trimethylation signaling. By screening for H3K9me3 levels across a cohort of 120 MCL cases, we found global reductions in H3K9me3 in 1/3 of cases. H3K9me3 depletion was linked to underexpression / attenuated activity of SUV39H1 and SETDB1 histone methylases, respectively, and to differential expression of key cancer signatures relating to embryonic/hematopoietic stem cell function, B cell differentiation, and DNA damage response. Targeted deep sequencing did not reveal association to mutations in known epigenetic modifiers, indicating a new, previously-unsuspected role for H3K9me3 in MCL pathogenesis. In keeping with this, knockdown of SUV39H1 increased tumour growth in MCL xenografts while SETDB1 depletion induced G1/S arrest coincident to reprogramming to a pre-B cell phenotype. Taken together this identifies convergence of H3K9me3 signaling pathways to essential targets for MCL disease pathogenesis. These are currently under investigation by H3K9me3 ChIP-seq. Survival analyses in the setting of a prospective clinical trial will establish the prognostic impact of H3K9me3 in MCL.

Le traitement du mélanome métastatique a été révolutionné par le développement de thérapies ciblées, qui ont montré un bénéfice significatif sur la survie globale. En particulier, l'inhibition de la sérine-thréonine kinase BRAF, mutée dans 60% des mélanomes, par le Vémurafénib (PLX4032), a montré un gain de survie de 6 à 8 mois comparée à la chimiothérapie de référence, la Dacarbazine. Cependant, une très faible proportion de patients répond sur le long terme. En effet, la majorité des patients développent un échappement thérapeutique dans un délai médian de 6 mois. Des mécanismes cellulaires ont été mis en évidence dans l'apparition de cette résistance acquise, notamment l'implication de MITF, un facteur de transcription majeur des mélanocytes, ainsi que des modifications de l'expression de plusieurs membres de la famille de Bcl-2. Cependant, une meilleure compréhension des mécanismes de résistance aux thérapies anti-BRAF semble essentielle, tout comme l'utilisation de nouvelles approches thérapeutiques combinées afin d'optimiser l'efficacité des traitements et la durée du bénéfice clinique. Notre groupe a récemment identifié des altérations du métabolisme du céramide et de l'un de ses dérivés, la Sphingosine 1-phosphate (S1P), dans les cellules de mélanome humain comparé à des mélanocytes sains. En effet, nous avons montré que la S1P lyase (SPL), qui dégrade irréversiblement la S1P est sous exprimée. Au contraire, l'expression de la sphingosine kinase 1 (SK1), qui produit la S1P, est augmentée dans les cellules de mélanome, conséquence directe de la mutation BRAF. Ces perturbations ont pour effet d'augmenter les niveaux de S1P. Ce lysophospholipide favorise la survie cellulaire ainsi que la résistance vis-à-vis d'agents thérapeutiques dans diverses cellules tumorales. L'objectif de cette thèse a été d'évaluer si le métabolisme de la S1P peut moduler la résistance acquise des cellules de mélanome humain aux inhibiteurs de BRAF. Nous avons montré que la surexpression de la SPL ou l'inhibition pharmacologique de la SK1 (SKI-I) sensibilise les mélanomes métastatiques à l'apoptose induite par la thérapie ciblée. Ce phénomène est associé à une diminution de MITF et de l'une de ses cibles directes, la protéine anti-apoptotique Bcl-2. La diminution d'expression protéique de MITF peut être réversée par un traitement de S1P exogène. De plus, nous avons montré pour la première fois une augmentation de l'expression des récepteurs 1 et 3 à la S1P (S1PR1 et S1PR3), dans les cellules de mélanome présentant une résistance acquise au PLX4032. Ces modifications sont associées à l'expression accrue de MITF. La surexpression de la SPL, le traitement par le SKI-I ou par des inhibiteurs ciblant les S1PR1 et S1PR3, surmonte la résistance acquise de ces cellules au PLX4032 via la diminution d'expression des S1PRs, de MITF, et de Bcl-2. Par conséquent, en contrôlant l'expression de protéines clés de la survie et de la résistance, le métabolisme de la S1P représente une nouvelle approche thérapeutique pour améliorer l'efficacité des thérapies ciblées. / The treatment of metastatic melanoma has changed considerably in recent years with the development of targeted therapies, which have shown a significant benefit in overall survival. In particular, the inhibition of the frequently mutated serine-threonine kinase BRAF, by Vemurafenib (PLX4032) showed that survival rates increase by 6 to 8 months compared to standard chemotherapy, Dacarbazine. However, a very small proportion of patients will respond to the long term, and the majority of patients relapses in a median of 6 months. Cellular mechanisms have been identified in the appearance of this acquired resistance, including the involvement of MITF, a major transcription factor of melanocytes, as well as changes in the expression of several members of Bcl-2 family. However, a better understanding of these mechanisms seems essential, as is the use of new therapeutic strategies to optimize treatment efficacy and duration of clinical benefit. Our group recently showed some alterations of ceramide metabolism and its derivative sphingosine 1-phosphate (S1P) in human melanoma cells compared to healthy melanocytes. For instance, S1P lyase (SPL), which degrades S1P, is under-expressed. Conversely, sphingosine kinase 1 (SK1), which produces S1P, is over-expressed in tumor cells, as a direct result of BRAF mutation. These alterations increases the levels of S1P. This lysophospholipid promotes cell survival and the resistance to therapeutic agents in a variety of tumor cells. This PhD project aimed at defining whether S1P metabolism could modulate the resistance of human melanoma cells to PLX4032. Here, we show that SPL overexpression or pharmacological inhibition of SK1 by SKI-I sensitizes metastatic melanoma cells to PLX4032-induced apoptosis. This phenomenon is associated with a decreased expression of the master regulator of melanocyte differentiation MITF as well as its direct cellular target Bcl-2. The decrease in MITF protein can be reversed by treating cells with exogenous S1P. Interestingly, we also report for the first time an increased expression of SK1 as well as the S1P receptors, S1PR1 and S1PR3, in melanoma cells with acquired resistance to PLX4032 as compared to sensitive counterparts. These modifications are associated with high expression of MITF. Overexpression of SPL, treatment with SKI-I or antagonists of S1PR1 ans S1PR3, strongly overcomes acquired resistance to PLX4032 through a decrease in the expression of S1PR, MITF as well as Bcl-2. Thus, by controlling the expression of key proteins in melanoma cell survival and resistance, S1P metabolism could represent a new therapeutic approach to enhance the effectiveness of targeted therapies.

Le mélanome est le cancer de la peau le plus dangereux : il est capable de métastaser rapidement vers les ganglions et les viscères, et est réfractaire aux chimio/radiothérapies. De nouvelles thérapies ciblant la kinase BRAFV600 retrouvée dans 60% des mélanomes ont montré des effets spectaculaires en termes de survie globale et sans progression de la maladie. L’efficacité de ces thérapies est compromise par l’apparition fréquente de résistances. Les cellules cancéreuses sont ancrées au sein d’un microenvironnement avec lequel elles interagissent. Elles profitent de facteurs solubles du stroma et de l’adhésion à la matrice extracellulaire (MEC) pour survivre face aux thérapies. La protéine matricellulaire SPARC orchestre les interactions entre les cellules saines ou cancéreuses et leur microenvironnement. Absente dans les mélanocytes, son expression est initiée et augmentée dans les mélanomes, corrélée à la progression tumorale et à un mauvais pronostic clinique. Lorsqu’elle est sécrétée par les cellules de mélanome, elle active la kinase AKT, déstabilise le suppresseur de tumeur p53 et favorise la prolifération/survie tumorale. Nous avons montré que le module SPARC/AKT est un nouveau déterminant de la résistance innée ou acquise des mélanomes mutés BRAFV600 aux anti-BRAF, et mis en évidence l’intérêt du ciblage de SPARC en combinaison avec des anti-BRAF ou -MEK pour optimiser/restaurer la sensibilité des mélanomes à ces inhibiteurs. Nous avons aussi montré que les fibroblastes ganglionnaires ont des caractéristiques de fibroblastes activés, et confèrent une résistance aux anti-BRAF aux cellules de mélanomes en générant une MEC permissive à laquelle elles adhérent. / Melanoma is the most dangerous form of skin cancer due to its high metastatic potential and its resistance to both classical chemo- and radiotherapies. New targeted therapies directed against the V600E oncogenic form of BRAF found in about 60% of patients have demonstrated spectacular efficacy both in terms of progression free and overall survival. However most patients invariably relapse after a few months due to resistance mechanisms. Cancer cells are anchored and interact constantly with their microenvironment. Both soluble factors and the extracellular matrix produced by stromal cells have been shown to contribute to cancer cell resistance to therapies. SPARC is a matricellular protein that orchestrates interactions between normal and/or cancer cells and their microenvironment. While it is absent in melanocytes, SPARC expression increases in melanoma and is correlated with both tumoral progression and a bad prognosis. When SPARC is secreted by melanoma cells, it activates the AKT kinase, destabilizes the p53 tumor suppressor and promotes proliferation and survival. Here we identify the couple SPARC/AKT as a new actor contributing to both innate and acquired resistance to BRAFV600E inhibitors. In addition, we demonstrate that targeting SPARC in melanoma cells increases their sensitivity to both BRAF and MEK inhibitors. Finally we show that lymph node fibroblasts share features of activated fibroblasts and confer resistance to BRAF inhibitors to melanoma cells through the production of a permissive extracellular matrix.

Le cancer de la prostate représente actuellement un problème majeur de santé publique. L’hormonothérapie, par privation de l’axe androgénique, constitue aujourd’hui la seule arme thérapeutique efficace pour les formes avancées. Malgré un taux important de réponse initiale, une forme de résistance survient inéluctablement, conduisant pour la plupart au décès du patient. La progression tumorale vers la résistance à la castration est un processus multifactoriel. Elle peut être associée à une dérégulation de l’axe du récepteur des androgènes, l’activation de voies de survie cellulaire, et favoriser une différenciation cellulaire vers l’acquisition d’un phénotype neuroendocrine androgéno-indépendant. L’objectif de la recherche actuelle repose donc sur l’identification de nouveaux biomarqueurs de résistance thérapeutique afin de proposer de nouvelles cibles permettant de contrecarrer la résistance à la castration. La caractérisation d’une signature moléculaire associée à l’émergence d’une différenciation neuroendocrine du cancer de la prostate résistant à la castration a permis d’identifier la Neuropiline-1, une glycoprotéine transmembranaire impliquée dans le développement neuronal et vasculaire. La répression de la voie du récepteur des androgènes au cours de l’hormonothérapie régule dynamiquement l’expression de la Neuropiline-1 et favorise la résistance à la castration associée à une différenciation neuroendocrine. La Neuropiline-1 joue donc un rôle important dans la résistance thérapeutique puisqu’elle favorise la neuro-transdifférenciation, l’activation de voie de survie cellulaire et altère la sensibilité des cellules cancéreuses à la chimiothérapie. L’étude des voies de signalisation associées à la Neuropiline-1 a permis d’identifier la voie des PKCs, impliquée dans la régulation de la différenciation neuroendocrine du cancer de la prostate. Par conséquent, nous montrons pour la première fois que le ciblage de cette voie activée par la Neuropiline-1 bloque l’évolution tumorale vers la résistance à la castration et augmente l’efficacité d’une chimiothérapie à base de docétaxel sur des modèles précliniques in vivo. Parallèlement, la caractérisation des ligands de la Neuropiline a permis d’identifier de nouveaux partenaires dont la Pléiotrophine, comme nouveau ligand associé aux activités biologiques de la Neuropiline-1 dans la carcinogenèse prostatique. L’ensemble de ces travaux apporte de nouvelles connaissances sur la caractérisation de la résistance thérapeutique du cancer de la prostate, et fournit un réel intérêt clinique porteur d’espoir dans la prise en charge de la maladie neuroendocrine résistante à la castration. / Prostate cancer currently represents a major public health problem. Hormone therapy, by deprivation of androgen signaling axis represents the only efficient treatment for advanced forms. Despite effective initial response, a form of resistance inevitably occurs, leading mostly to patient's death. Tumor progression to castration resistance is a multifactorial process. It can be associated to dysregulation of the androgen receptor axis and activation of cell survival pathways, and thus promotes cell differentiation towards the acquisition of an androgen-independent neuroendocrine phenotype. Therefore, the goal of current research is based on the identification of new biomarkers of therapeutic resistance to propose new targets to counteract the castration resistance. The characterization of a molecular signature associated with the emergence of a neuroendocrine castration-resistant prostate cancer identified Neuropilin-1, a transmembrane glycoprotein involved in vascular and neuronal development. Down-regulation of androgen receptor axis during hormone therapy dynamically regulates the expression of Neuropilin-1 and promotes resistance to castration associated with neuroendocrine differentiation. Thus, Neuropilin-1 plays an important role in the therapeutic resistance since it favors the neuro-transdifferentiation, activation of cell survival pathway and alters the sensitivity of cancer cells to chemotherapy. Moreover, the study of signaling pathways associated with Neuropilin-1 and involved in the regulation of the neuroendocrine differentiation of prostate cancer has identified the PKCs pathway. We show for the first time that targeting this pathway activated by Neuropilin-1 blocks tumor evolution towards resistance to castration and increases the efficacy of docetaxel-based chemotherapy in preclinical models in vivo. In parallel, the characterization of Neuropilin’s ligands identified new partners, including Pleiotrophin, as a new ligand associated with Neuropilin-1 biological activities in prostate carcinogenesis. All this work provides new knowledge in the characterization of therapeutic resistance in prostate cancer, and supports a real promising clinical value in the treatment of neuroendocrine castration-resistant form of the disease.

L'identification de biomarqueurs et de nouvelles cibles thérapeutiques constitue un enjeu majeur de la recherche biomédicale visant au développement de la médecine personnalisée. L'objectif de cette thèse est d'étudier, à l'aide de puces à ADN, les modulations transcriptionnelles associées à la pathogénèse et à la réponse thérapeutique dans le cas de deux pathologies: l'infection par le Virus de l'Hépatite C (VHC) et la Polyarthrite Rhumatoïde (PR).Des biomarqueurs prédictifs de la réponse au traitement standard interféron ont été identifiés grâce à un modèle cellulaire ex vivo. Par ailleurs, l'analyse de données d'expression de deux modèles d'infection par le VHC (réplicon et infectieux) a permis de mettre en évidence les modulations transcriptionnelles résultant de l'activité antivirale de la chloroquine, une alternative potentielle anti-VHC. Dans le cas de la PR, nous avons identifié des biomarqueurs dont l'expression est corrélée au succès thérapeutique de l'anti-TNF Enbrel. / The identification of biomarkers and new therapeutic targets is a major challenge of biomedical research for the development of personalized medicine. The objective of this thesis is to study, using DNA microarrays, transcriptional modulations associated with the pathogenesis and therapeutic response in the case of two diseases: infection with Hepatitis C Virus (HCV) and Rheumatoid Arthritis (RA).Predictive biomarkers of response to standard interferon treatment were identified using an ex vivo cell model. Furthermore, analysis of expression data of two models of infection with HCV (replicon and infectious) has highlighted the transcriptional modulations resulting from the antiviral activity of chloroquine, a potential anti-HCV alternative. In the case of RA, we have identified biomarkers whose expression correlates with the therapeutic success of Enbrel anti-TNF drug.

Les thiopurines sont des médicaments cytotoxiques et immunosuppresseurs largement prescrits, notamment dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Ils représentent l’un des meilleurs exemples d’application clinique de la pharmacogénétique avec le dépistage du déficit en thiopurine S-méthyltransférase (TPMT), enzyme clé du métabolisme des thiopurines. La variabilité interindividuelle de la réponse à ces médicaments rend nécessaire leur optimisation thérapeutique. Ce travail de thèse a d’une part, analysé les relations entre activité TPMT et concentrations des métabolites thiopuriniques, et d’autre part, recherché des facteurs associés à la résistance aux thiopurines. A l’aide d’une base de données pharmacogénétiques hospitalière et d’une étude « PheWAS » à partir d’un entrepôt de données cliniques, nous avons analysé la distribution et la corrélation génotype-phénotype pour la TPMT, en lien avec les concentrations des métabolites thiopuriniques. Nous avons observé qu’une activité TPMT très élevée (phénotype « ultra-rapide ») était associée à des paramètres clinico-biologiques reflétant une maladie évolutive et un traitement inefficace dans les MICI. De plus, une étude clinique rétrospective dans les MICI pédiatriques a permis d’identifier des facteurs associés à la lymphopénie observée sous thiopurines. Enfin, à partir d’un modèle in vitro fondé sur des lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL) sélectionnées, nous avons établi une signature transcriptomique, incluant 32 gènes, prédictive de la résistance aux thiopurines. Une analyse fonctionnelle bioinformatique a abouti à l’identification de voies métaboliques liées à la protéine p53 et au cycle cellulaire, ainsi que des mécanismes moléculaires associés à la résistance aux thiopurines. En conclusion, ce travail de thèse, qui a exploré la variabilité de réponse aux thiopurines et tout particulièrement la résistance à ces médicaments, propose des hypothèses pour l’individualisation et l’optimisation thérapeutique des thiopurines. / Thiopurines are cytotoxic and immunosuppressive drugs widely prescribed, mainly in inflammatory bowel disease (IBD). They constitute one of the best success story of pharmacogenetic implementation into clinical practice based on the screening of thiopurine S-methyltransferase (TPMT) deficiency, a key enzyme in thiopurine metabolism. Optimization of thiopurine response is challenging because of its large interindividual variability such as inefficacy and toxicities. This thesis has explored, on one hand, the relationships between TPMT activity and metabolite concentrations, and on the other hand, factors associated with thiopurine inefficacy. Using a primary care pharmacogenetic database, we first analyzed TPMT distribution and genotype-phenotype correlation, in relation with thiopurine metabolites in a large population. Using a PheWAS study based on a clinical data warehouse we then reported that a very high TPMT activity (“ultra-rapid” phenotype) was associated with parameters of active IBD and poor response to thiopurines. Furthermore, a retrospective study in pediatric IBD identified factors predicting the occurrence of lymphopenia during thiopurine therapy. Finally, using a lymphoblastoid cell line (LCL) in vitro model, we established a transcriptomic signature, including 32 genes predicting thiopurine cellular resistance. A bioinformatic functional analysis identified metabolic pathways in relation with p53 and cell cycle, as well as molecular mechanisms associated with thiopurine resistance. To conclude, this research work, focusing on the variability of thiopurine response and mainly therapeutic resistance, provides new hypotheses to individualize and optimize therapeutic response to thiopurines.

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