This work describes the fascinating interplay between two tumor suppressors Prostate apoptosis response-4 (Par-4) and p53. The guardian of the genome, p53, is frequently mutated in human cancers, and may contribute to therapeutic resistance. However, p53 is intact and functional in normal tissues, and we observed that specific activation of p53 in normal fibroblasts could induce apoptosis selectively in p53-deficient cancer cells. This paracrine apoptotic effect was executed by Par-4 secreted in response to p53 activation. Accordingly, activation of p53 in wild-type mice, but not in p53-/- or Par-4-/- mice, caused systemic elevation of Par-4 that induced apoptosis of p53-deficient tumor cells. Mechanistically, p53 induced Par-4 secretion by suppressing the expression of UACA, a binding partner of Par-4, and thereby releasing Par-4 from sequestration by UACA. Thus, normal cells can be empowered by p53 activation to induce Par-4 secretion for inhibition of therapy-resistant tumors. Conversely, our studies have also revealed a definite role for Par-4 in regulating p53 expression. The pro-apoptotic tumor suppressor Par-4 is lost, down-regulated, inactivated or mutated in a number of cancers. Loss of Par-4 is associated with therapeutic resistance and poor disease prognosis, yet the mechanism for resistance is not clearly understood. Using genetically matched cells, we show that Par-4 expression is required for stabilization and function of the tumor suppressor p53, which constitutes the hub of signaling networks controlling important cellular and organismal phenotypes. In particular, the expression of p53 protein and its stabilization in response to genotoxic stress were remarkably attenuated in response to Par-4 loss. Accordingly, Par-4-null or -knockdown cells demonstrated increased resistance to apoptosis induced by genotoxic stress. Par-4 loss resulted in elevated Mdm2 activity, which is known to cause p53 degradation. Our findings suggest that Par-4 stabilizes p53 by inhibiting Akt-mediated phosphorylation of Mdm2 that is known to prevent translocation of Mdm2 into the nucleus for p53 ubiquitination and degradation. These studies identify a novel regulatory relationship between two tumor suppressors and may provide a better understanding of therapeutic resistance in tumors with p53 wild type status.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2002. / Härtill 5 uppsatser.

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Study program: Pharmacy Author: Simona Novotná Supervisor: RNDr. Klára Konečná, Ph.D. Title of diploma thesis: Advanced antibacterial activity testing of candidate newly synthesized compounds Background: The aim of this thesis was to perform an extended study of the antibacterial activity of selected newly synthesized rhodanine derivatives. In this study, activity against clinical isolates of bacterial strains of the genus Staphylococcus and Enterococcus was evaluated. The main part of the work also includes the evaluation of the antibacterial activity of one selected substance in combination with commercially available antibiotics using the checkerboard method. Methods: Evaluation of the antibacterial activity of tested substances was performed using the broth microdilution method according to EUCAST guidelines (with minor modifications). The activity of these substances was evaluated against clinical isolates of bacteria of the genera Staphylococcus and Enterococcus and one Staphylococcus aureus MRSA reference strain (ATCC 43300, CCM 4750). For a selected compound with a demonstrably promising antistaphylococcal effect, the combined effect of this substance was tested with three...

The aim of the current study is to study characteristics of high-risk cancer cells within the childhood disease neuroblastoma (NB) by mapping regrowth after treatment with the chemotherapy doxorubicin (doxo). The cell-line SK-N-BE(2)-C (BE(2)-C) was used as a model. Results from a previous study by Hultman et al., (2018) have indicated that while a majority of BE(2)-C cells could be shown resilient to a 1 μM dose of doxorubicin (doxo), only a very small fractions had the capacity for immediate replication following a single or double treatment of doxo (“remaining replicating cells”; RRC). The current study aims to investigate if RRC are responsible for regrowth. Cultured BE(2)-C cells were exposed to doxo and labelled with the nucleoside analogues EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) and BrdU (5-bromo-2-deoxyuridine). The results from the current study indicated that the RRC subpopulation might not be responsible for regrowth since the nucleoside labelling was not shown to be present in the cells of the regrowing colonies. However, technical challenges, e.g. the settings of thresholds for EdU and BrdU detection, in combination with the dilution of DNA markers in replication, call for further studies using additional methods, e.g. isotope markers, in order to firmly conclude that other subpopulation(s) than the RRC population are responsible for regrowth. Apart from studying cell populations responsible for regrowth, a pilot study was performed including another combination of treatment using an ATM-inhibitor (KU-60019) together with the chemotherapy doxo. There were some measurement points missing, but the current results indicate that regrowth is postponed when the ATM-inhibitor is added in combination with single or double treatment of doxo. The research procedures and processes involved in this thesis, are similar to those included in the syllabi for the natural science subjects for the upper secondary school. This underlines the importance of studying inquiry and laboratory work. A literature review was performed, analysing current research on open-and closed ended laboratory work. Ten research articles were collected and characterized by natural science subject, type of laboratory style (open or closed) and student learning competences. Findings from the current study indicate that open-ended laboratory work promotes student interest in the subject. The learning competences problem-solving ability and procedure ability are most commonly studied in laboratory work based on the results from the current study. / Syftet med studien är att studera hög-risk cancerceller inom barncancersjukdomen neuroblastom (NB), genom att kartlägga återväxt efter kemoterapi-behandling med doxorubicin (doxo). En multiresistent neuroblastom cell-linje med hög-risk egenskaper, SK-N-BE(2)-C( BE[2]-C), användes som modell. Enligt en tidigare studie på BE(2)-C celler, utförd av Hultman et al., (2018), kan efter en enkel eller dubbelbehandling med doxo majoriteten av cellerna överleva, men endast en mycket liten andel kan också omedelbart fortsätta dela sig. Dessa celler benämndes som ”kvarvarande replikerande celler” (RRC). I denna studie undersöktes hypotesen att RRC är ansvariga för återväxt efter doxo-terapi, hypotetiskt återspeglande situationen vid återfall hos patienten. BE(2)-C celler odlades in vitro i petriskålar, behandlades med doxo, och analyserades sedan i mikroskop genom att använda två kemiska markörer för cell-delning; EdU (5-etynyl-2’-deoxyuridin) och BrdU (5-bromo-2-deoxyuridin). Intressant nog, men något oväntat, indikerar resultaten att RRC troligen inte är ansvariga för återväxt. Detta skulle då tyda på att återväxten orsakas av andra cellpopulationer, utan förmåga att omedelbart efter kemoterapin fortsätta dela sig. Dock förekom tekniska utmaningar med valda metoder, t.ex. gränsvärdena för EdU- och BrdU-detektering, i kombination med utspädningen av DNA-markörer vid replikation. Därför krävs ytterligare studier med användning av andra metoder, t.ex. isotopmarkörer, för att fastställa vilka subpopulationer som är ansvariga för återväxt. Utöver att studera cellpopulationer ansvariga för återväxt så genomfördes även en pilotstudie med en kombination av doxo och annan typ av kemoterapi riktad mot cellens förmåga att reparera DNA skador; en ATM-inhibitor (KU-60019). Pilotstudien indikerar att återväxten av BE(2)-C förskjuts vid närvaro av KU-60019, både i kombination med enkel eller dubbelbehandling av kemoterapin doxo. Det naturvetenskapliga arbetssättet i denna studie, vilket inkluderas i ämnesplanerna för de naturvetenskapliga ämnena för gymnasieskolan, understryker betydelsen av att studera laborativt arbete. En litteraturstudie genomfördes med fokus på öppna och slutna laborationer. Tio forskningsartiklar analyserades och karaktäriserades; typ av laborationsstil (öppen eller sluten) och elevers lärandekompetenser. Resultatet från denna studie indikerar att öppna laborationer bidrar till att öka elevers intresse. Vidare visar resultatet att laborativt arbete i skolan inkluderar utvecklingen av främst problemlösningsförmågan och procedurförmågan. Forskningsprocedurer och processer involverade i detta examensarbete diskuteras.

Le mélanome est le cancer de la peau le plus dangereux : il est capable de métastaser rapidement vers les ganglions et les viscères, et est réfractaire aux chimio/radiothérapies. De nouvelles thérapies ciblant la kinase BRAFV600 retrouvée dans 60% des mélanomes ont montré des effets spectaculaires en termes de survie globale et sans progression de la maladie. L’efficacité de ces thérapies est compromise par l’apparition fréquente de résistances. Les cellules cancéreuses sont ancrées au sein d’un microenvironnement avec lequel elles interagissent. Elles profitent de facteurs solubles du stroma et de l’adhésion à la matrice extracellulaire (MEC) pour survivre face aux thérapies. La protéine matricellulaire SPARC orchestre les interactions entre les cellules saines ou cancéreuses et leur microenvironnement. Absente dans les mélanocytes, son expression est initiée et augmentée dans les mélanomes, corrélée à la progression tumorale et à un mauvais pronostic clinique. Lorsqu’elle est sécrétée par les cellules de mélanome, elle active la kinase AKT, déstabilise le suppresseur de tumeur p53 et favorise la prolifération/survie tumorale. Nous avons montré que le module SPARC/AKT est un nouveau déterminant de la résistance innée ou acquise des mélanomes mutés BRAFV600 aux anti-BRAF, et mis en évidence l’intérêt du ciblage de SPARC en combinaison avec des anti-BRAF ou -MEK pour optimiser/restaurer la sensibilité des mélanomes à ces inhibiteurs. Nous avons aussi montré que les fibroblastes ganglionnaires ont des caractéristiques de fibroblastes activés, et confèrent une résistance aux anti-BRAF aux cellules de mélanomes en générant une MEC permissive à laquelle elles adhérent. / Melanoma is the most dangerous form of skin cancer due to its high metastatic potential and its resistance to both classical chemo- and radiotherapies. New targeted therapies directed against the V600E oncogenic form of BRAF found in about 60% of patients have demonstrated spectacular efficacy both in terms of progression free and overall survival. However most patients invariably relapse after a few months due to resistance mechanisms. Cancer cells are anchored and interact constantly with their microenvironment. Both soluble factors and the extracellular matrix produced by stromal cells have been shown to contribute to cancer cell resistance to therapies. SPARC is a matricellular protein that orchestrates interactions between normal and/or cancer cells and their microenvironment. While it is absent in melanocytes, SPARC expression increases in melanoma and is correlated with both tumoral progression and a bad prognosis. When SPARC is secreted by melanoma cells, it activates the AKT kinase, destabilizes the p53 tumor suppressor and promotes proliferation and survival. Here we identify the couple SPARC/AKT as a new actor contributing to both innate and acquired resistance to BRAFV600E inhibitors. In addition, we demonstrate that targeting SPARC in melanoma cells increases their sensitivity to both BRAF and MEK inhibitors. Finally we show that lymph node fibroblasts share features of activated fibroblasts and confer resistance to BRAF inhibitors to melanoma cells through the production of a permissive extracellular matrix.

Background: A highly desmoplasmic microenvironment, the mutational landscape, and intra-tumoral heterogeneity contribute to the therapy resistance in pancreatic ductal adenocarcino-ma (PDAC). Due to higher precision, proton beam therapy is regarded beneficial compared to standard photon radiotherapy, although the role of radiotherapy is still ambiguous in PDAC. Cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) via integrins is well-known to mediate radi-ochemoresistance in various tumor entities. In PDAC, β1 integrins are associated with tumor progression. However, their role in radiochemoresistance is yet to be unraveled. Consequently, a comparative evaluation of cell survival and therapy sensitization after inhibition of β1 integ-rins or other survival-promoting protein kinases combined with either photon or proton irradia-tion and the underlying molecular mechanisms was carried out in this work. Materials and Methods: The expression of β1 integrins in PDAC and the correlation with pa-tient survival were assessed using publicly available patient data. The effect of β1 integrin inhi-bition by inhibitory antibodies or depletion on PDAC cell survival upon photon and proton irra-diation was explored using the tumoroid formation assay in three therapy-naïve and one radio-resistant PDAC cell lines grown in more physiological 3D laminin-rich ECM. Protein expression and cellular localization of β1 integrins were analyzed applying Western blot and immunofluo-rescence in the cell line panel. Basal molecular differences and those upon β1 integrin inhibi-tion were determined by a broad-spectrum kinome profiling in therapy-naïve and radioresistant 3D PDAC cultures. A potential interrelation of specific kinases with β1 integrin signaling in re-sponse to radiation was investigated in a single and double knockdown screen. The effects of photon and proton irradiation on PDAC cell survival of five 3D cultured PDAC cell lines were comparatively assessed using the 3D tumoroid formation assay. Molecular alterations upon both radiation types were identified by a broad-spectrum phosphoproteome analysis and Western blot. The exploitation of uniquely altered molecules and other signal transduction and DNA repair molecules for specific sensitization to photon and proton radiation was evaluated using specific biologicals in 3D cultured PDAC cell lines. Results: β1 integrins are overexpressed in PDAC compared to the normal pancreas, and the expression correlates with poorer patient survival. β1 integrin expression and localization var-ied cell line-dependently in the PDAC cell line panel. β1 integrin inhibition elicited an increase in radiosensitivity in all analyzed therapy-naïve and radioresistant 3D PDAC cultures, although less prominent in the latter. In line, the extent of kinase deregulation induced by AIIB2 was lower in the radioresistant 3D PDAC cultures. Double targeting of specific kinases with β1 in-tegrins further increased the radiosensitization in the therapy-naïve 3D PDAC cell cultures, whereas in the radioresistant counterpart, the effect was weak. Further, Erk2, PKD1, and CK1δ were revealed as potential interactors in the β1 integrin-mediated response to radiation. Proton irradiation showed a higher efficacy in the reduction of PDAC cell survival than photon irradia-tion. On the molecular level, irradiation with protons induced more phosphoproteomic altera-tions than photon radiation. Targeting of molecules uniquely altered upon irradiation failed to sensitize 3D PDAC cultures radiation type-specifically. However, a similar degree of radiosen-sitization for proton and photon irradiation in 3D PDAC cultures was observed upon targeting signal transduction and DNA repair proteins. Targeting non-homologous end joining (NHEJ)-specific proteins increased cellular radiosensitivity exceedingly for both radiation types in all 3D PDAC cell cultures. Conclusion: This work revealed a fundamental role of β1 integrins in intrinsic and acquired radioresistance of PDAC. However, to substantially overcome acquired radioresistance, further investigation is needed. Furthermore, a similar efficacy of proton and photon irradiation when combined with targeted therapies was demonstrated. These results suggest that multitargeting approaches based on targeting of β1 integrins or NHEJ-specific molecules combined with pho-ton or proton irradiation may turn out particularly promising. The strong radiosensitizing poten-tial of targeting these molecules may enable a more frequent use of radiotherapy for PDAC patient treatment. / Hintergrund: Ein stark desmoplasmatisches Mikromilieu, das Mutationsprofil und die intra-tumorale Heterogenität tragen zur Therapieresistenz des Pankreaskarzinoms bei. Aufgrund der höheren Präzision wird die Protonentherapie als vorteilhaft gegenüber der Standard Pho-tonentherapie angesehen, obwohl ihre Wirksamkeit im Pankreaskarzinom noch ungewiss ist. Es ist bekannt, dass die zelluläre Adhäsion an die extrazelluläre Matrix (EZM) über Integrine die Radiochemoresistenz in verschiedenen Tumorentitäten vermittelt. Hierbei stehen β1 In-tegrine in Zusammenhang mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Welche Rolle die β1 Integri-ne in der Radiochemoresistenz im Pankreaskarzinom spielen ist jedoch noch nicht bekannt. In dieser Arbeit wurde daher eine vergleichende Analyse des Zellüberlebens und der Therapie-empfindlichkeit nach Hemmung von β1 Integrinen oder anderen überlebensfördernden Pro-teinkinasen in Kombination mit Photonen- oder Protonenbestrahlung sowie der zugrundelie-genden molekularen Mechanismen durchgeführt. Material und Methoden: Die Expression von β1 Integrinen im Pankreaskarzinom und die Kor-relation mit dem Patientenüberleben wurden mittels öffentlich verfügbarer Patientendaten be-stimmt. Die Wirkung der β1-Integrin-Hemmung durch inhibitorische Antikörper oder mittels knockdown auf das Überleben von Pankreaskarzinomzellen bei Bestrahlung mit Photonen und Protonen wurde durch den Tumoroidbildungsassay in drei therapienaiven und einer strahlen-resistenten Pankreaskarzinomzelllinien untersucht. Diese wurden in physiologischer, 3D Lami-nin-reicher EZM kultiviert. Die Proteinexpression und die zelluläre Lokalisation von β1 Integri-nen wurden in allen Zelllinien mittels Western Blot und Immunfluoreszenz analysiert. Basale molekulare Unterschiede und solche nach Hemmung von β1 Integrinen wurden durch eine Breitspektrum-Kinomanalyse in therapienaiven und strahlenresistenten 3D-Pankreaskarzinomkulturen bestimmt. Eine mögliche Wechselbeziehung spezifischer Kinasen mit der β1 Integrin-vermittelten Strahlenantwort wurde in einem Einzel- und Doppel-knockdown Screen untersucht. Die Effekte der Bestrahlung mit Photonen und Protonen auf das Überleben von Pankreaskarzinomzellen wurden vergleichend anhand des Tumoroidbildungsassays in fünf 3D-kultivierten Pankreaskarzinomzelllinien bewertet. Durch beide Strahlungstypen indu-zierte molekulare Veränderungen wurden durch eine Breitspektrum-Phosphoproteomanalyse und mittels Western Blot identifiziert. Die Nutzung einzigartig veränderter Moleküle sowie an-derer Signaltransduktions- und DNA-Reparaturmoleküle zur spezifischen Sensibilisierung für Photonen- und Protonenstrahlung wurde untersucht. Dies erfolgte durch eine gezielte Hem-mung dieser Moleküle durch spezifische Biologika in 3D-kultivierten Pankreaskarzinomzellli-nien. Ergebnisse: β1 Integrine sind im Pankreaskarzinom im Vergleich zum gesunden Pankreas überexprimiert und ihre Expression korreliert negativ mit dem Patientenüberleben. Die Expres-sion und Lokalisierung der β1 Integrine variierte zelllinienabhängig in den Pankreaskarzinom-zelllinien. Die Hemmung der β1 Integrine führte zu einer Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit in allen analysierten therapienaiven und strahlenresistenten 3D kultivierten Pankreaskarzinom-zelllinien, auch wenn diese in den letzteren weniger stark ausfiel. Auch der Grad der durch die Hemmung induzierten Deregulierung von Kinasen in den strahlenresistenten 3D Pankreaskar-zinomzellkulturen war geringer. Der gleichzeitige knockdown spezifischer Kinasen mit β1 In-tegrinen potenzierte die Strahlenempfindlichkeit in den therapienaiven 3D Pankreaskarzinom-zellkulturen, während diese im strahlenresistenten Pendant nur wenig beeinflusst wurde. Fer-ner wurden Erk2, PKD1 und CK1δ als potenziell beteiligte Kinasen in der durch β1 Integrine vermittelten Strahlenantwort entdeckt. Die Bestrahlung mit Protonen zeigte eine höhere Wirk-samkeit bei der Verringerung des Pankreaskarzinomzellüberlebens als die Photonenbestrah-lung. Auf molekularer Ebene induzierte die Protonenbestrahlung mehr Veränderungen im Phosphoproteom als die Photonenbestrahlung. Die gezielte Hemmung von einzigartig verän-derten Molekülen sensibilisierte die 3D Pankreaskarzinomzellkulturen nicht Strahlungsart-spezifisch. Jedoch konnte eine ähnliche Effizienz der beiden Strahlungstypen nach Hemmung gewisser Signaltransduktions- und DNA-Reparaturproteine in 3D Pankreaskarzinomzellkultu-ren gezeigt werden. Die zelluläre Strahlenempfindlichkeit gegenüber beiden Strahlungsarten wurde hierbei besonders durch die Hemmung spezifischer Proteine des non-homologous end joining (NHEJ) in allen 3D Pankreaskarzinomzellkulturen erhöht. Schlussfolgerung: Diese Arbeit konnte eine wesentliche Rolle von β1 Integrinen bei der intrinsischen und erworbenen Strahlenresistenz im Pankreaskarzinom ermitteln. Um die Strah-lenresistenz jedoch gänzlich zu überwinden, sind weitere Untersuchungen erforderlich. Des Weiteren wurde eine ähnliche Wirksamkeit von Protonen- und Photonenbestrahlung in Kombi-nation mit gezielten Therapien gezeigt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Multi-Targeting-Ansätze, die auf der Hemmung von β1 Integrinen oder NHEJ-spezifischen Molekülen in Kom-bination mit Photonen- oder Protonenbestrahlung basieren, ausgesprochen vielversprechend sein können. Angesichts des enormen Potentials zur Steigerung der Strahlenempfindlichkeit durch die Hemmung dieser Moleküle könnte eine häufigere Anwendung der Strahlentherapie bei Pankreaskarzinompatienten ermöglicht werden.

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