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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24788号 / 医博第4980号 / 新制||医||1066(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 伊達 洋至, 教授 松田 道行, 教授 後藤 慎平 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Les cellules tumorales circulantes (CTC) représentent un large champ de recherche susceptible de fournir des informations tant cliniques que fondamentales. Les CTC proviennent de tumeurs primitives ou métastatiques et représentent une population hétérogène de cellules très rares dans le flux sanguin. Leur caractérisation moléculaire est un défi technologique qui requiert des méthodes très sensibles et spécifiques. Dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC), les CTC ont un véritable intérêt car les biopsies tumorales ne permettent pas toujours de réaliser les analyses moléculaires nécessaires au choix du traitement. De plus, elles ne sont probablement pas représentatives de l’hétérogénéité tumorale.L’objectif de ma thèse a été de rechercher dans les CTC de patients atteints de CBNPC porteurs du remaniement de gène ALK, des anomalies génomiques connues pour être des biomarqueurs de sensibilité et de résistance aux thérapies ciblant cet oncogéne, ainsi qu’à caractériser les CTC porteuses de ces anomalies. La première partie du projet a consisté au développement d’une méthode d’hybridation in situ de l’ADN (fluorescent in situ hybridization, FISH) adaptée à un système d’enrichissement des CTC par filtration, la FA-FISH (filter adapted FISH) (brevet PCT/FR2011/052688). Nous avons ensuite développé une approche de microscopie semi-automatisée permettant la digitalisation et l’analyse de ces CTC enrichies par filtration (Pailler, BMC Cancer, 2016). Dans la seconde partie du projet, nous avons mis en œuvre cette méthode et montré pour la première fois qu’il est possible d’identifier le remaniement de gène ALK dans les CTC de patients porteurs de ce réarrangement dans la tumeur (Pailler, J Clin Oncol, 2013). Les CTC remaniées présentent un unique réarrangement de type break-apart, y compris chez des patients présentant exclusivement une autre forme de réarrangement dans la tumeur, et un phénotype mésenchymateux. Cette observation nous a amené à émettre l’hypothèse que ces CTC ont acquis des propriétés migratoires et d’invasivité, et pourraient résulter d’une forte sélection clonale. Nous avons ensuite étendu cette observation aux patients porteurs du remaniement ROS1 et rapporté pour la première fois la détection de ce remaniement dans des CTC (Pailler, Ann Oncol, 2015). Dans la troisième partie du projet, nous avons émis l’hypothèse que certaines sous-populations de CTC anormales pour le gène ALK, mesurées avant et à deux mois de traitement par le crizotinib, pourraient prédire l’évolution clinique des patients traités. Dans une cohorte élargie de patients, nous avons montré que l’évolution sous crizotinib du nombre de CTC présentant exclusivement des gains de copies natives du gène ALK est un biomarqueur « surrogate » d’efficacité du traitement pouvant permettre d’identifier les patients qui ont un risque élevé de progresser rapidement (Pailler, soumis). Finalement, dans la quatrième partie du projet, nous avons recherché dans des CTC des mutations de résistance aux inhibiteurs de ALK. Nous avons mis au point des technologies permettant de caractériser phénotypiquement, isoler et analyser moléculairement (séquençages ciblés et d’exomes) des CTC à l’échelle de cellule unique. Les expériences sur lignées cellulaires ont permis de valider les approches et les analyses d’échantillons de patients sont en cours.Dans ce travail, nous montrons qu’il est possible de caractériser des anomalies génomiques dans les CTC de patients porteurs du remaniement ALK à différentes étapes de leur maladie, et ainsi d’identifier des biomarqueurs de sensibilité et d’efficacité à une thérapie ciblée. Ce travail ouvre des perspectives sur la personnalisation des traitements qui pourraient reposer sur l’analyse génomique non invasive des CTC. Il apporte en outre des éléments nouveaux sur les caractéristiques biologiques des CTC chez ces patients, certaines étapes du processus métastatique et la diversité génomique de ces cancers. / Circulating tumor cells (CTCs) are a broad field of research which may provide both clinical and basic information. CTCs migrate from primitive or metastatic tumors and represent a heterogeneous population of very rare cells in the blood stream. The molecular characterization of CTCs is a technical challenge requiring highly sensitive and specific methods. Because tumor biopsies are invasive and in some cases associated with risk in non-small-cell lung cancer (NSCLC), CTCs may offer an attractive option to analyze tumor genomic alterations and detect molecular biomarkers. CTCs could provide a more comprehensive picture of the tumor content than single tumor biopsies.The aim of my thesis was to characterize genomic abnormalities in CTCs from ALK-rearranged NSCLC patients and identified biomarkers of sensitivity and resistance to targeted therapies. The first part of the project consisted in the development of a fluorescent in situ hybridization (FISH) method adapted to CTCs enriched by filtration, the FA-FISH (filter-adapted-FISH) (patent PCT/FR2011/052688). Then, we developed a method for the semi-automated microscopy of filtration enriched CTCs (Pailler, BMC Cancer, 2016). In the second part of my project, using this method, we provided the first proof-of-concept that ALK-rearrangement can be detected in CTCs of patients with ALK-rearranged NSCLC (Pailler, J Clin Oncol, 2013). We showed that CTCs from these patients harbor a unique ALK break-apart rearrangement, including patients presenting another form of rearrangement in the biopsy, and a mesenchymal phenotype. This suggests that these CTCs may arise from a clonal selection of tumor cells that have acquired invasive and migratory properties and possibly the potential to drive metastatic progression. Then, we characterized CTCs from patients with ROS1-rearranged NSCLC and reported for the first time the detection of ROS1-rearrangement in CTCs (Pailler, Ann Oncol, 2015). In the third part of the project, we evaluated whether CTCs with abnormal ALK-FISH patterns monitored under crizotinib (baseline and early sampling at 2 months) may inform on treatment benefit in a cohort of ALK-rearranged patients treated by crizotinib. In an extended cohort of patients, the dynamic change in the numbers of CTCs with a gain of ALK-native copies was associated with the progression-free survival and thus may be a surrogate biomarker for crizotinib efficacy (Pailler, submitted). These results show that the molecular analysis of CTCs performed under treatment could help to stratify patients at risk of early resistance to crizotinib. Finally, in the last part of my project, we sought to evaluate whether CTCs could be used for identifying resistance mutations to ALK inhibitors. We developed technologies to characterize, isolate and molecularly (targeted sequencing and exome sequencing) analyze CTCs at the single cell level. Experiments on cell lines allowed to validate these technical processes; Experiments on patient samples are ongoing.In this work, we characterize genomic abnormalities present in CTCs from ALK-rearranged patients at different stages of the disease and identify biomarkers of sensitivity and efficacy to targeted therapies. Our results provide new perspectives on the potential of CTCs for personalizing treatments in NSCLC patients. Furthermore, our findings may offer new insights on the biological characteristics of CTCs in ALK-rearranged patients, their overall role in the metastatic progression and the genomic diversity of these cancers.

Chez Arabidopsis thaliana, le silencing transcriptionnel est associé notamment aux modifications post-traductionnelles des queues des histones et à la méthylation des cytosines en contexte CG, CHG et CHH (où H peut être indifféremment T, A ou C). Plusieurs voies indépendantes conduisent à la méthylation de l’ADN en tout contexte via les méthyltransférases. A contrario, ROS1, une ADN déméthylase, « élague » les profils de méthylation et prévient ainsi d’une hyperméthylation du génome. Or, de façon intéressante, plusieurs mutants impliqués dans les voies de méthylation de l’ADN voient l’expression du gène ROS1 diminuer, ce qui trahit l’existence d’une boucle de rétrocontrôle négative entre les voies de méthylation et de déméthylation de l’ADN. Nous avons donc réalisé un crible génétique afin d’identifier un régulateur de l’expression de ROS1. Pour cela, nous avons utilisé une lignée pROS1:GUS constituée du gène rapporteur de la glucuronidase sous contrôle du promoteur de ROS1. Dans le fond mutant nrpd1a-4, le gène de ROS1 et de la glucuronidase sont sous-exprimés. Le crible consiste alors à identifier un mutant qui relâche l’expression de la glucuronidase et de ROS1 dans le fond mutant nrpd1a-4. Six mutants présentent une expression de la glucuronidase plus forte que le témoin pROS1:GUS dans le fond nrpd1a-4. Cependant, contrairement à ce qui était attendu, l’expression de ROS1 endogène est plus basse encore que chez pROS1:GUS dans le fond nrpd1a-4.Face à ses résultats, nous avons alors réorienté la thèse vers l’étude d’une voie de contournement du silencing des éléments répétés. En effet, lorsque l’on applique un stress thermique de 37°C durant 24h, l’on observe un relâchement du silencing de ces derniers. Toutefois, aucune modification épigénétique connue ne semble être impliquée. Pour étudier ce phénomène, nous disposons d’une lignée L5 qui, dans des conditions normales de culture, voit son transgène soumis aux mécanismes de silencing. Parce que la construction L5 comprend plusieurs répétitions de la glucuronidase sous contrôle du promoteur 35S, elle est alors assimilée à n’importe quel autre élément répété et, à ce titre, se retrouve être également exprimée après stress thermique. L’équipe a alors réalisé un crible sur cette lignée et a mis en évidence 3-1S, un mutant qui est déficient dans le relâchement du silencing à 37°C. Dans un premier temps, nous avons mis en évidence que le phénotype de 3-1S est dû à une mutation de RH35, une hélicase ARN à boîte DEAD. D’autre part, nos résultats montrent que le gène RH35 est exprimé plus fortement à 37°C et sa protéine présente, en outre, une relocalisation dans ces conditions de stress. RH35 serait, en fait, impliquée de manière plus globale dans le métabolisme des ARN en réponse au stress thermique et jouerait également un rôle dans la réponse au stress thermique et salin. / In Arabidopsis thaliana, transcriptional silencing is associated with histone tail post-translational modifications and cytosine modifications in CG, CHG and CHH contexts (where H can be indifferently T, A or C). Numerous independent pathways lead to DNA methylation in all contexts through méthyltransférases. Conversely, the DNA demethylase ROS1 “prunes” methylation profiles and prevents genome hypermethylation. Interestingly, several mutants which are involved in DNA methylation pathways present a decrease in ROS1 gene expression, what reveals the existence of a negative feedback loop between DNA methylation and demethylation pathways. A genetic screening was carried out in order to find a ROS1 regulator. To do this, pROS1:GUS line, which carries the glucuronidase reporter gene under ROS1 promoter, was used. In the nrpd1a-4 mutant, ROS1 and glucuronidase genes are underexpressed. The screen consisted to find a mutant which release glucuronidase and ROS1 gene expression in nrpd1a-4 mutant background. Six mutants presented a higher expression of the glucuronidase than the pROS1:GUS control in nrpd1a-4 background. However, unlike what it was expected, endogene ROS1 expression is even lower than what we have for pROS1:GUS in nrpd1a-4 background.In view of these results, the thesis was redirected toward the study of the silencing circumvention pathway of the repeated elements. Indeed, when heat stress at 37°C during 24h is applied, a release of silencing is observed for repeated elements. Nevertheless, no known epigenetic modifications seem to be involved. To study this phenomenon, we used a L5 line. Its transgene is silenced in standard conditions. Because L5 construct is composed by several glucuronidase repetitions under 35S promoter, it is considered as any other repeated elements and, for this reason, it is also expressed after heat stress. The team performed a genetic screen on this line and found 3-1S, a mutant which is deficient in the release of silencing at 37°C. On the one hand, we demonstrated that 3-1S phenotype is due to a mutation in RH35 DEAD box RNA helicase. On the other hand, our results revealed that RH35 gene is expressed at 37°C and its protein is relocated in heat stress conditions. In fact, RH35 would be involved more globally in RNA metabolism and would play a role in heat and salt stress.

Chez Arabidopsis thaliana, Les gènes d'ARN 5S sont regroupés en blocs situés dans l'hétérochromatine péricentromérique des chromosomes 3,4 et 5. La transcription des gènes d'ARN 5S est régulée par des facteurs épigénétiques altérant notamment leur structure chromatinienne. Une étude a été menée durant les premières étapes du développement post-germinatif pour identifier les évènements et des facteurs conduisant à l'élaboration de telles structures. Nous avons pu observer une décompaction de l'ADNr 5S immédiatement suivie d'une recondensation. Ces phénomènes impliquent respectivement ROS 1 et l'ARN polymérase IV. L'étude des formes Pol IVa et Pol IVb nous indique que Pol IVb, en plus de son activité partenaire de Pol IVa, possède une action spécifique dédiée au locus d'ADNr 5S du chromosome 4. Cette nouvelle activité de Pol IVb, qui est indispensable au silencing et à la compaction de ce locus, semble indépendante de la voie classique de méthylation de l'ADN dépendante des ARN.

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