Wireless networks have become a necessity with the increased mobility in human life. From cellular telephony to the Internet, all types of communication are now provided over wireless networks. However, to offer wireless network coverage over an area requires a potentially expensive infrastructure deployment. Such deployment requires base stations which until now have been completely proprietary to the equipment vendors. Moreover, proprietary equipment is almost always costly and offer less flexibility than standardized modular solutions. This situation results in a high cost for network upgradation and hinders network development. A remedy is available via modularization, hence the Open Base Station Architecture Initiative (OBSAI) is trying to modularize and standardize one of the most expensive elements of the wireless infrastructure, the base station. OBSAI standards aim to modularize the base station architecture and enable true interoperability among the various modules. However, the goal has not yet been achieved due to some features of the standard. This thesis project has studied the standards and pointed out some areas that must be concentrated upon when performing interoperability tests. It also proposes several standards amendments to foster greater interoperability among the modules of a base station. This study focuses on the RP3 interface of the OBSAI specification with the goal of making truly inter-operable baseband and RF modules, thus commoditizing the modules. The result is expected to be lower cost, greater interoperability, faster time-to-market, and more cooperative research. / Langattomat laajakaistaverkot ovat tulleet välttämättömäksi osaksi liikkuvien ihmisten elämää. Lähes kaikki kommunikaatiotarpeet äänipuheluista internettiin pystytään toteuttamaan langattomien verkkojen avulla. Kuitenkin jotta langattomilla verkoilla pystytään tarjoamaan täysi peittävyys yli maan, se vaatii varsin kalliita investointeja verkkoinfrastruktuuriin. Langattomien verkkojen investoinnit koostuvat suurelta osin tukiasemista, jotka tähän asti ovat olleet kullakin verkkotoimittajalla täysin omanlaisensa toteutus. Kun jokainen verkkotoimittaja toteuttaa kaikki tukiaseman osat erilailla, se tarkoittaa että kutakin tukiaseman osia valmistetaan suhteellisesti pienempiä määriä ja sitä myötä niistä tulee mahdollisesti kalliimpia verrattuna standardoituhin modulaarisiin tukiasemaratkaisuihin. Nykyinen tilanne siis osaltaan johtaa siihen että verkkojen rakentaminen ja päivittäminen on kallista. Eräs ratkaisu tähän ongelmaan on tarjolla modulaarisessa tukiasemaratkaisussa ja siksi OBSAI, Open Base Station Initiative, pyrkii modulaarisoimaan ja standardoimaan yhden kalliimmista verkkoinfrastruktuurin osista, tukiaseman. OBSAI standardi pyrkii modularisoimaan tukiasema-arkkitehtuurin ja mahdollistamaan todellisen yhteensopivuuden tukiaseman eri osien välillä. Tätä todellista yhteensopivuutta ei ole vielä täysin pystytty toteuttamaan, johtuen tietyistä standardin epätarkkuuksista. Tässä lopputyössä on analysoitu OBSAI standardia ja identifioitu alueet, joihin pitää keskittyä, kun modulien välistä yhteensopivuutta testataan. Työn lopputulemana myös ehdotetaan useita parannuksia ja muutoksia standardiin, jotta todellinen yhteensopivuus modulien välillä saavutetaan. Painopiste lopputyössä on OBSAI standardin RP3 rajapinta, joka määrittelee kantataajuusosan (BB) ja radiotaajuusosan (RF) välisen rajapinnan. Kun OBSAI standardia saadaan parannettua työssä ehdotetuin toimenpitein, lopputuloksena on oletettavasti alhaisempi tukiaseman kokonaiskustannus, mahdollisuus käyttää yhteensopivia moduleita eri valmistajilta, nopeampi tuotteiden markkinoille vienti sekä parantunut tutkimusyhteistyö eri yritysten välillä. / Trådlösa nät har blivit en nödvändighet i vår allt mer mobila livsstil. Från mobiltelefoni till Internet, trådlösa nät erbjuder många typer av kommunikation. Men att erbjuda trådlös täckning i ett område kan kräva installation av en mängd dyrbar telekomutrustning. En sådan utbyggnad kräver basstationer som fram till nu har varit patentskyddade av respektive leverantör. Och patentskyddad utrustning är oftast både dyrare och mindre flexibel jämfört med standardiserade modulära lösningar. Resultatet är höga kostnader för att uppgradera näten och att utvecklingen försvåras. Ett botemedel är användningen av standardiserade moduler. Därfär försöker Open Base Station Architecture Initiative (OBSAI) att standardisera moduler i ett av de dyraste nätelementen i trådlösa nät, basstationen. OBSAI har som mål att dela upp basstationen i definierade moduler och möjliggöra fullständig interaktion mellan olika moduler. Men på grund av vissa egenskaper hos standarden har detta inte lyckats. Denna studie har undersökt standarden och pekar på områden som man måste fokusera på när man utför tester mellan moduler. Dessutom föreslås flera tillägg till standarden för att möjliggöra bättre interaktion mellan basstationens moduler. Studien fokuserar på RP3- gränssnittet med målet att möjliggöra standardiserad interaktion mellan basbands- och radio-moduler, så att dessa moduler kan kommerisialiseras. Det förväntade resultatet är lägre kostnader, bättre interaktion mellan moduler, snabbare marknadsintroduktion och mer samarbete inom forskning och utveckling.

Orientadores: Adriano Rodrigues Azzoni, Anete Pereira de Souza / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T01:06:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Favaro_MariannaTeixeiradePinho_M.pdf: 18876970 bytes, checksum: 4953fcf4a875c09d8246f6deb457b544 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Entrega gênica é uma estratégia muito promissora com grande potencial médico, que consiste na introdução de ácidos nucléicos exógenos, e pode ser aplicada tanto para terapia gênica quanto para vacina de DNA. Contudo seu uso ainda é limitado pela falta de um vetor de entrega ideal, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora muito mais eficientes, os vetores virais ainda despertam preocupações a respeito de sua segurança. Por outro lado, vetores não-virais são muito mais seguros e facilmente manipuláveis, ainda que menos eficientes. Neste contexto, "vírus artificiais" são uma opção interessante, uma vez que são vetores não-virais desenvolvidos para explorar a arquitetura celular de uma forma eficiente, superando uma série de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais, mas mantendo a segurança do DNA plasmidial (pDNA). O principal objetivo da abordagem estudada é explorar os motores moleculares, como dineína, para transportar cargas da periferia para o centrossoma de células de mamíferos através da rede de microtúbulos. Para isso, a cadeia leve Rp3 da dineína foi fusionada a um domínio de interação com DNA (DNA-binding) no N-terminal, e ao peptídeo membrano-ativo TAT no C-terminal. A proteína, nomeada T-Rp3, tem ainda um His-Tag. Esta proteína recombinante construída contém então diferentes domínios para promover condensação do pDNA (DNA binding), para facilitar a entrada na célula e no núcleo (TAT) e para aumentar o escape endossomal (His- Tag), além da própria Rp3 que deve assistir no tráfego intracelular, agindo assim diretamente na maioria dos principais obstáculos intracelulares enfrentados pelos vetores. Estudos de expressão indicam que a proteína recombinante é corretamente expressa em E. coli BL21(DE3). Experimentos de mobilidade em gel de agarose ("gel retardation assay") combinados com estudos de espalhamento de luz e potencial zeta indicam que a proteína efetivamente interage com o pDNA, formando complexos que são pequenos (~95 nm) e positivamente carregados (+28 mV na relação molar de pDNA:proteína 1:8000). Ensaios de transfecção em cultura de células HeLa indicam que T-Rp3 atinge uma eficiência de transfecção muito maior que a proteína nuclear Protamina (aqui usada como controle), chegando a ser 900 vezes maior a expressão relativa do gene repórter na relação molar de pDNA:proteína 1:8000. Na comparação com Lipofectamina 2000TM, um reagente bem caracterizado de transfecção aqui usado como controle positivo, a T-Rp3 demonstrou atingir níveis similares de eficiência, com a vantagem adicional de ser menos citotóxica, conforme evidenciado em ensaios de viabilidade celular. Transfecções realizadas na presença da droga Nocodazol indicam que a eficiência da T-Rp3 depende fortemente da rede de microtúbulos, uma vez que a eficiência é reduzida em 92% quando os microtúbulos estão despolimerizados. A partir das transfecções na presença da droga Cloroquina, pudemos observar que o aprisionamento no endossomo ainda é um fator limitante. Finalmente, ensaios de cromatografia de afinidade realizados com o domínio da cadeia intermediária de dineína imobilizado indicam que a cadeia leve recombinante T-Rp3 mantém a capacidade de interagir com o complexo da dineína. Analisados em conjunto, os resultados apontam para uma grande participação da rede de microtúbulos na eficiência de transfecção de T-Rp3, objetivo inicial deste trabalho / Abstract: Gene delivery is a promising technique with great medical potential that consists in the introduction of exogenous nucleic acids, and can be applied for gene therapy as well as DNA vaccination. However, its use is still limited by the lack of an ideal delivery vector, which is both safe and efficient. Although much more effective, viral vectors still raise several concerns about its safety. On the other hand, non-viral vectors are safer and easier to manipulate, but less efficient. In this context "artificial viruses" are an interesting option, since they are non-viral vectors intended to explore the cell's architecture in an efficient way, to overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers, while still preserving the safety of plasmid DNA (pDNA) vectors. The main objective herein is to exploit molecular motors, like dynein, to transport cargoes from the periphery to the centrosome of mammalian cells via the microtubule network. For that, human dynein light chain Rp3 was fusioned to a N-terminal DNA binding domain and a C-terminal membrane active peptide, TAT. The protein, named T-Rp3, has additionally a His.Tag. The shuttle protein built contains therefore different domains to promote pDNA condensation (DNA binding), to increase cell and nucleus penetration (TAT) and to enhance endosomal escape (His.Tag), besides the Rp3 to assist in the cytosol trafficking, thus covering most of the major obstacles to the vectors in intracellular level. Expression studies indicate that the fusion protein was correctly expressed in soluble form using E. coli BL21(DE3) strain. Gel retardation assays, dynamic light scattering and zeta potential studies indicate an efficient complex formation between pDNA and the fusion protein, resulting in a particle that is both small (~95 nm) and potivelly charged (+28 mV in the molar ratio of pDNA:protein 1:8000) Transfection of cultured HeLa cells indicates that T-Rp3 has a much higher transfection efficiency when compared to the nuclear protein Protamine (here used as a control), reaching a 900-fold increase in expression of transfected reporter gene, both in the same molar ratio of pDNA:protein 1:8000. When compared to Lipofectamine 2000TM, a well-known transfection reagent here used as a control, T-Rp3 showed to reach similar levels of efficiency, but with the further advantage of being less cytotoxic, as observed in cell viability assays. Transfections performed in the presence of the drug Nocodazole indicate that T-Rp3 efficiency largely depends on the microtubule network, since its efficiency is reduced by 92% when microtubules are depolymerized. From transfections in the presence of Choroquine we can deduce that endosomal entrapment remains a limiting factor. Finally, affinity chromatography experiments performed with the immobilized domain of dynein intermediate chain demonstrate that the recombinant light chain T-Rp3 retains the ability to interact with the dynein complex. Taken together, these results point to a strong participation of the microtubule network in the enhanced efficiency of T-Rp3 / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Um dos principais limitantes ao desenvolvimento e aprovação para utilização em humanos das vacinas de DNA é a falta de um vetor ideal de entrega gênica, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora mais seguros, os vetores não virais enfrentam uma série de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais que limitam a chegada do transgene ao núcleo das células alvo. Dando continuidade ao trabalho desenvolvido em nosso grupo de pesquisa, o principal objetivo desta dissertação de mestrado foi avaliar o desempenho do vetor não viral comercial Lipofectamina e da proteína multifuncional T-Rp3 na entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) a células BHK-21. Primeiramente, o gene RVGP foi inserido no plasmídeo modelo pVAX1. Foram então realizados estudos de transfecção em células BHK-21 (Baby Hamster Kidney), utilizando-se Lipofectamina como agente de transfecção, no sentido de constatar a correta expressão do gene RVGP contido no novo plasmídeo. Como controle positivo, foi utilizado o plasmídeo pCMV-RVGP. Os estudos de PCR quantitativo da transcrição reversa (qRT-PCR) e imunofluorescência indicaram a expressão da glicoproteína pelo pVAX1RVGP, ainda que em valores de expressão menores se comparados com o plasmídeo controle pCMV-RVGP. Foi também desenvolvido com sucesso um método quantitativo de determinação da expressão da RVGP em células utilizando-se citometria de fluxo, que confirmou os resultados anteriores. Devido ao plasmídeo pVAX1RVGP ter apresentado baixa eficiência de expressão da RVGP, buscou-se a elevação da eficiência a partir da adição da sequência de KOZAK no plasmídeo pVAX1RVGP. Nesse caso, ainda que os resultados indiquem um aumento na expressão, não houve confirmação estatística (p<0,05). Os estudos de entrega com a proteína T-Rp3 foram realizados com um lote da T-Rp3 armazenada em ultrafreezer. A proteína demonstrou-se não ser estável após o congelamento em nitrogênio líquido e armazenamento em ultrafreezer pelo tempo de 10 meses. Apesar de ser capaz de complexar o pDNA após esse tempo, não foi eficiente em ensaios de transfecção, tendendo a agregar em relações molares altas e ausência de soro fetal bovino. / One of the major bottlenecks on the development and approval of DNA vaccines in humans is the lack of an ideal gene delivery vector, which must be safe and efficient at the same time. Although safer, the non-viral vectors face a series of physical, enzymatic and diffusion barriers that limits the arrival of the endogenous gene in the nuclei of the target cells. The main goal of this work was the evaluation of the performances of the commercial non-viral vector Lipofectamine, and the recombinant protein T-Rp3, a multifunctional protein, on the delivery of the rabies virus glycoprotein (RVGP) gene to BHK-21 cells. First, the RVGP gene was inserted into the pVAX1 plasmid, and transfections using BHK-21 (Baby Hamster Kidney) cells were performed using the Lipofectamine reagent to verify the correct expression of the RVGP gene present in the new plasmid. As a positive control, the plasmid pCMV-RVGP was used. The quantitative reverse transcription (qRT-PCR) and immunofluorescence studies indicated the expression of RVGP from pVAX1RVGP, although in lower expression values in comparison to the control plasmid. In addition, a flow cytometry quantitative method to quantify and compare the expression of the RVGP in the membrane of the transfected cells was developed, confirming the previous results. With the purpose of increase, the expression of RVGP, the KOZAK consensus sequence was added to the new pVAX1RVGP plasmid, and despite of the apparent increase of RVGP expression, this could not be confirmed statistically. The experiments of gene delivery using the T-Rp3 protein were performed using a protein batch storaged in ultrafreezer for 10 months. However, the protein has shown not being stable after storage for this long period. Moreover, despite of being capable to complex pDNA after this time, T-Rp3 was not efficient in the transfection assays and tended to aggregate in high molar ratios.

Um dos principais limitantes ao desenvolvimento e aprovação para utilização em humanos das vacinas de DNA é a falta de um vetor ideal de entrega gênica, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora mais seguros, os vetores não virais enfrentam uma série de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais que limitam a chegada do transgene ao núcleo das células alvo. Dando continuidade ao trabalho desenvolvido em nosso grupo de pesquisa, o principal objetivo desta dissertação de mestrado foi avaliar o desempenho do vetor não viral comercial Lipofectamina e da proteína multifuncional T-Rp3 na entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) a células BHK-21. Primeiramente, o gene RVGP foi inserido no plasmídeo modelo pVAX1. Foram então realizados estudos de transfecção em células BHK-21 (Baby Hamster Kidney), utilizando-se Lipofectamina como agente de transfecção, no sentido de constatar a correta expressão do gene RVGP contido no novo plasmídeo. Como controle positivo, foi utilizado o plasmídeo pCMV-RVGP. Os estudos de PCR quantitativo da transcrição reversa (qRT-PCR) e imunofluorescência indicaram a expressão da glicoproteína pelo pVAX1RVGP, ainda que em valores de expressão menores se comparados com o plasmídeo controle pCMV-RVGP. Foi também desenvolvido com sucesso um método quantitativo de determinação da expressão da RVGP em células utilizando-se citometria de fluxo, que confirmou os resultados anteriores. Devido ao plasmídeo pVAX1RVGP ter apresentado baixa eficiência de expressão da RVGP, buscou-se a elevação da eficiência a partir da adição da sequência de KOZAK no plasmídeo pVAX1RVGP. Nesse caso, ainda que os resultados indiquem um aumento na expressão, não houve confirmação estatística (p<0,05). Os estudos de entrega com a proteína T-Rp3 foram realizados com um lote da T-Rp3 armazenada em ultrafreezer. A proteína demonstrou-se não ser estável após o congelamento em nitrogênio líquido e armazenamento em ultrafreezer pelo tempo de 10 meses. Apesar de ser capaz de complexar o pDNA após esse tempo, não foi eficiente em ensaios de transfecção, tendendo a agregar em relações molares altas e ausência de soro fetal bovino. / One of the major bottlenecks on the development and approval of DNA vaccines in humans is the lack of an ideal gene delivery vector, which must be safe and efficient at the same time. Although safer, the non-viral vectors face a series of physical, enzymatic and diffusion barriers that limits the arrival of the endogenous gene in the nuclei of the target cells. The main goal of this work was the evaluation of the performances of the commercial non-viral vector Lipofectamine, and the recombinant protein T-Rp3, a multifunctional protein, on the delivery of the rabies virus glycoprotein (RVGP) gene to BHK-21 cells. First, the RVGP gene was inserted into the pVAX1 plasmid, and transfections using BHK-21 (Baby Hamster Kidney) cells were performed using the Lipofectamine reagent to verify the correct expression of the RVGP gene present in the new plasmid. As a positive control, the plasmid pCMV-RVGP was used. The quantitative reverse transcription (qRT-PCR) and immunofluorescence studies indicated the expression of RVGP from pVAX1RVGP, although in lower expression values in comparison to the control plasmid. In addition, a flow cytometry quantitative method to quantify and compare the expression of the RVGP in the membrane of the transfected cells was developed, confirming the previous results. With the purpose of increase, the expression of RVGP, the KOZAK consensus sequence was added to the new pVAX1RVGP plasmid, and despite of the apparent increase of RVGP expression, this could not be confirmed statistically. The experiments of gene delivery using the T-Rp3 protein were performed using a protein batch storaged in ultrafreezer for 10 months. However, the protein has shown not being stable after storage for this long period. Moreover, despite of being capable to complex pDNA after this time, T-Rp3 was not efficient in the transfection assays and tended to aggregate in high molar ratios.