Orientadores: Adriano Rodrigues Azzoni, Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T06:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toledo_MarceloAugustoSzymanskide_D.pdf: 15660446 bytes, checksum: 8e64c5b4455cf458c2eb0d9b8e030e70 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Apesar de seguros e simples de produzir, o uso de vetores não virais como o DNA plasmidial (DNAp) em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA tem sido limitado pela baixa eficiência quando comparados aos vetores virais. Essa limitação provém principalmente da reduzida capacidade de superar as barreiras físicas, enzimáticas e difusionais encontradas durante o tráfego intracelular para o interior do núcleo das células alvo. Dentro deste contexto, o presente trabalho demonstra a utilização de cadeias leves modificadas de Dineína (Lc8 e Rp3) como vetores não-virais de entrega gênica. A escolha de cadeias leves de Dineína justifica-se pela possibilidade de utilizar o transporte retrógrado celular mediado por complexos motores de Dineína para facilitar o tráfego de material genético exógeno através do citoplasma em direção à periferia nuclear. Através da adição de pequenos domínios peptídicos, ricos em aminoácidos polares positivos (arginina e lisina), ao N-terminal de cadeias leves de Dineína foi possível conferir a estas proteínas a habilidade de interagir com material genético condensando-o em partículas. Ensaios de transfecção demonstraram que tais partículas apresentam elevada eficiência de entrega do material genético exógeno ao núcleo de células HeLa, eficiência esta superior àquela apresentada pelo peptídeo protamina, amplamente estudado como vetor não-viral de entrega gênica. A formação de complexos ternários utilizando-se DNA plasmidial, cadeias leves de Dineína modificadas e lipídios catiônicos apresentou eficiência de entrega superior àquelas apresentadas na ausência do lipídio. Adicionalmente, complexos de entrega formados apenas com DNA plasmidial e cadeias leves de Dineína modificadas apresentaram baixo efeito citotóxico em células HeLa, característica esta de grande relevância uma vez que a toxicidade dos vetores de entrega gênica atua como importante fator limitante em sua aplicação clínica. O mecanismo envolvido no processo de entrega gênica mediado por cadeias leves de Dineína modificadas também foi estudado, podendo ser observado que (1) a entrada dos complexos de entrega na célula é altamente dependente do processo de endocitose, (2) a eficiência de entrega observada depende da rede de microtúbulos e (3) parte significativa dos complexos de entrega é degradada na via de endossoma/lisossomo celular. Os vetores não-virais de entrega gênica descritos no presente estudo associam elevada eficiência de transfecção, baixa toxicidade celular e relativo baixo custo de produção, uma vez que as cadeias leves de Dineína recombinantes são produzidas em sistema heterólogo utilizando-se Escherichia coli. Ressalta-se ainda a possibilidade de adição de novos domínios peptídicos às cadeias leves de Dineína modificadas, agregando novas funções/capacidades que poderiam resultar em maior eficiência de entrega gênica através da otimização dos processos de internalização celular ou escape endossomal. A abordagem de se utilizar a via de transporte retrógrado celular para o desenvolvimento de vetores não-virais para entrega gênica é pouco explorada pela comunidade científica e o presente estudo apresenta-se entre os poucos da área, esperando assim contribuir para o desenvolvimento de vetores não-virais mais eficientes e seguros / Abstract: The use of non viral vectors such as plasmidial DNA (pDNA) in gene therapy and DNA vaccination protocols has been limited due to its low transfection efficiency when compared to viral vectors. This limitation occurs mainly due to the physical, enzymatic and diffusion barriers faced during the transport of the genetic material to the nucleus of target eukaryotic cells. Regarding this subject, the present work demonstrates the feasibility of using modified Dynein light chains (Lc8 and Rp3) as non viral vectors for gene delivery. The use of Dynein light chains relies on the possibility to exploit the Dynein based cellular retrograde transport in order to improve the exogenous genetic material transport across the citosol towards the nuclear periphery. By adding small peptide domains, based in positively charged aminoacids (arginine and lysine) to the N-terminal of Dynein light chains, the resulting recombinant proteins were able to interact and condense genetic material into delivery particles. Transfection assays demonstrated that these particles are highly efficient to delivery plasmidial DNA to nucleus of HeLa cells when compared to the transfection efficiency presented by protamine, a well characterized non viral vector peptide. Ternary complexes formed by modified Dynein light chains, pDNA and a cationic lipid showed even higher transfection efficiency. Additionally, the light chain based non viral delivery vectors presented low citotoxic effect to HeLa cells, a valuable feature as toxicity is regarded as one of the main concerns on delivery vectors development. The mechanism by which the modified Dynein light chain based vectors mediates gene delivery was also investigated and we could observe that (1) the internalization process deeply relies on endocytosis, (2) it depends on the microtubule network and (3) a significant fraction of the delivery complexes are trapped and degraded in the endocytic pathway. The non viral vectors developed in the present study combine high transfection efficiency, low toxicity and relative low production cost, as all modified proteins were produced in Escherichia coli prokaryotic host. Its noteworthy that additional peptide domains can be further associated to the delivery vectors described providing it with new abilities such as higher internalization or endosomal escape capacity. The approach to use the cellular retrograde transport in order to develop non viral vectors is poorly exploited by the scientific community and the present study stands among few in the field hopefully contributing to the development of more efficient and safer non viral vectors for gene delivery / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Um dos principais limitantes do desenvolvimento de protocolos eficientes de terapia gênica e vacinação com DNA provém da baixa eficiência de transferência gênica por parte dos vetores não-virais. Isso surge, principalmente, pela dificuldade de transporte de DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras. O principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento e caracterização de novos vetores não virais multifuncionais, capazes de realizar eficientemente a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA) ao núcleo de células de mamífero (HeLa). Para esse fim, complexos binários (CBs) foram formados combinando-se pDNA à protamina ou proteínas recombinantes (TRP3) anteriormente desenvolvidas por nosso grupo. Foi também estudado o encapsulamento destes CBs em lipossomas catiônicos, formados pelos lipídios EPC:DOPE:DOTAP, gerando então complexos pseudo-ternários (CPTs). Os estudos com a protamina revelaram que os CPTs formados apresentavam tamanhos relativamente pequenos (< 123 nm) e com valores de potencial zeta, variando de +22,8 mV a +36,3 mV, nas várias relações mássicas (pDNA:protamina) estudadas (1:0,5; 1:0,7, 1:0,9 e 1:1). Os ensaios de transfecção mostraram que o CPT na relação 1:0,5 (CB) obteve o melhor nível de transfecção das células (17,1%) com um nível de viabilidade celular de 73,2%. Os ensaios utilizando a TRP3 mostraram que os CPTs formados adquiriram tamanhos pequenos (< 134 nm) e valores de potencial zeta entre +36,8 mV e +11,9 mV dependendo da relação mássica do CB (1:1, 1:30 e 1:60). Os ensaios de transfecção mostram que os CPTs formados com a TRP3 aumentaram o nível de transfecção em todas as relações de pDNA-TRP3 usadas (1:1; 1:30 e 1:60). Vale ressaltar que nas relações mássicas 1:30 e 1:60 houve um aumento significativo na transfecção (25,2% e 24,5%, respectivamente). Os ensaios de citotoxicidade mostram que os CBs não afetaram a viabilidade célular, entretanto quando combinada ao lipossoma foi observado aumento da citotoxicidade. Finalmente, os resultados indicam que a TRP3 associada ao lipossoma (CPTs) aumenta a eficiência de entrega de pDNA sugerindo um efeito sinérgico entre essas duas moléculas na superação das várias barreiras físicas, químicas e difusionais encontradas na célula. / One of the major challenges on the development of efficient protocols for gene therapy and DNA vaccination is the low efficiency of gene transfer by non viral vectors. This is mainly attributed to the fact that, during the traffic to target cells nuclei, plasmid vectors must overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers. The objective of this work was the development and characterization of new multifunctional non-viral vectors, based on lipids and proteins, able to delivery efficiently the foreign pDNA (plasmid DNA) to the nucleus of mammalian cells. A model pDNA containing the reporter gene GFP was complexed to protamine or the recombinant protein (TRP3), forming binary complexes (BC). In addition, we studied the ability of the cationic liposomes (EPC:DOPE:DOTAP) to encapsulate this binary complexes to form pseudo-ternary complexes (PTCs). The studies of size (DLS) and zeta potential revealed that both proteins were able to condense pDNA to form small complexes (BCS and PTCs) (~100 nm) and positively charged (+11,9 mV a +36,8 mV), both interesting characteristics for transfections. However, the CPTs formed by TRP3 was that showed the highest transfections level (25,3%). The cytotoxicity assays indicated the BCs had a low effect on the cell viability. On the other hand, the biggest effect on cell death was found when PTCs were used. The results indicated the TRP3 associated to liposomes (PTCs) increased the delivery efficiency due to differences in the intracellular trafficking, suggesting a synergic effect between these different molecules in the vector in order to overcome the barriers found inside the cell.

Em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA, a eficiência e a segurança dos vetores que transportam o material genético terapêutico possuem papel fundamental. Vetores não virais são considerados mais seguros, mas menos eficientes em relação aos vetores virais. Em parte, isso se deve à falta de estudos sistemáticos e comparativos no que diz respeito às características físico-químicas desses vetores quando em soluções biológicas e o efeito delas sobre a eficiência de entrega gênica. O objetivo deste trabalho é avaliar o efeito do pH, da força iônica e do tipo tampão de complexação sobre as características físico-químicas de nanopartículas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipofectamina, visando à entrega gênica para diferentes linhagens celulares. Para isso, nanopartículas formadas em diferentes condições foram caracterizadas através de ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta. Os estudos indicaram que o pH, a força iônica, o tipo de tampão e a presença de meio de cultura e soro no ambiente de complexação alteram significativamente o tamanho, a polidispersidade e o potencial zeta das partículas formadas. Finalmente, buscou-se avaliar o efeito dessas características sobre a eficiência de transfecção in vitro de células de macrófagos IC21 e células HeLa. Os estudos de transfecção em células Hela indicam que tanto a composição como as condições de formação das partículas influenciam significativamente a eficiência de transfecção. / In gene therapy and DNA vaccination studies, the efficiency and safety of the vector carrying the therapeutic gene play a fundamental role. Non-viral vectors are considered safer but less effective when compared to viral vectors. In part, this is due to the lack of systematic and comparative studies regarding the physicochemical characteristics of these vectors when prepared in biological solutions and their effect on gene delivery efficiency. The objective of this study was to evaluate the effect of pH, ionic strength and type of complexation buffer on pDNA-protamine and pDNAprotamine- lipofectamine nanoparticles aiming at gene delivery to different cell lines. In order to achieve this goal, nanoparticles formed under different conditions were characterized by dynamic light scattering test (DLS) and zeta potential. Our studies indicated that the pH, the ionic strength, buffer type, and the presence of culture medium and serum in the complexation environment all significantly affect the size, polydispersity, and zeta potential of the particles formed. Finally, we evaluated the effect of these characteristics on the efficiency of transfection in vitro using HeLa cells and macrophages IC21. The transfection studies, especially using Hela cells, indicated that both, nanoparticle composition and the conditions of complex formation, significantly affect the efficiency of the transfections.

Em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA, a eficiência e a segurança dos vetores que transportam o material genético terapêutico possuem papel fundamental. Vetores não virais são considerados mais seguros, mas menos eficientes em relação aos vetores virais. Em parte, isso se deve à falta de estudos sistemáticos e comparativos no que diz respeito às características físico-químicas desses vetores quando em soluções biológicas e o efeito delas sobre a eficiência de entrega gênica. O objetivo deste trabalho é avaliar o efeito do pH, da força iônica e do tipo tampão de complexação sobre as características físico-químicas de nanopartículas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipofectamina, visando à entrega gênica para diferentes linhagens celulares. Para isso, nanopartículas formadas em diferentes condições foram caracterizadas através de ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta. Os estudos indicaram que o pH, a força iônica, o tipo de tampão e a presença de meio de cultura e soro no ambiente de complexação alteram significativamente o tamanho, a polidispersidade e o potencial zeta das partículas formadas. Finalmente, buscou-se avaliar o efeito dessas características sobre a eficiência de transfecção in vitro de células de macrófagos IC21 e células HeLa. Os estudos de transfecção em células Hela indicam que tanto a composição como as condições de formação das partículas influenciam significativamente a eficiência de transfecção. / In gene therapy and DNA vaccination studies, the efficiency and safety of the vector carrying the therapeutic gene play a fundamental role. Non-viral vectors are considered safer but less effective when compared to viral vectors. In part, this is due to the lack of systematic and comparative studies regarding the physicochemical characteristics of these vectors when prepared in biological solutions and their effect on gene delivery efficiency. The objective of this study was to evaluate the effect of pH, ionic strength and type of complexation buffer on pDNA-protamine and pDNAprotamine- lipofectamine nanoparticles aiming at gene delivery to different cell lines. In order to achieve this goal, nanoparticles formed under different conditions were characterized by dynamic light scattering test (DLS) and zeta potential. Our studies indicated that the pH, the ionic strength, buffer type, and the presence of culture medium and serum in the complexation environment all significantly affect the size, polydispersity, and zeta potential of the particles formed. Finally, we evaluated the effect of these characteristics on the efficiency of transfection in vitro using HeLa cells and macrophages IC21. The transfection studies, especially using Hela cells, indicated that both, nanoparticle composition and the conditions of complex formation, significantly affect the efficiency of the transfections.

Um dos principais limitantes do desenvolvimento de protocolos eficientes de terapia gênica e vacinação com DNA provém da baixa eficiência de transferência gênica por parte dos vetores não-virais. Isso surge, principalmente, pela dificuldade de transporte de DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras. O principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento e caracterização de novos vetores não virais multifuncionais, capazes de realizar eficientemente a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA) ao núcleo de células de mamífero (HeLa). Para esse fim, complexos binários (CBs) foram formados combinando-se pDNA à protamina ou proteínas recombinantes (TRP3) anteriormente desenvolvidas por nosso grupo. Foi também estudado o encapsulamento destes CBs em lipossomas catiônicos, formados pelos lipídios EPC:DOPE:DOTAP, gerando então complexos pseudo-ternários (CPTs). Os estudos com a protamina revelaram que os CPTs formados apresentavam tamanhos relativamente pequenos (< 123 nm) e com valores de potencial zeta, variando de +22,8 mV a +36,3 mV, nas várias relações mássicas (pDNA:protamina) estudadas (1:0,5; 1:0,7, 1:0,9 e 1:1). Os ensaios de transfecção mostraram que o CPT na relação 1:0,5 (CB) obteve o melhor nível de transfecção das células (17,1%) com um nível de viabilidade celular de 73,2%. Os ensaios utilizando a TRP3 mostraram que os CPTs formados adquiriram tamanhos pequenos (< 134 nm) e valores de potencial zeta entre +36,8 mV e +11,9 mV dependendo da relação mássica do CB (1:1, 1:30 e 1:60). Os ensaios de transfecção mostram que os CPTs formados com a TRP3 aumentaram o nível de transfecção em todas as relações de pDNA-TRP3 usadas (1:1; 1:30 e 1:60). Vale ressaltar que nas relações mássicas 1:30 e 1:60 houve um aumento significativo na transfecção (25,2% e 24,5%, respectivamente). Os ensaios de citotoxicidade mostram que os CBs não afetaram a viabilidade célular, entretanto quando combinada ao lipossoma foi observado aumento da citotoxicidade. Finalmente, os resultados indicam que a TRP3 associada ao lipossoma (CPTs) aumenta a eficiência de entrega de pDNA sugerindo um efeito sinérgico entre essas duas moléculas na superação das várias barreiras físicas, químicas e difusionais encontradas na célula. / One of the major challenges on the development of efficient protocols for gene therapy and DNA vaccination is the low efficiency of gene transfer by non viral vectors. This is mainly attributed to the fact that, during the traffic to target cells nuclei, plasmid vectors must overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers. The objective of this work was the development and characterization of new multifunctional non-viral vectors, based on lipids and proteins, able to delivery efficiently the foreign pDNA (plasmid DNA) to the nucleus of mammalian cells. A model pDNA containing the reporter gene GFP was complexed to protamine or the recombinant protein (TRP3), forming binary complexes (BC). In addition, we studied the ability of the cationic liposomes (EPC:DOPE:DOTAP) to encapsulate this binary complexes to form pseudo-ternary complexes (PTCs). The studies of size (DLS) and zeta potential revealed that both proteins were able to condense pDNA to form small complexes (BCS and PTCs) (~100 nm) and positively charged (+11,9 mV a +36,8 mV), both interesting characteristics for transfections. However, the CPTs formed by TRP3 was that showed the highest transfections level (25,3%). The cytotoxicity assays indicated the BCs had a low effect on the cell viability. On the other hand, the biggest effect on cell death was found when PTCs were used. The results indicated the TRP3 associated to liposomes (PTCs) increased the delivery efficiency due to differences in the intracellular trafficking, suggesting a synergic effect between these different molecules in the vector in order to overcome the barriers found inside the cell.

Orientadores: Adriano Rodrigues Azzoni, Anete Pereira de Souza / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T01:06:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Favaro_MariannaTeixeiradePinho_M.pdf: 18876970 bytes, checksum: 4953fcf4a875c09d8246f6deb457b544 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Entrega gênica é uma estratégia muito promissora com grande potencial médico, que consiste na introdução de ácidos nucléicos exógenos, e pode ser aplicada tanto para terapia gênica quanto para vacina de DNA. Contudo seu uso ainda é limitado pela falta de um vetor de entrega ideal, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora muito mais eficientes, os vetores virais ainda despertam preocupações a respeito de sua segurança. Por outro lado, vetores não-virais são muito mais seguros e facilmente manipuláveis, ainda que menos eficientes. Neste contexto, "vírus artificiais" são uma opção interessante, uma vez que são vetores não-virais desenvolvidos para explorar a arquitetura celular de uma forma eficiente, superando uma série de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais, mas mantendo a segurança do DNA plasmidial (pDNA). O principal objetivo da abordagem estudada é explorar os motores moleculares, como dineína, para transportar cargas da periferia para o centrossoma de células de mamíferos através da rede de microtúbulos. Para isso, a cadeia leve Rp3 da dineína foi fusionada a um domínio de interação com DNA (DNA-binding) no N-terminal, e ao peptídeo membrano-ativo TAT no C-terminal. A proteína, nomeada T-Rp3, tem ainda um His-Tag. Esta proteína recombinante construída contém então diferentes domínios para promover condensação do pDNA (DNA binding), para facilitar a entrada na célula e no núcleo (TAT) e para aumentar o escape endossomal (His- Tag), além da própria Rp3 que deve assistir no tráfego intracelular, agindo assim diretamente na maioria dos principais obstáculos intracelulares enfrentados pelos vetores. Estudos de expressão indicam que a proteína recombinante é corretamente expressa em E. coli BL21(DE3). Experimentos de mobilidade em gel de agarose ("gel retardation assay") combinados com estudos de espalhamento de luz e potencial zeta indicam que a proteína efetivamente interage com o pDNA, formando complexos que são pequenos (~95 nm) e positivamente carregados (+28 mV na relação molar de pDNA:proteína 1:8000). Ensaios de transfecção em cultura de células HeLa indicam que T-Rp3 atinge uma eficiência de transfecção muito maior que a proteína nuclear Protamina (aqui usada como controle), chegando a ser 900 vezes maior a expressão relativa do gene repórter na relação molar de pDNA:proteína 1:8000. Na comparação com Lipofectamina 2000TM, um reagente bem caracterizado de transfecção aqui usado como controle positivo, a T-Rp3 demonstrou atingir níveis similares de eficiência, com a vantagem adicional de ser menos citotóxica, conforme evidenciado em ensaios de viabilidade celular. Transfecções realizadas na presença da droga Nocodazol indicam que a eficiência da T-Rp3 depende fortemente da rede de microtúbulos, uma vez que a eficiência é reduzida em 92% quando os microtúbulos estão despolimerizados. A partir das transfecções na presença da droga Cloroquina, pudemos observar que o aprisionamento no endossomo ainda é um fator limitante. Finalmente, ensaios de cromatografia de afinidade realizados com o domínio da cadeia intermediária de dineína imobilizado indicam que a cadeia leve recombinante T-Rp3 mantém a capacidade de interagir com o complexo da dineína. Analisados em conjunto, os resultados apontam para uma grande participação da rede de microtúbulos na eficiência de transfecção de T-Rp3, objetivo inicial deste trabalho / Abstract: Gene delivery is a promising technique with great medical potential that consists in the introduction of exogenous nucleic acids, and can be applied for gene therapy as well as DNA vaccination. However, its use is still limited by the lack of an ideal delivery vector, which is both safe and efficient. Although much more effective, viral vectors still raise several concerns about its safety. On the other hand, non-viral vectors are safer and easier to manipulate, but less efficient. In this context "artificial viruses" are an interesting option, since they are non-viral vectors intended to explore the cell's architecture in an efficient way, to overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers, while still preserving the safety of plasmid DNA (pDNA) vectors. The main objective herein is to exploit molecular motors, like dynein, to transport cargoes from the periphery to the centrosome of mammalian cells via the microtubule network. For that, human dynein light chain Rp3 was fusioned to a N-terminal DNA binding domain and a C-terminal membrane active peptide, TAT. The protein, named T-Rp3, has additionally a His.Tag. The shuttle protein built contains therefore different domains to promote pDNA condensation (DNA binding), to increase cell and nucleus penetration (TAT) and to enhance endosomal escape (His.Tag), besides the Rp3 to assist in the cytosol trafficking, thus covering most of the major obstacles to the vectors in intracellular level. Expression studies indicate that the fusion protein was correctly expressed in soluble form using E. coli BL21(DE3) strain. Gel retardation assays, dynamic light scattering and zeta potential studies indicate an efficient complex formation between pDNA and the fusion protein, resulting in a particle that is both small (~95 nm) and potivelly charged (+28 mV in the molar ratio of pDNA:protein 1:8000) Transfection of cultured HeLa cells indicates that T-Rp3 has a much higher transfection efficiency when compared to the nuclear protein Protamine (here used as a control), reaching a 900-fold increase in expression of transfected reporter gene, both in the same molar ratio of pDNA:protein 1:8000. When compared to Lipofectamine 2000TM, a well-known transfection reagent here used as a control, T-Rp3 showed to reach similar levels of efficiency, but with the further advantage of being less cytotoxic, as observed in cell viability assays. Transfections performed in the presence of the drug Nocodazole indicate that T-Rp3 efficiency largely depends on the microtubule network, since its efficiency is reduced by 92% when microtubules are depolymerized. From transfections in the presence of Choroquine we can deduce that endosomal entrapment remains a limiting factor. Finally, affinity chromatography experiments performed with the immobilized domain of dynein intermediate chain demonstrate that the recombinant light chain T-Rp3 retains the ability to interact with the dynein complex. Taken together, these results point to a strong participation of the microtubule network in the enhanced efficiency of T-Rp3 / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular