Um dos principais limitantes do desenvolvimento de protocolos eficientes de terapia gênica e vacinação com DNA provém da baixa eficiência de transferência gênica por parte dos vetores não-virais. Isso surge, principalmente, pela dificuldade de transporte de DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras. O principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento e caracterização de novos vetores não virais multifuncionais, capazes de realizar eficientemente a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA) ao núcleo de células de mamífero (HeLa). Para esse fim, complexos binários (CBs) foram formados combinando-se pDNA à protamina ou proteínas recombinantes (TRP3) anteriormente desenvolvidas por nosso grupo. Foi também estudado o encapsulamento destes CBs em lipossomas catiônicos, formados pelos lipídios EPC:DOPE:DOTAP, gerando então complexos pseudo-ternários (CPTs). Os estudos com a protamina revelaram que os CPTs formados apresentavam tamanhos relativamente pequenos (< 123 nm) e com valores de potencial zeta, variando de +22,8 mV a +36,3 mV, nas várias relações mássicas (pDNA:protamina) estudadas (1:0,5; 1:0,7, 1:0,9 e 1:1). Os ensaios de transfecção mostraram que o CPT na relação 1:0,5 (CB) obteve o melhor nível de transfecção das células (17,1%) com um nível de viabilidade celular de 73,2%. Os ensaios utilizando a TRP3 mostraram que os CPTs formados adquiriram tamanhos pequenos (< 134 nm) e valores de potencial zeta entre +36,8 mV e +11,9 mV dependendo da relação mássica do CB (1:1, 1:30 e 1:60). Os ensaios de transfecção mostram que os CPTs formados com a TRP3 aumentaram o nível de transfecção em todas as relações de pDNA-TRP3 usadas (1:1; 1:30 e 1:60). Vale ressaltar que nas relações mássicas 1:30 e 1:60 houve um aumento significativo na transfecção (25,2% e 24,5%, respectivamente). Os ensaios de citotoxicidade mostram que os CBs não afetaram a viabilidade célular, entretanto quando combinada ao lipossoma foi observado aumento da citotoxicidade. Finalmente, os resultados indicam que a TRP3 associada ao lipossoma (CPTs) aumenta a eficiência de entrega de pDNA sugerindo um efeito sinérgico entre essas duas moléculas na superação das várias barreiras físicas, químicas e difusionais encontradas na célula. / One of the major challenges on the development of efficient protocols for gene therapy and DNA vaccination is the low efficiency of gene transfer by non viral vectors. This is mainly attributed to the fact that, during the traffic to target cells nuclei, plasmid vectors must overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers. The objective of this work was the development and characterization of new multifunctional non-viral vectors, based on lipids and proteins, able to delivery efficiently the foreign pDNA (plasmid DNA) to the nucleus of mammalian cells. A model pDNA containing the reporter gene GFP was complexed to protamine or the recombinant protein (TRP3), forming binary complexes (BC). In addition, we studied the ability of the cationic liposomes (EPC:DOPE:DOTAP) to encapsulate this binary complexes to form pseudo-ternary complexes (PTCs). The studies of size (DLS) and zeta potential revealed that both proteins were able to condense pDNA to form small complexes (BCS and PTCs) (~100 nm) and positively charged (+11,9 mV a +36,8 mV), both interesting characteristics for transfections. However, the CPTs formed by TRP3 was that showed the highest transfections level (25,3%). The cytotoxicity assays indicated the BCs had a low effect on the cell viability. On the other hand, the biggest effect on cell death was found when PTCs were used. The results indicated the TRP3 associated to liposomes (PTCs) increased the delivery efficiency due to differences in the intracellular trafficking, suggesting a synergic effect between these different molecules in the vector in order to overcome the barriers found inside the cell.

Em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA, a eficiência e a segurança dos vetores que transportam o material genético terapêutico possuem papel fundamental. Vetores não virais são considerados mais seguros, mas menos eficientes em relação aos vetores virais. Em parte, isso se deve à falta de estudos sistemáticos e comparativos no que diz respeito às características físico-químicas desses vetores quando em soluções biológicas e o efeito delas sobre a eficiência de entrega gênica. O objetivo deste trabalho é avaliar o efeito do pH, da força iônica e do tipo tampão de complexação sobre as características físico-químicas de nanopartículas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipofectamina, visando à entrega gênica para diferentes linhagens celulares. Para isso, nanopartículas formadas em diferentes condições foram caracterizadas através de ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta. Os estudos indicaram que o pH, a força iônica, o tipo de tampão e a presença de meio de cultura e soro no ambiente de complexação alteram significativamente o tamanho, a polidispersidade e o potencial zeta das partículas formadas. Finalmente, buscou-se avaliar o efeito dessas características sobre a eficiência de transfecção in vitro de células de macrófagos IC21 e células HeLa. Os estudos de transfecção em células Hela indicam que tanto a composição como as condições de formação das partículas influenciam significativamente a eficiência de transfecção. / In gene therapy and DNA vaccination studies, the efficiency and safety of the vector carrying the therapeutic gene play a fundamental role. Non-viral vectors are considered safer but less effective when compared to viral vectors. In part, this is due to the lack of systematic and comparative studies regarding the physicochemical characteristics of these vectors when prepared in biological solutions and their effect on gene delivery efficiency. The objective of this study was to evaluate the effect of pH, ionic strength and type of complexation buffer on pDNA-protamine and pDNAprotamine- lipofectamine nanoparticles aiming at gene delivery to different cell lines. In order to achieve this goal, nanoparticles formed under different conditions were characterized by dynamic light scattering test (DLS) and zeta potential. Our studies indicated that the pH, the ionic strength, buffer type, and the presence of culture medium and serum in the complexation environment all significantly affect the size, polydispersity, and zeta potential of the particles formed. Finally, we evaluated the effect of these characteristics on the efficiency of transfection in vitro using HeLa cells and macrophages IC21. The transfection studies, especially using Hela cells, indicated that both, nanoparticle composition and the conditions of complex formation, significantly affect the efficiency of the transfections.

Em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA, a eficiência e a segurança dos vetores que transportam o material genético terapêutico possuem papel fundamental. Vetores não virais são considerados mais seguros, mas menos eficientes em relação aos vetores virais. Em parte, isso se deve à falta de estudos sistemáticos e comparativos no que diz respeito às características físico-químicas desses vetores quando em soluções biológicas e o efeito delas sobre a eficiência de entrega gênica. O objetivo deste trabalho é avaliar o efeito do pH, da força iônica e do tipo tampão de complexação sobre as características físico-químicas de nanopartículas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipofectamina, visando à entrega gênica para diferentes linhagens celulares. Para isso, nanopartículas formadas em diferentes condições foram caracterizadas através de ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta. Os estudos indicaram que o pH, a força iônica, o tipo de tampão e a presença de meio de cultura e soro no ambiente de complexação alteram significativamente o tamanho, a polidispersidade e o potencial zeta das partículas formadas. Finalmente, buscou-se avaliar o efeito dessas características sobre a eficiência de transfecção in vitro de células de macrófagos IC21 e células HeLa. Os estudos de transfecção em células Hela indicam que tanto a composição como as condições de formação das partículas influenciam significativamente a eficiência de transfecção. / In gene therapy and DNA vaccination studies, the efficiency and safety of the vector carrying the therapeutic gene play a fundamental role. Non-viral vectors are considered safer but less effective when compared to viral vectors. In part, this is due to the lack of systematic and comparative studies regarding the physicochemical characteristics of these vectors when prepared in biological solutions and their effect on gene delivery efficiency. The objective of this study was to evaluate the effect of pH, ionic strength and type of complexation buffer on pDNA-protamine and pDNAprotamine- lipofectamine nanoparticles aiming at gene delivery to different cell lines. In order to achieve this goal, nanoparticles formed under different conditions were characterized by dynamic light scattering test (DLS) and zeta potential. Our studies indicated that the pH, the ionic strength, buffer type, and the presence of culture medium and serum in the complexation environment all significantly affect the size, polydispersity, and zeta potential of the particles formed. Finally, we evaluated the effect of these characteristics on the efficiency of transfection in vitro using HeLa cells and macrophages IC21. The transfection studies, especially using Hela cells, indicated that both, nanoparticle composition and the conditions of complex formation, significantly affect the efficiency of the transfections.

Um dos principais limitantes do desenvolvimento de protocolos eficientes de terapia gênica e vacinação com DNA provém da baixa eficiência de transferência gênica por parte dos vetores não-virais. Isso surge, principalmente, pela dificuldade de transporte de DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras. O principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento e caracterização de novos vetores não virais multifuncionais, capazes de realizar eficientemente a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA) ao núcleo de células de mamífero (HeLa). Para esse fim, complexos binários (CBs) foram formados combinando-se pDNA à protamina ou proteínas recombinantes (TRP3) anteriormente desenvolvidas por nosso grupo. Foi também estudado o encapsulamento destes CBs em lipossomas catiônicos, formados pelos lipídios EPC:DOPE:DOTAP, gerando então complexos pseudo-ternários (CPTs). Os estudos com a protamina revelaram que os CPTs formados apresentavam tamanhos relativamente pequenos (< 123 nm) e com valores de potencial zeta, variando de +22,8 mV a +36,3 mV, nas várias relações mássicas (pDNA:protamina) estudadas (1:0,5; 1:0,7, 1:0,9 e 1:1). Os ensaios de transfecção mostraram que o CPT na relação 1:0,5 (CB) obteve o melhor nível de transfecção das células (17,1%) com um nível de viabilidade celular de 73,2%. Os ensaios utilizando a TRP3 mostraram que os CPTs formados adquiriram tamanhos pequenos (< 134 nm) e valores de potencial zeta entre +36,8 mV e +11,9 mV dependendo da relação mássica do CB (1:1, 1:30 e 1:60). Os ensaios de transfecção mostram que os CPTs formados com a TRP3 aumentaram o nível de transfecção em todas as relações de pDNA-TRP3 usadas (1:1; 1:30 e 1:60). Vale ressaltar que nas relações mássicas 1:30 e 1:60 houve um aumento significativo na transfecção (25,2% e 24,5%, respectivamente). Os ensaios de citotoxicidade mostram que os CBs não afetaram a viabilidade célular, entretanto quando combinada ao lipossoma foi observado aumento da citotoxicidade. Finalmente, os resultados indicam que a TRP3 associada ao lipossoma (CPTs) aumenta a eficiência de entrega de pDNA sugerindo um efeito sinérgico entre essas duas moléculas na superação das várias barreiras físicas, químicas e difusionais encontradas na célula. / One of the major challenges on the development of efficient protocols for gene therapy and DNA vaccination is the low efficiency of gene transfer by non viral vectors. This is mainly attributed to the fact that, during the traffic to target cells nuclei, plasmid vectors must overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers. The objective of this work was the development and characterization of new multifunctional non-viral vectors, based on lipids and proteins, able to delivery efficiently the foreign pDNA (plasmid DNA) to the nucleus of mammalian cells. A model pDNA containing the reporter gene GFP was complexed to protamine or the recombinant protein (TRP3), forming binary complexes (BC). In addition, we studied the ability of the cationic liposomes (EPC:DOPE:DOTAP) to encapsulate this binary complexes to form pseudo-ternary complexes (PTCs). The studies of size (DLS) and zeta potential revealed that both proteins were able to condense pDNA to form small complexes (BCS and PTCs) (~100 nm) and positively charged (+11,9 mV a +36,8 mV), both interesting characteristics for transfections. However, the CPTs formed by TRP3 was that showed the highest transfections level (25,3%). The cytotoxicity assays indicated the BCs had a low effect on the cell viability. On the other hand, the biggest effect on cell death was found when PTCs were used. The results indicated the TRP3 associated to liposomes (PTCs) increased the delivery efficiency due to differences in the intracellular trafficking, suggesting a synergic effect between these different molecules in the vector in order to overcome the barriers found inside the cell.