Orientador: Maria Isabel Felisberti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:13:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_CleideMariaLeitede_D.pdf: 8581320 bytes, checksum: 08e53825c4ce551b56d8de209cafb52f (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Resumo: Melasma é hipermelanose adquirida freqüente, crônica, que afeta áreas fotoexpostas e causa importante dano estético. Há poucos estudos epidemiológicos na literatura descrevendo esses pacientes. Caracterizar clínica e epidemiologicamente pacientes brasileiros portadores de melasma atendidos em serviço universitário. Casuística: Inquérito das principais características de portadores de melasma atendidos no ambulatório de dermatologia da FMB-Unesp entre janeiro 2005 a dezembro de 2007, empregando questionário padronizado. As variáveis foram ajustadas por modelos de regressão multivariados. Avaliaram-se 137 pacientes, sendo 95,6% do sexo feminino, fototipos III (34,1%), IV (34,8%) e V (20,5%) foram os mais freqüentes, idade média do início da doença 28,1 anos e história familiar de melasma em 55,2%. Gestação (38,5%), exposição solar (21,9%) e uso de anticoncepcional oral (13,2%) foram os fatores desencadeantes mais relatados. As topografias faciais mais observadas foram zigomática (79,9%), labial superior (46,3%) e frontal (41,0%). Doença desencadeada por gestação se associou com idade de início mais precoce (p<0,01) e positividade de história familiar se associou com duração mais prolongada (p<0,01). A alta prevalência em adultos do sexo feminino, relação com estímulos hormonais e influência genética familiar foram características nessa população. / Abstract: Melasma is a common chronic acquired hypermelanosis, that affects photoexposed areas and causes major aesthetic damage. There are few epidemiologic studies concerned these patients published in medical literature. Objective: To characterize clinic and epidemiologic data regarding Brazilian patients affected with melasma. Patients with melasma attended at dermatologic clinic from São Paulo State University in a period ranging 2005 to 2007 were inquired using a standardized questionnaire. Independent variables were adjusted by multivariate regression models. There were evaluated 137 patients, which 95,6% were females, skin phototypes III (34,1%), IV (34,8%) and V (20,5%) were more frequent, disease starting mean age was 28,1 years and family history of melasma was identified in 55,2%. Pregnancy (38,5%), sun exposure (21,9%) and contraceptive pills (13,2%) were most related initiating factors. Preferred facial topographies were zigomatic (79,9%), labial (46,3%) and frontal (41,0%). Pregnancy induced melasmas have been associated to premature disease onset (p<0,01), as well as familiar history has been associated to longer disease duration (p<0,01). High prevalence in female adults, the relationship to hormonal stimulus and familiar genetic influence were characteristic in this population. / Orientador: Mariângela Esther Alencar Marques / Coorientador: Márcia Guimarães da Silva / Banca: Luciana Patrícia Fernandes Abbade / Banca: Tânia Ferreira Cestari / Banca: Mirian Nacagami Sotto / Banca: Ediléia Bagatin / Doutor

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-16Bitstream added on 2015-03-03T12:06:21Z : No. of bitstreams: 1 000796740_20150816.pdf: 172709 bytes, checksum: b001c55e421df1956ff1a03e9c959c90 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-17T11:07:04Z: 000796740_20150816.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-17T11:07:53Z : No. of bitstreams: 1 000796740.pdf: 844755 bytes, checksum: 57dac5aa0fed7a3e3886e9c2d4b0f257 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A leucoplasia bucal é considerada uma lesão cancerizável para o desenvolvimento do carcinoma espinocelular (CEC), e vários fatores de risco podem estar relacionados a essa carcinogênese, incluindo o papiloma vírus humano (HPV). Na mucosa bucal tem sido feita a associação da leucoplasia bucal com o HPV. O objetivo desse estudo foi detectar a presença do DNA do HPV em amostras de tecidos fresco, saliva, plasma e células exfoliadas orais, extraídas de pacientes com e sem leucoplasia bucal, analisadas através da técnica de nested PCR (nPCR). Para este estudo foram avaliados 32 pacientes portadores de leucoplasia bucal e 24 pacientes selecionados de forma caso-controle. Foi realizada a extração de DNA das amostras, e em seguida a sua amplificação através da PCR. A nPCR para detecção do HPV revelou a presença do vírus em 68,75% das amostras de tecido fresco, 50% no plasma, 28,1% no citobrush, 62,5% na saliva no grupo de pacientes com leucoplasia em comparação com 45,8%, 54,2%, 45,8%, 50% nas amostras de tecido fresco, plasma, citobrush e saliva do grupo controle respectivamente. Baseado no presente estudo o HPV poderia ser um co-fator etiológico na patogênese da leucoplasia oral. / The oral leukoplakia is considered as a pre-malignant lesion for the development of the oral squamous cell carcinoma, and several risk factors can be related to this carcinogenesis, including the human papillomavirus (HPV). HPV is the main cause of cervix cancer, and your role in the oral carcinogenesis is still controversial. The aims of this study was to detect the presence of HPV DNA in fresh tissue samples, plasma and oral exfoliated cells extracted from patients 32 with oral leukoplakia, and 24 controls analyzed through the technique of nPCR and make a comparison among these biological materials sources. It was performed the extraction of DNA from 37 patients with oral leukoplakia, and amplification of the human ?-globin gene was carried out in all samples to confirm the presence and integrity of DNA. Nested PCR assays revealed the presence of HPV DNA in 68.75% of fresh tissue, 50.0% of plasma, 62.5% of saliva, and in 28.1% of oral exfoliated cells extracted from patients. Based on the current experiment, HPV could potentially be an etiologic co-factor in the pathogenesis of oral leukoplakia. / FAPESP: 11/17791-5 / FAPESP: 11/05499-8

Chlamydia trachomatis é o agente causal de uma das infecções sexualmente transmissíveis (IST) mais prevalentes da atualidade. Os maiores problemas no controle desta IST estão no caráter assintomático da infecção e no seu difícil diagnóstico laboratorial. Com o advento dos testes moleculares, grandes avanços ocorreram na área do diagnóstico laboratorial da infecção clamidial. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver um método de detecção de C. trachomatis por PCR a partir de amostras cérvico-vaginais. A seqüência alvo escolhida para amplificação consiste de um segmento da ORF 4 do plasmídio críptico de ocorrência natural nesta bactéria. Noventa e duas amostras cérvico-vaginais foram submetidas ao protocolo de PCR in house proposto. Os produtos de PCR foram detectados por visualização direta após eletroforese em gel de agarose com brometo de etídio e por exposição radiográfica após hibridização com sonda homóloga. As amostras foram testadas paralelamente pelo método de captura híbrida para detecção de C. trachomatis. O kit COBAS Amplicor (Roche) foi utilizado para resolver resultados discrepantes. A seqüência do fragmento de 201pb foi confirmada por clivagem enzimática e por seqüenciamento. O teste de especificidade dos primers confirmou especificidade dos mesmos frente ao DNA de diferentes agentes patogênicos e da flora normal feminina. Do total de amostras analisadas, 50 foram positivas por captura híbrida, 51 foram positivas por PCR in house e 67 positivaram após hibridização.O teste de McNemar indicou haver concordância entre os métodos analisados dois a dois (P<0,001). Verificou-se concordância moderada nos comparativos entre captura híbrida e PCR (valor de Kappa: 0,45; DP 0,093), captura híbrida e hibridização (valor de kappa: 0,389; DP 0,091) e, PCR e hibridização (valor de Kappa: 0,634: DP 0,077). O método de PCR in house proposto para a detecção de C. trachomatis é uma técnica rápida e de baixo custo para o diagnóstico, controle e monitoramento dos casos da infecção. Estudos complementares, no entanto, são necessários para implementação deste teste em laboratórios da rede pública.

Rhodococcus equi é uma importante causa de broncopneumonia em potros com menos de 6 meses de idade, sendo responsável por 3% das mortes de eqüinos no mundo. É um microrganismo intracelular capaz de sobreviver e multiplicar no interior de macrófagos. Apresenta 3 níveis de virulência de acordo com os diferentes antígenos expressos em sua superfície. Cepas virulentas apresentam um plasmídeo que codifica para a proteína de superfície VapA e são isoladas principalmente de potros com pneumonia e de alguns pacientes humanos. Cepas com virulência intermediária expressam a proteína VapB e predominam em suínos e humanos com AIDS. Cepas avirulentas não expressam antígeno de superfície e são encontradas principalmente no ambiente e em pacientes humanos. Um dos fatores responsáveis pela ampla distribuição da enfermidade em potros, é a imaturidade do sistema imunológico dos animais acometidos pela infecção, que pode tornar-se endêmica em alguns criatórios. Para humanos, as formas de infecção são ainda desconhecidas, mas o contato com eqüinos é relatado em um terço das infecções. Devido à importância clínica da doença, são necessários métodos diagnósticos que promovam sua identificação precoce, facilitando e aumentando as chances de sucesso com o tratamento. Os métodos mais utilizados atualmente são o cultivo microbiológico da bactéria, testes sorológicos para detecção de anticorpos no soro dos animais e técnicas de PCR que detectam a região 16S do rDNA e o fragmento do gene vapA do microrganismo. O objetivo desse trabalho foi utilizar uma técnica de PCR multiplex para detectar simultaneamente os fragmentos dos genes vapA e 16S do rDNA, e gerar um método rápido, específico e sensível para o diagnóstico e caracterização molecular de cepas de R. equi provenientes de eqüinos e seus ambientes. Foram utilizados 118 isolados, sendo 74 amostras de fezes de eqüinos (41 de adultos e 33 de potros), 21 do solo, 10 das instalações utilizando swabs e 3 de outros animais domésticos. Isolados clínicos (10) foram cultivados do pulmão de potros com pneumonia causada por R. equi. Todas as cepas testadas foram confirmadas pela amplificação do gene 16S rDNA, sendo que 16 destes (10 de x potros doentes e 6 de seus ambientes) também foram positivos na amplificação do gene vapA. Quatro dos isolados ambientais que mostraram amplificação do gene vapA foram de haras endêmicos para a doença. A análise desses dados mostra o grande potencial da técnica de PCR multiplex para caracterização molecular de isolados de R. equi. / Rhodococcus equi is an important cause of pyogranulomatous pneumonia in 1-6- month-old foals, being responsible by 3% horse death around the world. It is an intracellular microorganism able to survive and to multiply itself in the macrophages. Three virulence levels have been identified in R. equi, by the presence of virulence associated antigens on the bacteria surface. Virulent strains have a plasmid encoding VapA protein and are isolated from diseased foals and some human patients. Intermediate virulent strains show VapB protein and are commonly founded in swines and humans with AIDS isolates. Avirulent strains don’t show virulence antigens and are founded in environmental samples and human. The immature immune system is the major cause of the susceptibility of foals for the R.equi pneumonia. To humans, the infection routes are unknown yet, but the contact with horses is related with one third of human infections. Due the clinical importance of the disease, diagnostics methods for early identification in animals are necessary, increasing the chances for treatment. The more common diagnostic methods are microbiologic culture, serologic tests and PCR techniques for 16S rDNA and vapA detection. The mainly purpose of this study was apply a multiplex PCR for simultaneous detection and characterization of 16S rDNA and vapA gene fragments in R. equi. Were analyzed 118 R. equi isolates, being 74 eqüine fecal isolates (41 from horses and 33 from foals), 21 from soil, 10 from breed stuffs and 3 from other domestic animals. Ten clinical isolates were cultured from lungs of diseased foals. All 118 isolates characterized as R. equi, were confirmed by 16S rDNA, being 16 isolates positive to vapA gene PCR amplification (10 from diseased foals and six from horse environment). Four environment R. equi isolates positive to both 16S rDNA e vapA gene amplification was from an endemic horse breeding farm. The results show the great potential of multiplex PCR to molecular characterization of R. equi isolates.

Associações simbióticas, comensais e parasitárias são amplamente relatadas em insetos. Pelo fato de larvas de culicídeos e amebas de vida livre (AVL) habitarem meios aquáticos similares, objetivou-se verificar a prevalência de Acanthamoeba spp. em populações silvestres de Aedes aegypti. Esta AVL foi investigada em 60 pools contendo 10 larvas de A. aegypti, as quais foram coletadas através de ovitrampas instaladas em diversos bairros da cidade de Porto Alegre (RS, Brasil). Os isolados de Acanthamoeba spp. foram caracterizados morfologicamente e submetidos à técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para confirmação do gênero. Ademais, realizouse análise genotípica e testes presuntivos de patogenicidade para algumas cepas. Entre os pools, 54 (90%) foram positivos para AVL, dos quais 47 (87%) isolados eram pertencentes ao gênero Acanthamoeba. Os grupos genotípicos T4, T3 e T5 foram identificados, correspondendo a 14 (53,8%), 10 (38,5%) e dois (7,7%) isolados, respectivamente. De acordo com testes fisiológicos empregados para 14 cepas, 12 (85,7%) foram consideradas não patogênicas e duas (14,3%) foram consideradas com baixo potencial patogênico. Estes resultados servem como base para um maior conhecimento acerca da interação entre estes protozoários e mosquitos vetores, em seu habitat natural. Além disso, é o primeiro estudo dedicado ao isolamento de Acanthamoeba spp. a partir de culicídeos coletados do ambiente. / Symbiotic, commensal and parasitic associations are widely reported in insects. By the fact of mosquito larvae and free-living amoebae (FLA) occupy the similar aquatic sites, the aim of this study was to determine the prevalence of Acanthamoeba spp. in Aedes aegypti larvae collected in the environment. The amoebae were investigated in 60 pools, each containing 10 larvae of A. aegypti which were collected by using larvitraps installed in various districts of Porto Alegre (RS, Brazil). Acanthamoeba isolates were morphologically characterized and submitted to Polymerase Chain Reaction technique to confirm the genus. In addition, genotype analyses as well as presumptive tests for pathogenicity in some samples were performed. Among the pools, 54 (90%) were positive for FLA. From those isolates, 47 (87%) belong to the genus Acanthamoeba. The genotype groups T4, T3 and T5 have been identified corresponding to 14 (53.8%), 10 (38.5%) and two (7.7%) isolates respectively. The physiological tests performed in 14 strains showed that 12 (85.7%) were non pathogenic, while two (14.3%) were considered with low pathogenic potential. These results provide a basis for a better understanding between these protozoan and mosquitoes interaction in their natural habitat. Moreover, this study is the first to report isolation of Acanthamoeba spp. from mosquitoes collected in the environment.

Objetivos: Avaliar o desempenho e o custo-efetividade de duas técnicas de PCR (Polymerase Chain Reaction) in house: PCR dot-blot e o PCR utilizando a eletroforese em gel de agarose (PCR-AG) no diagnóstico de Tuberculose Pulmonar em pacientes infectados ou não pelo HIV . Material e Métodos: Um estudo prospectivo foi conduzido (de Maio de 2003 a Maio de 2004) em um Hospital de Referência para TB/HIV. Escarros de 277 indivíduos com suspeita de Tuberculose Pulmonar (PTB) foram testados pelas técnicas de microscopia direta pela coloração de Ziehl-Neelsen (ZN), cultura e pelas metodologias de PCR in house (PCR dot-blot e PCR-AG). A acurácia dos testes foi avaliada de acordo com o status de HIV, com o status de tratamento prévio ou não, e com a estimativa de probabilidade pré-teste feita pelos pneumologistas. O padrão ouro utilizado foi a cultura positiva combinada com a definição clínica de PTB (usando sintomas, fatores de risco e Raios-X). O custo efetividade foi expresso por: a) custo por correto caso diagnosticado de Tuberculose; b) custo por correto caso diagnosticado de Tuberculose e tratado incluindo tratamento de casos falsamente diagnosticados; c) custo por casos incorretamente diagnosticados e não tratados. Resultados: Prevalência de PTB foi 46,2% (128/277); em HIV soropositivo (HIV+) foi de 54% (40/74). Em pacientes com baciloscopias negativas foi de 28,4% (43/151) e nos grupos com probabilidades pré-teste alta, intermediária e baixa foi de 67,4% (31/46); 24% (6/25) e 7,5% (6/80). A sensibilidade e a especificidade do PCR dot-blot foi 74% (CI 95%; 66,1%-81,2%) e 85% (CI 95%; 78,8%-90,3%); do PCR-AG foi 43% (CI 95%; 34,5%-51,6%) e 76% (CI 95%; 69,2%-82,8%), respectivamente. Sensibilidades do PCR dot-blot (72% vs 75%; p=0,46) e PCR-AG (42% vs 43%; p=0,54) foi similar para HIV+ and HIV seronegativo (HIV-). Em relação ao efeito da suspeita clínica no desempenho do PCR em pacientes com PTB e com a baciloscopia negativa, o PCR dot-blot combinado com alta probabilidade pré-teste de TB mostrou uma sensibilidade, Valor Preditivo Negativo (VPN) e Razão de Verossimilhança negativa (RV-) de 93%, 96% e 0,1, respectivamente. Usando a estratégia de associar ZN a Cultura, a PCR-AG e PCR dot-blot. A ZN associada à Cultura mostrou o melhor desempenho com sensibilidade de 94% e VPN de 99%, e RV- de 0,07, seguida da ZN associado ao PCR dot-blot com sensibilidade de 90%, com VPN de 99% e uma RV- de 0,12. Não houve diferença significativa no desempenho do PCR em relação ao status de HIV. Na análise de custo-efetividade os custos por correto caso diagnosticado de Tuberculose foram U$1.462,00 , U$1.296,00 e U$1.136,00; os custos por correto caso diagnosticado de Tuberculose e tratado, incluindo tratamento de casos falsamente diagnosticados, foram de US$1.608,00 para a estratégia do ZN associado ao PCR-dotblot e de US$2.359,00 para a estratégia de ZN associado a Cultura. Os custos por casos não diagnosticados que retornam aos serviços de saúde foram de US$3.735,00 para a estratégia de ZN associado ao PCR-dot-blot e de US$2.329,00 para a estratégia de ZN associada à Cultura. Conclusão: Este estudo mostra que as técnicas de PCR in house podem oferecer uma melhora para o diagnóstico de exclusão de TB em pacientes com suspeita de TB atendidos em hospitais com alta prevalência de TB e HIV. / Objective: To evaluate the performance and cost-effectiveness of two in house PCR (Polymerase Chain Reaction) techniques: PCR dot-blot methodology (PCR dot-blot) and PCR agarose gel electrophoresis (PCR-AG) for the diagnosis of Pulmonary Tuberculosis (PTB) in patients with or without HIV. Methods: A prospective study was conducted (from May 2003 to May 2004) in a TB/HIV reference hospital. First sputum from 277 PTB patients suspects was tested by Ziehl-Neelsen direct microscopy staining (ZN), culture and in house PCR assays (PCR dot-blot and PCR-AG). The accuracy of tests was evaluated in according to HIV status, previous treatment and the estimative of pretest probability (PP) of PTB performed by chest physicians. Gold standard was the culture positive combined with the definition of clinical PTB (based on symptoms, risk factors and chest X- Ray). The cost effectiveness was expressed as: a) cost per correctly diagnosed case of PTB; b) cost per case correctly diagnosed and treated, including treatment of falsely diagnosed cases; c) cost per case incorrectly diagnosed and non treated. Results: The prevalence of PTB was 46% (128/277); in HIV Seropositive (HIV+) was 54% (40/74). In patients ZN negative was 28.% (43/151) and in the groups with high, intermediary and low PP was 67.4% (31/46); 24% (6/25) and 7.5% (6/80). The Sensitivity and Specificity of PCR dot-blot were 74% (CI 95%; 66.1%-81.2%) and 85% (CI 95%; 78.8%-90.3%); of PCR-AG were 43% (CI 95%; 34.5%-51.6%) and 76% (CI 95%; 69.2%-82.8%), respectively. Sensitivities of PCR dot-blot (72% vs 75%; p=0.46) and PCR-AG (42% vs 43%; p=0.54) were similar for HIV+ and HIV Seronegative (HIV-). In relation to the effect of clinical suspicion on the performance of PCR in patients with PTB and ZN negative, the PCR dot-blot associate to high pretest probability of PTB showed sensitivity, Negative Predictive Value (NPV) and negative likelihood ratio (LR-) of 93%, 96% and 0.1, respectively. Using the strategy of associate ZN with Culture and PCR methods (PCR-AG and PCR dot-blot), the ZN plus Culture had the highest performance: Sensitivity of 94%, VPN of 99% and LR- of 0.07. ZN plus PCR dot-blot also had a good performance with sensitivity of 90%, VPN of 99% and LR- of 0.12.There was not statistical difference on the performance of PCR in relation to HIV status. Costs per correctly diagnosed case were U$1,462, U$1,296 and U$1,136 for ZN plus culture, ZN plus PCR-AG and ZN plus PCR dot-blot, respectively. The cost per case correctly diagnosed and treated, including treatment of falsely diagnosed cases, was US$1,608 for ZN plus PCR dot-blot and US$2,359 for ZN plus culture. Cost of the return of all false negatives to health service was US$3,735 for ZN plus PCR dot-blot and US$2,329 for ZN plus Culture. Conclusion: This study shows that in house PCR may offer an improvement for ruling out TB diagnosis for PTB suspects assisted at hospitals with a high prevalence of TB and HIV.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:19Z : No. of bitstreams: 1 Publico-141.pdf: 1535996 bytes, checksum: af74b773a6305b7327f17191a30e524c (MD5) / Pré-exposição a pequenas doses de LPS induz resistência a uma dose letal de LPS, um fenômeno conhecido como tolerância à endotoxina. A pré-exposição ao LPS modula o padrão de resposta celular, conforme ilustrado pela expressão gênica e síntese protéica alteradas de citocinas inflamatórias. No entanto, os mecanismos envolvidos neste processo ainda são parcialmente descritos. Interessante, as células tolerantes ao LPS assemelham-se àquelas obtidas de pacientes sépticos. Métodos: Tolerância ao LPS foi induzida em células mononucleares do sangue periférico humanas pela incubação destas com 1 ng/mL de LPS durante 48 horas. Após este período, as células foram desafiadas com 100 ng/mL de LPS por 2, 6 e 24 horas. Em cada um destes momentos, foi avaliada a expressão de 84 genes relacionados à via dos receptores do tipo Toll, por PCR array. Resultados: O pré-tratamento com LPS não modulou a expressão de CD14 e TLR4 na superfície de monócitos, demonstrando que a tolerância não ocorreu devido à modulações dos receptores do LPS. Um gene foi considerado tolerizável quando o pré-tratamento com LPS reverteu o efeito causado na expressão gênica pelo desafio com LPS; enquanto um gene foi considerado não tolerizável quando o pré-tratamento com LPS não reverteu o efeito do desafio com LPS. As cascatas no NF-κB, JNK, ERK e TRIF estavam bloqueadas ou atenuadas em células tolerantes, enquanto a expressão dos genes relacionados à cascata da p38 estava aumentada. Conclusão: Esses resultados demonstram uma regulação distinta entre as cascatas da via de sinalização dos TLRs durante a tolerância. Além disso, este achado pode explicar a regulação diferenciada entre alguns mediadores inflamatórios, como por exemplo a regulação positiva de IL-10 e COX2 e regulação negativa de TNF-α e IL-12, fato este também explicado pela influência de regulações epigenéticas. A tolerância pode resultar em repressão ou indução de expressão gênica, sendo tal efeito dependente de regulação positiva ou negativa induzida pelo desafio com LPS. / Pre-exposure to low doses of LPS induces resistance to a lethal challenge, a phenomenon known as endotoxin tolerance. In this study, tolerance was induced in human PBMC by culturing cells with 1 ng/mL LPS for 48 h. Cells were subsequently challenged with 100 ng/mL LPS for 2, 6 and 24 h, and the expression of 84 genes encoding proteins involved in the TLR signaling pathway was evaluated at each time point by PCR array. LPS pretreatment did not modulate the expression of TLR4 and CD14 on the surface of monocytes. A gene was defined as tolerized when LPS pretreatment reversed the effect of LPS challenge on the expression of the gene or as non-tolerized when LPS pretreatment did not reverse the effects of LPS challenge. We observed impaired or attenuated signal transduction through the NF-κB, JNK, ERK and TRIF pathways, whereas expression of p38 pathway-related genes was preserved in LPStolerant cells. These results show a distinct regulation of the TLR pathway cascades during tolerance; this may account for the differential gene expression of some inflammatory mediators, such as up-regulation of IL-10 and COX2 as well as down-regulation of TNF-α and IL-12. Depending on the effect of LPSinduced gene up-regulation or down-regulation, tolerance, as a reversion of such LPS effects, may result in repression or induction of gene expression. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

COUTO, Manuela Soares. Identificação molecular de cepas clínicas e ambientais de Burkholderia pseudomallei, oriundas do Estado do Ceará : análise baseada nas regiões 16S e 16S-23S do DNA ribossômico nuclear. 2099.0107 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-12-05T14:02:29Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_mscouto.pdf: 1672949 bytes, checksum: f161d01fb64b6c9b0e6980b0190093b1 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2013-12-05T14:03:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_mscouto.pdf: 1672949 bytes, checksum: f161d01fb64b6c9b0e6980b0190093b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-05T14:03:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_mscouto.pdf: 1672949 bytes, checksum: f161d01fb64b6c9b0e6980b0190093b1 (MD5) Previous issue date: 2009 / Melioidosis is a potentially fatal disease caused by the bacterium Burkholderia pseudomallei, considered emerging in Brazil since the first cases were reported in 2003, on State of Ceará. This study aimed to perform the molecular identification of 31 isolates of B. pseudomallei (26 clinical and 5 environmental) maintained in the culture collection of CEMM (Specialized Center for Medical Mycology), based on sequences 16S and 16S-23S rRNA. The DNA of these samples was extracted with the kit Wizard ® Genomic DNA Purification (Promega), quantified by spectrophotometry and stored at 4°C. The amplification of a fragment of 302 bp of 16S-23S rRNA specific to B. pseudomallei was performed by PCR reaction with primers Bp1 and Bp4. The sequencing of 16S and 16S-23S rRNA was performed by using of the kit DYEnamicTM ET terminators cycle sequencing (GE Healthcare). The phylogenetic tree of 16S rRNA and the sequence identity matrix and sequence difference count matrix based on the 16S-23S rRNA were generated by the program MEGA4, version 4.1. The results confirmed the identification of 15 strains of B. pseudomallei (5 clinical and 10 environmental), which represents 48.4% of the isolates analyzed in this study. The phylogenetic tree based on 16S rRNA shows that the clinical and environmental isolates of B. pseudomallei of State of Ceará are evolutionarily clustered with the strains B. pseudomallei MSHR346 (Australia), B. pseudomallei 1106a (Thailand), B. pseudomallei K96243 (Thailand), B. pseudomallei 1710b (Thailand) and B. pseudomallei 668 (Australia). Using the same extraction kit was possible to extract DNA from B. pseudomallei directly from clinical specimen (bronchoalveolar lavage), confirming a new case of melioidosis in Ubajara/CE. In this study, the use of PCR for amplification of a fragment of 302 bp of 16S-23S rRNA identified correctly B. pseudomallei, and to confirm the discrimination between B. pseudomallei and B. mallei, the sequencing of the 16S and 16S-23S rRNA genes was performed. The technique of PCR coupled with sequencing of 16S and 16S-23S rRNA resulted in a high sensitivity and specificity of detection of B. pseudomallei in this study. / A melioidose é uma doença potencialmente fatal causada pela bactéria Burkholderia pseudomallei, sendo considerada emergente no Brasil desde que os primeiros casos foram reportados em 2003, no Estado do Ceará. Este estudo pretendeu realizar a identificação molecular de 31 isolados de B. pseudomallei (cinco clínicos e 26 ambientais) mantidos na coleção de culturas do CEMM (Centro Especializado em Micologia Médica), com base nas sequências 16S e 16S-23S DNAr. O DNA destas amostras foi extraído com o kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega), quantificado por espectrofotometria e armazenado a 4ºC. A amplificação de um fragmento de 302 pb da região espaçadora 16S-23S DNAr específico para B. pseudomallei foi realizada por meio de reação de PCR com os primers Bp1 e Bp4. O sequenciamento das regiões 16S e 16S-23S DNAr foi realizado pelo método da terminação da cadeia pelo didesoxinucleotídeo, usando-se o kit DYEnamicTM ET terminators cycle sequencing (GE Healthcare). A árvore filogenética da região 16S DNAr e as matrizes sequência identidade e contagem de diferenças baseadas na região 16S-23S DNAr foram geradas pelo programa MEGA4, versão 4.1. Os resultados confirmaram a identificação de 15 cepas de B. pseudomallei (cinco clínicas e dez ambientais), o que corresponde a 48.4% dos isolados em estudo. A árvore filogenética baseada na região 16S DNAr demonstra que os isolados clínicos e ambientais de B. pseudomallei do Estado do Ceará são evolutivamente agrupados com as cepas B. pseudomallei MSHR346 (Austrália), B. pseudomallei 1106a (Tailândia), B. pseudomallei K96243 (Tailândia), B. pseudomallei 1710b (Tailândia) e B. pseudomallei 668 (Austrália). Com a utilização do mesmo kit de extração também foi possível extrair DNA de B. pseudomallei diretamente de espécime clínico (lavado brônquico), confirmando um novo caso de melioidose no Município de Ubajara/CE. Em nosso estudo, o uso da PCR para a amplificação de um fragmento de 302 pb da região 16S-23S DNAr identificou corretamente B. pseudomallei, sendo que para confirmar a discriminação entre B. pseudomallei e B. mallei, o sequenciamento das regiões 16S e 16S-23S DNAr foi realizado. A técnica de PCR aliada ao sequenciamento das regiões 16S e 16S-23S do DNA ribossômico nuclear resultaram em uma elevada sensibilidade e especificidade de detecção de B. pseudomallei neste estudo.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000049.pdf: 5536099 bytes, checksum: a3c810e6946e7b9de437e3149078ad55 (MD5) Previous issue date: 2008 / A identificação de moluscos infectados pelo Schistosoma mansoni é de grande interesse para a saúde pública, pois representa focos de transmissão da esquistossomose. As limitações da técnica padrão-ouro para o diagnóstico de infecções pré-patentes e em larga escala faz com que os métodos moleculares sejam vistos como possíveis alternativas através da detecção de DNA do S. mansoni em lotes de moluscos vetores. A detecção de seqüências específicas de DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) tem confirmado ser de extremo valor para a análise genética e diagnóstico de várias doenças patogênicas infecciosas. O principal objetivo desse trabalho é desenvolver e validar a detecção molecular da infecção por S. mansoni em lotes de moluscos vetores para a identificação de focos de transmissão. Os iniciadores foram desenhados para detectar especificamente DNA de S. mansnoni e amplificam gene na subunidade pequena do rRNA. Neste trabalho foi desenvolvido PCR quantitativa em tempo real (qPCR) e validada juntamente com ensaios de PCR, nested PCR (NPCR) e nested PCR em único tubo (STNPCR). Quando comparados as duas metodologias relacionadas ao padrão-ouro e abordagens moleculares os resultados confirmaram que a NPCR, STNPCR e a qPCR são significantemente mais sensíveis (p 0.05) que a PCR e que a técnica padrão-ouro. Significante relação foi observada entre os resultados da qPCR e a liberação de cercarias. As ferramentas moleculares desenvolvidas neste trabalho, se utilizadas em lotes de moluscos, podem ser consideradas alternativas e/ou complementares à técnica convencional para identificar focos de transmissão da esquistossomose