Thesis (Ph. D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2005. / Vita. Bibliography: 85-95.

Thesis (Ph. D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2004. / Vita. Bibliography: 100-110.

Orientador: Ladaslav Sodek / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T03:29:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antunes_Flavia_D.pdf: 1073820 bytes, checksum: 6e64fd3cfacb0349c805df4ac60bcf24 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O sistema radicular da soja (Glycine max L.) é um importante sítio da assimilação do nitrogênio (N), seja pela assimilação do nitrato nas raízes, seja pela fixação simbiótica de N atmosférico nos nódulos. Os principais produtos da assimilação do N inorgânico, os aminoácidos asparagina e glutamina, os ureídeos, a alantoína e o ácido alantóico, são usados no transporte de N para a parte aérea. Assim, esses produtos representam uma fonte de N reduzido tanto para os sítios de consumo, quanto para a formação de outros aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos e dos demais compostos nitrogenados sintetizados na célula. O transporte do N assimilado no sistema radicular para a parte aérea é realizado exclusivamente via xilema. Portanto, o objetivo geral deste trabalho foi, relacionar mudanças na composição de aminoácidos transportados no xilema de plantas de soja, provocadas pela deficiência de N, com o comportamento de enzimas de assimilação do N, encontradas no sistema radicular. Para causar a deficiência do N, as plantas de soja foram transferidas para um meio hidropônico sem nitrato ou qualquer outra fonte de N inorgânico. Nas plantas não-noduladas a deficiência se deu pela ausência do nitrato no meio de cultivo, e nas plantas noduladas, a manutenção em hidroponia inibiu a fixação do N2. Foi observado um aumento na razão aspartato/asparagina (ASP/ ASN) na seiva do xilema das plantas não-noduladas e noduladas, quando foram submetidas à deficiência do N. Contudo, nas plantas noduladas esse aumento foi acentuado apenas no primeiro dia do tratamento. A recuperação do estresse só ocorreu em plantas não-noduladas, nas quais as concentrações de ASP e ASN retomaram seus valores. As análises da expressão dos genes que codificam a asparagina sintetase (AS) no sistema radicular das plantas de soja, durante o , leva à uma diminuição dos níveis de glutamina, produto imediato da assimilação do íon amônio através da enzima glutamina sintetase (GS). Com a redução dos níveis de glutamina a atividade da AS também é reduzida, resultando na menor utilização de ASP. Em plantas não-noduladas, após transferência para o meio hidropônico sem nitrato, a expressão dos três genes para AS diminuiu bruscamente, e após o retorno das plantas ao meio com nitrato, os genes da AS foram expressos novamente. Nas plantas noduladas a expressão gênica da AS também reduziu durante o tratamento de deficiência de N, porém, apenas o gene SAS1 parece ter sido afetado. O gene SAS1 não recuperou seus níveis de expressão durante a tentativa de recuperação do estresse. Este fato é mais uma evidência da relação da AS com as alterações no perfil de aminoácidos transportados na seiva do xilema, pois as concentrações de ASN e ASP na seiva do xilema também não foram retomadas. tratamento e recuperação do estresse de N, indicam que essa enzima está relacionada com as alterações na razão ASP/ASN. A AS é a enzima que catalisa a biossíntese da ASN, transferindo o grupo amino da glutamina para o aspartato, produzindo asparagina e glutamato. A queda no suprimento de N, seja pelo impedimento da assimilação do nitrato ou da fixação do N2. Devido à importância da enzima redutase do nitrato (RN) no processo de assimilação do nitrato pelo sistema radicular, foi avaliado o seu comportamento durante o tratamento de deficiência do nitrato e sua recuperação. A atividade da RN aumentou, consideravelmente, quando as plantas foram expostas ao nitrato. Esse aumento pôde ser observado em raízes de plantas de soja não-noduladas e também no sistema radicular (raízes e nódulos) das plantas noduladas. Quando as plantas não-noduladas foram transferidas para uma solução sem nitrato, a atividade da RN caiu, apresentando valores muito baixos dentro de 24 horas. As atividades da RN ) parece bastante clara. De qualquer forma, a forte dependência da RN da presença do nitrato é um dado inédito para raízes de plantas de soja. O nitrato também afetou a expressão gênica da AS nas raízes de plantas noduladas, cultivadas sem nenhuma fonte de N mineral. A expressão dos genes da AS aumentou quando essas plantas receberam solução contendo nitrato. nas raízes e nódulos de plantas de soja, cultivadas na ausência do nitrato, foram muito baixas, sendo que em nódulos a atividade sempre foi ligeiramente maior que nas raízes. A baixa atividade encontrada nas raízes e nódulos de soja pode representar a forma constitutiva da enzima, pois as plantas foram cultivadas sem a adição do nitrato durante o ciclo todo. Entretanto, não pode ser descartada a possibilidade da presença de traços de nitrato na água usada para regar as plantas e isto ter sido suficiente para induzir a baixa atividade encontrada. Se por um lado podem existir dúvidas quanto ao fato da enzima ser constitutiva, a indução da enzima pelo substrato (NO3- Os dados sobre o comportamento das enzimas avaliadas aqui indicam que as alterações em aminoácidos transportados no xilema, em plantas de soja submetidas à deficiência de N, estão relacionadas com os processos assimilatórios do sistema radicular, e que a AS parece ser a principal responsável pelas alterações na razão ASP/ASN / Abstract: The root system of soybean (Glycine max L.) is an important site for the assimilation of nitrogen, whether by nitrate assimilation in the roots, or by symbiotic nitrogen fixation in the nodules. The main products of inorganic nitrogen assimilation, the amino acids asparagine and glutamine and the ureides allantoin and allantoic acid, are used in the transport of assimilated nitrogen to the shoot. Thereby, these products represent a source of reduced nitrogen for the sink tissues, for the formation of other amino acids, proteins, nucleic acids and all the other nitrogenous compounds synthesized in the cell. Therefore, the objective of this study was to relate changes in the transport of nitrogen in the xylem of soybean caused by nitrogen deficiency with the behaviour of certain enzymes of nitrogen assimilation in the root system. Nitrogen deficiency was induced by the transfer of soybean plants to a hydroponic system without nitrate or any other source of inorganic nitrogen. In the case of non-nodulated plants deficiency was imposed by the interruption of nitrate assimilation by the roots, and for the nodulated plants nitrogen fixation was inhibited by immersion of the nodules in the hydroponic system. Under nitrogen deficiency, an increase in the aspartate/asparagine (ASP/ASN) ratio of the xylem sap was observed in both nodulated and non-nodulated plants. Nevertheless, this increase was substantial only on the first day of treatment. The recovery from the stress was only observed for the non-nodulated plants, where the levels of ASP and ASN returned to their initial values. Analyses of asparagine synthetase expression in the root system of soybean during treatment and recovery from nitrogen stress indicates that this enzyme can underlay the changes in ASP/ASN ratios. AS is an enzyme that catalyses the biosynthesis of Asn, by transferring the amide nitrogen from glutamine to aspartate, producing asparagine and glutamate. The fall in N supply, whether by interruption of nitrate assimilation or nitrogen fixation, leads to a decline in glutamine, the immediate product of ammonium ion assimilation via glutamine synthetase. With the reduction in glutamine levels the activity of AS is also reduced resulting in diminished utilization of ASP. In non-nodulated plants, after the transfer to the hydroponic system without nitrate, the expression of the three genes declines sharply, and after the return of the plants to a supply of nitrate the AS genes are expression again. In nodulated plants the expression of AS was also reduced during treatment, however, in this case only the gene SAS1 was affected. The SAS1 gene did not recover its initial levels of expression after removing the stress which is further evidence for the correlation between AS activity and the changes in ASP/ASN ratios in the xylem sap, since these ratios were also not recovered. In view of the importance of nitrate reductase (NR) in the process of nitrate assimilation by the root system, its behaviour was evaluated during nitrate deficiency and recovery. The activity of NR increased considerably when plants were supplied with nitrate, in the case of roots of non-nodulated as well as the root system (roots and nodules) of nodulated plants. When non-nodulated plants were transferred to a nutrient solution free of nitrate, NR activity fell sharply, almost disappearing within 24 hours. RN activities in roots and nodules of soybean grown in the absence of nitrate were very low, with activity in the nodules being somewhat higher than in the roots. The low activity found in the roots and nodules could be due to a constitutive enzyme since plants were grown throughout with nitrate-free medium. However, the possible presence of trace amounts of nitrate in the tap water used to irrigate the plants cannot be discarded and may have been sufficient to induce the low levels of enzyme found. If on the one hand there are doubts as to the presence of a constitutive enzyme, the presence of the induced form is very clear. In any case, the strong dependence of NR on the presence of nitrate is an unknown fact for soybean roots. Nitrate also affected the expression of AS in roots of nodulated plants grown without any mineral source of nitrogen, since its expression increased tremendously when such plants were supplied with nitrate. The data concerning the behaviour of the enzymes studied here indicate that alterations in xylem amino acids of soybean plants subjected to nitrogen deficiency are related to the assimilatory processes of the root system, and that AS appears to be mainly responsible for the changes in ASP/ASN ratios / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal

Orientadores: Ione Salgado, Cecilia Alzira Pinto-Maglio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T11:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Seligman_Kelly_M.pdf: 3879828 bytes, checksum: 479952026f21e4da513fff98938d5538 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O radical óxido nítrico (NO), que pode ser produzido nos organismos pela oxidação de arginina ou redução de nitrito, é uma importante molécula sinalizadora em plantas atuando como modulador de diversos processos metabólicos e de desenvolvimento. Recentemente foi identificado como um dos sinais envolvidos no processo de floração. A transição da fase de crescimento vegetativo para a fase reprodutiva é atrasada em plantas mutantes que superproduzem NO, enquanto que a floração é precoce em plantas mutantes deficientes na síntese deste radical. O principal objetivo deste trabalho foi identificar os sítios de produção de NO durante o desenvolvimento floral de Arabidopsis thaliana L. Foram utilizados os indicadores fluorescentes 4,5-diacetato de diaminofluoresceína (DAF-2 DA) e 1,2-diaminoantraquinona (1,2-DAA) para localizar in situ, por microscopia de fluorescência, a produção de NO em botões florais de A. thaliana em diferentes estágios de desenvolvimento. Ainda, a produção de NO pelas estruturas florais foi comparada entre plantas do tipo selvagem e mutante duplo defectivo para os genes estruturais da enzima nitrato redutase - NR - (nia1 nia2) que apresentam conteúdo reduzido de aminoácidos e nitrito e, consequentemente, de NO em suas folhas. Foi analisado também o efeito do seqüestrador de NO, CPTIO, na prevenção da emissão de fluorescência. Os resultados mostraram que o NO é sintetizado em células e tecidos específicos da estrutura floral e que sua produção aumenta com o desenvolvimento floral até a antese: a fluorescência dos indicadores, prevenida pelo seqüestrador de NO, ficou restrita às papilas estigmáticas em gineceus imaturos e a grãos de pólen produzidos pela antera no estame. Plantas mutantes de A. thaliana nia1 nia2 apresentaram o mesmo padrão de emissão de NO nos órgãos florais que o tipo selvagem. Sépalas e pétalas não apresentaram produção significativa de NO em ambos os genótipos analisados. A validação dos resultados obtidos por microscopia foi feita através da incubação de tecidos florais intactos com DAF-2, quantificando-se, por espectrofluorimetria, o composto DAF-2T resultante da reação do indicador com o NO emitido pelos tecidos. Os dados obtidos por espectrofluorimetria mostraram que a intensidade de fluorescência emitida por botões florais foi maior durante o estágio 11 de desenvolvimento, corroborando os dados obtidos de localização por microscopia de fluorescência. Ainda, foi possível quantificar que as plantas do tipo selvagem apresentam, em média, maior intensidade de fluorescência emitida, que plantas nia1 nia2: 1,39 e 1,89 vezes maior nas fases 11 e 13 de desenvolvimento, respectivamente. Um segundo objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da enzima NR na indução floral. Os dados obtidos revelam que plantas nia1 nia2 possuem floração precoce, 6 dias em média, quando comparadas com plantas do tipo selvagem. Para verificar se a floração precoce no mutante nia1 nia2 era conseqüência apenas da deficiência do radical NO, ou também da deficiência de aminoácidos, foram analisados os parâmetros de indução floral em plantas nia1 nia2 tratadas com os aminoácidos arginina ou glutamina, para a recuperação dos níveis basais de aminoácidos. A floração neste mutante permaneceu precoce, sugerindo que o fenótipo de floração precoce é conseqüência da deficiência de NO nestas plantas durante a fase vegetativa. Estes resultados sugerem que o NO pode ter um importante papel no processo de floração e no sucesso da reprodução vegetal / Abstract: The radical nitric oxide (NO), that can be produced in the organism by arginine oxidation or nitrite reduction, is an important signaling molecule in plants acting as modulator of several metabolic and developmental processes. Recently NO was identified as one of several signals involved in flowering. The transition from vegetative to reproductive growth is delayed in mutant plants that overproduce NO, while this process is precocious in mutant plants deficient in NO synthesis. The main objective of this study was to identify the sites of NO production during floral development of Arabidopsis thaliana. The fluorescent probes, 4,5-daminofluorescein diacetate and 1,2-diaminoanthraquinone, were utilized to localize in situ, by fluorescence microsopy, the NO production in floral buds of A. thaliana at different stages of development. Still, NO production by the floral structures was compared between wild-type and double defective mutant plants for structural genes of nitrate reductase enzyme - NR - (nia1 nia2) which have reduced content of amino acids and nitrite and, consequently, of NO in their leaves. It was also analyzed the effect of the NO scavenger, CPTIO, in preventing the fluorescence emission. The results showed that NO is synthesized in specific cells and tissues in the floral structure and its production increases with the floral development until anthesis: the fluorescence of the indicators, prevented by NO scavenger, was restricted to the stigmatic papillae, in the gynoecium, and to pollen grains produced by anther in stamen. Mutant plants of A. thaliana nia1 nia2 showed the same pattern of NO emission by the floral organs to that observed in the wild type genotype. Sepals and petals showed no significant NO production in both genotypes analyzed. Validation of the results obtained by fluorescence microscopy was realized by incubating floral tissues with DAF-2 and quantifying, by spectrofluorimetry, the DAF-2T resulted from reaction between the probe and the NO emitted by the tissues. Data obtained by spectrofluorimetry showed that the fluorescence intensity emitted by floral buds was higher during stage 11 of development, corroborating localization data obtained by fluorescence microscopy. Additionally, wild type plants showed greater intensity of fluorescence emission, on average, than nia1 nia2 plants: 1,39 and 1,89 times higher in phases 11 and 13 of development, respectively. A second objective of this work was to evaluate the role of the NR enzyme in floral induction. Data obtained revealed that nia1 nia2 plants flowers earlier, 6 days on average, than the wild-type plants. To verify whether the early flowering phenotype in nia1 nia2 was only consequence of the NO deficiency, or was also due to the amino acids deficiency, it were analyzed the parameters of floral induction in nia1 nia2 plants treated with the amino acids arginine or glutamine for the recovery of the amino acids levels. Flowering in this mutant remained precocious, suggesting that the early flowering phenotype is a consequence of NO deficiency in these plants during the vegetative growth. These results suggest that NO may have an important role in the flowering process and to the reproductive success of the plant / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Ione Salgado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campoinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_HalleyCaixetade_D.pdf: 3949471 bytes, checksum: cf24197fabcb7bb0a920baa1ef786e63 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O controle da homeostase do óxido nítrico (NO), determinada pelo balanço entre os processos de síntese e degradação, é essencial para suas funções sinalizadoras. O presente estudo teve como objetivo geral buscar um melhor entendimento da homeostase do NO em plantas, enfocando a importância dessa molécula na bioenergética mitocondrial e na resposta de defesa vegetal ao ataque de patógenos. Inicialmente, foi realizada a caracterização de uma atividade de degradação de NO por mitocôndrias isoladas de tubérculos de batata, observando-se um consumo mitocondrial dependente de sua reação com o ânion superóxido, estimulado na presença de NAD(P)H. Ensaios com diferentes substratos e inibidores respiratórios evidenciaram as NAD(P)H desidrogenases externas, além do complexo III, como os principais sítios de geração de ânion superóxido para o consumo de NO. Por outro lado, numa análise comparativa com mitocôndrias isoladas de fígado de rato, uma atividade NAD(P)H oxidase mitocondrial não associada à cadeia respiratória foi detectada como uma fonte de superóxido, em adição ao vazamento de elétrons nos complexos I e III, para o consumo de NO. Em ambos os casos, a existência de mecanismos mitocondriais de degradação de NO mostrou-se importante para o controle de seus efeitos inibitórios sobre a atividade respiratória. Adicionalmente, a importância da síntese de NO para a defesa vegetal foi analisada utilizando-se como modelo a interação Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae. Trabalhos anteriores já haviam demonstrado que o mutante de A. thaliana duplo-deficiente para a nitrato redutase (nia1 nia2) apresenta reduzida produção de NO e susceptibilidade à P. syringae, o que poderia resultar de sua prejudicada assimilação de nitrogênio. No presente estudo, plantas nia1 nia2 foram cultivadas com glutamina ou arginina para aumentar os níveis foliares de aminoácidos. Entretanto, esse mutante continuou a desenvolver uma baixa emissão de NO e permaneceu susceptível à infecção bacteriana, indicando que a susceptibilidade não resulta do reduzido conteúdo de aminoácidos. Por outro lado, a fumigação com baixas concentrações do gás NO de plantas nia1 nia2 com os níveis de aminoácidos recuperados restabeleceu a resposta de resistência. Coerentemente, uma análise do perfil transcriptômico utilizando microarranjos de DNA mostrou que o tratamento com NO induziu diversos genes relacionados à defesa em folhas nia1 nia2 infectadas, como aqueles relacionados às vias de sinalização do ácido salicílico e do cálcio, as proteínas relacionadas à patogênese, a reorganização da parede celular e a síntese de compostos com atividade antimicrobiana. Ainda, essa análise indicou novos genes como potenciais alvos do NO, sugerindo aspectos até então desconhecidos do papel dessa molécula sinalizadora na interação fitopatogênica e na fisiologia vegetal. Em especial, destacou-se o possível envolvimento do NO na alteração de transcritos relacionados à sinalização hormonal de forma a permitir um controle atenuador de mecanismos da resposta de defesa. / Abstract: The control of nitric oxide (NO) homeostasis, determined by a balance between the rate of synthesis and degradation, is essential for its signaling functions. The present study aimed a better understanding of NO homeostasis in plants, focusing on the importance of this molecule in mitochondrial bioenergetics and in plant defense response to pathogen attack. Initially, we carried out a characterization of an NO degradation activity by mitochondria isolated from potato tubers, observing a superoxide-dependent NO consumption, that was stimulated in the presence of NAD(P)H. Assays with different respiratory substrates and inhibitors evidenced the external NAD(P)H dehydrogenases, in addition to complex III, as the main sites of superoxide anion generation for NO consumption. On the other hand, in a comparative analysis with mitochondria isolated from rat liver, a mitochondrial NAD(P)H oxidase activity, non-associated to the respiratory chain, emerged as a superoxide source, in addition to the electron leakage from complexes I and III, for NO consumption. In both cases, the existence of mitochondrial mechanisms of NO degradation was important for the control of its inhibitory effects on respiratory activity. Additionally, the importance of NO synthesis for plant defense was analyzed using the interaction Arabidopsis thaliana- Pseudomonas syringae as a model. Previous works have shown that the nitrate reductase double-deficient mutant of A. thaliana (nia1 nia2) presents reduced NO production and susceptibility to P. syringae, that could result from its impaired nitrogen assimilation. Here, nia1 nia2 plants were cultivated with glutamine or arginine to increase the leaf amino acid content. Despite this, this mutant continued to develop a low NO emission and remained susceptible to bacterial infection, indicating that the susceptibility does not result from reduced amino acid levels. On the other hand, the fumigation of amino acid-recovered nia1 nia2 plants with low concentrations of NO gas reestablished the resistance response. Accordingly, a transcriptomic analysis using DNA microarrays showed that NO treatment induced diverse defense-related genes in infected nia1 nia2 leaves, as those associated to salicylic acid and calcium signaling pathways, pathogenesis-related proteins, cell wall reorganization and synthesis of antimicrobial compounds. Additionally, this analysis indicated new genes as potential targets of NO action, suggesting previously unknown aspects about the role of this signaling molecule in phytopathogenic interactions. In special, we can highlight the possible involvement of NO in the modulation of transcripts related to hormonal signaling in order to allow an attenuating control of certain mechanisms of the defense response. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Ladaslav Sodek / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T22:11:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brandao_AndreaDias_M.pdf: 910878 bytes, checksum: 3dfc539bfdad7f8ba8ddf4be823bb6b0 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A soja [Glycine Max (L.) Merr.] tem sido um dos modelos mais usados entre as plantas cultivadas para estudar os efeitos de tolerância à hipóxia, já que é tida como uma planta com certo grau de tolerância ao estresse de oxigênio e sua importância também tem um caráter econômico bastante relevante. Condições de hipóxia são comuns na natureza, por exemplo em campos alagados onde a difusão de oxigênio para o sistema radicular fica bastante prejudicada. Quando o estresse ocorre em tempo prolongado as conseqüências se tornam irreversíveis, levando as plantas à morte, uma vez que são tantos os prejuízos em função da injúria por carência de O2 que acarretam mudanças estruturais em organelas, por exemplo. Nesses casos, mesmo que a disponibilidade de O2 seja restabelecida, a planta não consegue se recuperar. Sabe-se, no entanto, que a presença do nitrato no meio contribui de forma a diminuir e/ou retardar as conseqüências desse processo, aumentando assim a tolerância das plantas a esta condição. Não é conhecido, entretanto, como o nitrato exerce seu efeito benéfico na tolerância à hipóxia. Alguns trabalhos vêm mostrando a ativação da enzima RN (redutase do nitrato) sob este tipo de estresse, um fenômeno que torna interessante a sua participação na tolerância induzida pelo nitrato. Por essa razão esse estudo teve os objetivos de: 1) otimizar método para extração da enzima RN em plantas de soja; 2) avaliar o papel da enzima RN em condições de hipóxia do sistema radicular e 3) Avaliar a utilização e metabolismo do nitrato em condições de hipóxia do sistema radicular. As plantas [Glycine max (L.) Merr. cv IAC-17] foram cultivadas em sistema hidropônico e após atingirem o estádio de desenvolvimento adequado (V4) foram submetidas à hipóxia (pela interrupção do fornecimento de ar comprimido e adição de uma camada de óleo mineral na solução nutritiva do vaso). O período de acompanhamento dos experimentos foi de 4 dias, tempo necessário para que o sistema radicular atingisse a hipóxia. Após esse período também foi estudada a recuperação das plantas do estresse, após a remoção da camada de óleo e restabelecimento da aeração. Foi observado que, independente do pH inicial, o pH da solução nutritiva das plantas em normóxia ficou estável em torno de 7,7 e o das plantas hipóxicas próximos a 6,6. O consumo de nitrato na solução nutritiva das plantas normóxicas e das hipóxicas foi praticamente o mesmo, também foi detectada a presença de nitrito na solução nutritiva dos tratamentos sob hipóxia. Durante o período de recuperação à normóxia, o nitrito acumulado na solução foi gradativamente utilizado. Quanto às raízes, observou-se que em normóxia ocorreu acúmulo de nitrato, enquanto que em hipóxia ocorreu a utilização do nitrato endógeno. Também foi observado nessas condições (hipóxia) o aumento na concentração de aminoácidos livres totais e proteínas em relação às plantas em normóxia. Na seiva do xilema de plantas sob hipóxia foi observada diminuição no teor de nitrato transportado, variação na composição dos aminoácidos livres presentes (aumentando significativamente a proporção de Ala e Gaba e diminuindo principalmente Asn) e aumento do teor de aminoácidos livres totais, em relação às plantas em normóxia. Nas plantas recuperadas, apenas o teor de proteínas da raiz e a composição de aminoácidos livres da seiva do xilema retornaram aos valores encontrados nas plantas normóxicas. Não foi detectada a presença de nitrito no sistema radicular e/ou seiva do xilema das plantas. A atividade da enzima RN foi bastante modificada durante o período de hipóxia diminuindo a valores bem baixos, assim como não houve sua ativação durante o estresse. Em apenas 1 dia de recuperação (retorno à normóxia), sua atividade atingiu os valores das plantas normóxicas. Chegou-se à conclusão de que embora o grau de utilização do nitrato pela planta seja semelhante em normóxia e hipóxia, o seu metabolismo é bastante alterado na hipóxia. Ao contrário do que foi relatado na literatura, a atividade da RN caiu bruscamente durante a hipóxia sem que houvesse evidência de ativação. No entanto, esta alteração na atividade da enzima pode explicar as diferenças no metabolismo do nitrato entre normóxia e hipóxia / Abstract: Soybean [Glycine Max (L.) Merr.] has been frequently used as a model system among cultivated plants in order to study the effects of tolerance to hypoxia, in view of its certain tolerance to oxygen deficiency and its relevant economic importance. Hypoxic conditions are common in nature, for example in flooded fields where the diffusion of oxygen to the root system suffers serious restrictions. When the stress occurs over a long period the consequences can become irreversible leading to the death of the plant in view of the many prejudicial factors arising from oxygen deficiency. These can result in structural changes in organelles, for example, from which the plant is unable to recover on return to normal oxygen availability. It is known, however, that the presence of nitrate in the surrounding medium can diminish or retard the consequences of oxygen deficiency, thereby increasing the tolerance of plants this stress. It is not known, however, what underlies the beneficial effect of nitrate in plant tolerance of hypoxia. Some investigations have shown that nitrate reductase is activated under oxygen stress, a phenomenon that might be related to the tolerance effect of nitrate. Therefore, this study had the objective of: 1) to optmize method for extraction of the RN enzyme in soybean plants; 2)evaluating the role of nitrate reductase during hypoxic stress of the root system and 3) evaluating the utilization and metabolism of nitrate under these stress conditions. Soybean plants [Glycine max (L.) Merr. cv IAC-17] were cultivated in a hydroponic system and after reaching the V4 stage of development were subjected to hypoxia by suspending aeration and applying a layer of mineral oil to the surface of the nutrient solution. The treatment was carried out for 4 days, time enough for the system to undergo hypoxia. Recovery from stress was also studied following hypoxia where the layer of mineral oil was removed from the surface and aeration of the solution restarted. The results showed that independent of the initial pH, the pH of the nutrient solution of normoxic plants stabilized at around 7.7 while that of the plants under hypoxia stabilized at 6.6. The consumption of nitrate in the nutrient solution of the normoxic and hypoxic treatments was practically the same, and nitrite was also detected in the nutrient solution of the plants under hypoxia. During recovery to normoxia, the accumulated nitrite was gradually used. As for the roots, it was observed that under normoxia, nitrate accumulated, while under hypoxia endogenous nitrate was consumed. Besides, under hypoxia, there was an increase in total free amino acids and proteins compared to the controls. In the xylem sap a decline in nitrate was found under hypoxia together with changes in the amino acid composition (where alanine and Gaba increased markedly while Asn diminished) and increases in the total amino acid levels. On return to normóxia only the levels of protein in the root and amino acid composition of the xylem sap returned to values found in the normoxic plants. No nitrite could be detected in the root tissue or xylem sap. Large changes in nitrate reductase activity were found during hypoxia, being reduced to low values. Nor was there any evidence for the activation of the enzyme during the stress. In less than one day on returning to normoxia activity returned tonormoxic plants levels. It was concluded that despite the similarity in the amounts of nitrate utilized comparing plants under normoxia and hypoxia, it was evident that its metabolism was quite different under these two conditions. Contrary to that reported in the literature, nitrate reductase activity falls drastically during hypoxia without any evidence for activation of the enzyme. Nevertheless, the alteration in activity could explain the differences in nitrate metabolism observed between for normóxia and hypoxia / Mestrado / Mestre em Biologia Vegetal

Orientador: Ricardo Aparicio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T20:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_MarceloLeitedos_D.pdf: 11878298 bytes, checksum: ee2390825183c2b5891dddf20f4e2509 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Nesta tese são apresentados os resultados da caracterização estrutural, principalmente por Cristalografia e Espalhamento de Raios X a Baixos Ângulos (SAXS), de importantes proteínas de venenos de serpentes e de semente de milho. Modelos estruturais foram obtidos para diferentes fosfolipases A2 (PLA2) de venenos, destacando-se dois modelos cristalográficos para uma PLA2 de Bothrops jararacussu resolvidos nos grupos de espaço P3121 e P212121, numa resolução máxima de 1,83 Å e 1,98 Å, cujos valores finais de Rfactor iguais a 19,7 % e 17,3 % (Rfree = 26,5 % e 23,8 %) foram obtidos, respectivamente. Ambos modelos apresentaram um inesperado fator de agregação plaquetária em seu sítio ativo e um interessante padrão pentagonal de moléculas de água altamente organizadas na superfície externa do canal hidrofóbico. Também foram recuperados envelopes de SAXS para uma PLA2 de Crotalus durissus cascavella, antes e após seu tratamento com naringina, que apresentaram uma nova configuração dimérica para fosfolipases A2 em solução e permitiram identificar o provável sítio de interação deste flavonóide. As proteínas de semente estudadas são aldose redutases (AR), as quais parecem estar envolvidas no metabolismo de sorbitol no milho. Esta mesma enzima em humanos está diretamente relacionada com complicações diabéticas em situações de hiperglicemia ao catalisar a conversão da glicose em excesso a sorbitol, que por sua vez é extremamente tóxico às células. Ao todo, seis modelos cristalográficos (apoenzima, complexos com cofatores enzimáticos e complexos ternários) foram obtidos para ARs específicas do embrião e endosperma. Dois destes modelos tiveram seu refinamento estrutural finalizado. O primeiro, para a apoenzima AKR4C7 do endosperma, apresentou valores finais de Rfactor e Rfree iguais a 16,6 % e 20,0 % a uma resolução máxima de 1,45 Å. O segundo, para o complexo da AKR4C13 do embrião com o cofator enzimático NADPH, convergiu para valores de Rfactor e Rfree iguais a 15,4 % e 18,9 % também a uma resolução máxima de 1,45 Å. Análises preliminares dos modelos cristalográficos das ARs de milho foram realizadas com intuito de investigar as possíveis razões para a existência de atividade catalítica frente ao sorbitol, mas não para glicose. De modo geral, as principais características estruturais destas e de ARs de outros organismos são conservadas, incluindo os resíduos do sítio ativo e suas conformações. Assim, mais estudos ainda são necessários até que se possa compreender as razões para a predileção ao sorbitol, em detrimento da glicose, pelas ARs da semente de milho / Abstract: This PhD thesis presents the results of a structural characterization of important proteins from snake venoms and maize seed mainly through Crystallography and Small-Angle X Ray Scattering (SAXS). Structural models were obtained for different phospholipases A2 (PLA2) from snake venoms, remarkably two crystallographic models for a PLA2 from Bothrops jararacussu in whose active site it was found an unexpected platelet aggregation factor and an interesting pattern of water clusters showing a highly organized pentagonal distribution that was found on the outside of the models¿ hydrophobic channel. Refined crystal structures were obtained at 1.98 Å and 1.83 Å resolution for crystals belonging to the space groups P212121 and P3121, showing crystallographic (Rfactor) and Rfree values of 17.3 % and 23.8 % for the space group P212121 and 19.7 % and 26.5 % for the space group P3121. SAXS envelopes for a PLA2 from Crotalus durissus cascavella treated and non-treated with naringin which allowed to identify possible flavonoid binding sites were also recovered. In addition, it was observed that C. d. cascavella dimers present a new extended configuration never seen before for phospholipases A2 in solution. The seed proteins studied are aldose reductases (AR) that seems to be related with sorbitol metabolism in maize. In humans, aldose reductases are straightly related with diabetic complications in hyperglycemic situations where the conversion of excess glucose to sorbitol induces serious cellular damage, since this product is extremely toxic to cells. Altogether, six crystallographic models for apoenzyme, complexes with enzymatic cofactors and ternary complexes were obtained for specific ARs from embryo and endosperm. The structural refinement for two of these models was already finished. The first model was obtained for the apoenzyme AKR4C7 from maize endosperm that presented Rfactor and Rfree values of 16,6 % and 20,0 %, respectively, at a maximum resolution of 1,45 Å. The second corresponds to the AKR4C13 from maize embryo complexed with the enzymatic cofactor NADPH for which crystallographic Rfactor of 15,4 % and Rfree of 18,9 %, at a maximum resolution of 1,45 Å, were obtained. Maize AR models were analyzed aiming at evaluate possible reasons for the lack of catalytic activity for glucose. In general, the main structural features of these ARs and from other organisms are conserved, including the active site residues and their conformations. Thereby, additional studies are still necessary to understand the reasons for the sorbitol preference over glucose in the enzimatic activity of maize aldose reductases / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Orientador: Marcos Pereira Marinho Aidar / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T02:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nobrega_GiseliAreias_D.pdf: 18561704 bytes, checksum: 94b712faf7ec2492cdcd1ca4a9d2d54b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutora em Biologia Vegetal

Orientador: Ladaslav Sodek / Tese (doutorado) - Universidade Esstadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T18:53:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lanza_LucianaNunesMenolli_D.pdf: 7782960 bytes, checksum: 92b0ce21151564c79758f7150c4afd6d (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A soja é a leguminosa de maior importância econômica no Brasil com produção de 72,23 milhões de toneladas na safra de 2010/2011. O cultivo de soja em regiões que sofrem alagamento é uma das principais causas de perda de produtividade no Brasil. Nestas condições, ocorre redução na taxa de oxigênio do solo, e o sistema radicular da planta entra em hipoxia prejudicando o desenvolvimento e a produtividade das plantas. Existem evidências de que a adição de nitrato em condições de alagamento do sistema radicular (hipoxia) promove tolerância ao estresse, entretanto os mecanismos bioquímicos que envolvem essa tolerância ainda não estão totalmente elucidados. Analisando as alterações no metabolismo de nitrogênio em hipoxia, em plantas submetidas a diferentes condições experimentais, observou-se redução do conteúdo de nitrato dentro da planta, aumento no teor de aminoácidos solúveis totais, aumento na composição dos aminoácidos livres: Ala e Gaba, e redução de Asn, em plantas não noduladas e noduladas, além de redução no conteúdo de ureídeos totais em plantas noduladas. A adição de nitrato promoveu maior conteúdo de nitrato nas raízes, seiva do xilema e nódulos, maior teor de aminoácidos solúveis totais, maior conteúdo de proteínas solúveis totais nas raízes e menor nas folhas. A atividade da enzima redutase do nitrato in vivo em condições de hipoxia reduziu nas raízes das plantas não noduladas e nas raízes e folhas das plantas noduladas. A inclusão de K15NO3 no meio demonstrou que o nitrato é, de fato, absorvido em condições de hipoxia, pois as raízes, folhas e nódulos todos incorporaram o 15N. Entretanto, absorção do nitrato sob hipoxia foi bem menor do que sob normoxia. Tanto em normoxia como hipoxia as raízes apresentaram o maior grau de enriquecimento com 15N enquanto que a incorporação nos nódulos foi menor. Houve incorporação de 15N em aminoácidos em todos os tecidos, o que permite concluir que o nitrato não é apenas absorvido pelas raízes sob hipoxia mas também assimilado e transportado para a parte aérea. Os aminoácidos mais próximos ao processo de assimilação de nitrato, Asp, Glu, Ala e Asn, foram os que mais incorporaram o 15N. No entanto, em geral um grau menor de incorporação foi encontrado sob hipoxia. A adição de nitrato, no dia 7, na solução do vaso de cinco cultivares de soja cujo sistema radicular estava alagado promoveu, na cultivar IAC Foscarin-31, maior crescimento da planta quando comparada às plantas com nitrato desde o início do experimento; na cultivar IAC-23, maior massa seca do sistema radicular; nas cultivares IAC-17 e IAC-18 foi evidenciado o mesmo crescimento da planta que as demais com nitrato; e na cultivar IAC-24, houve menor crescimento da planta. A adição também promoveu maior formação de aerênquima no caule, na raiz principal e adventícia, além de estimular a maior formação de raízes adventícias. Os dados sugerem que em condições de hipoxia, embora em quantidades bastante reduzidas e num processo mais lento, o nitrato é absorvido pelas raízes, sendo parte, convertida a aminoácidos e menos de 40% convertidos a nitrito, o qual é eliminado para o meio. A redução do nitrato via redutase do nitrato, passo inicial de sua metabolização, não é um passo limitante, uma vez que há produção de nitrito, produto da atividade da enzima. Com a adição de nitrato na solução do vaso de cinco cultivares de soja foram observadas tendências para suprir a ausência de nitrogênio e manter o desenvolvimento da plantas em condições de alagamento. A cultivar IAC Foscarin-31 e IAC-24 apresentaram crescimento geral da planta, sendo maior o crescimento observado na cultivar IAC Foscarin-31. Na cultivar IAC-23 houve maior crescimento do sistema radicular; na cultivar IAC-17, da parte aérea, assim como na IAC-18 / Abstract: Soybean is a legume of great economic importance in Brazil with a production of some 72.23 million tons (2010/2011 harvest). One of the main causes of diminished yields of the cultivars produced in Brazil is their cultivation in regions subject to flooding. Under such conditions reduced availability of oxygen in the soil leads to hypoxia of the root system which impairs plant development and yield. There is evidence that the presence of nitrate during flooding can improve tolerance to hypoxic stress. However, the biochemical mechanisms underlying this phenomenon have not been fully elucidated. After analysis of the changes in nitrogen metabolism that occur under hypoxia, in plants subjected to a variety of experimental conditions, it was observed that there was a reduction in plant nitrate content, an increase in total soluble amino acids, an increase in the relative abundance of free Ala, Gaba, and a reduction in Asn, in both nodulated and non-nodulated plants, as well as a reduction of ureides in nodulated plants. The addition of nitrate during flooding resulted in a higher nitrate content of the root, nodule and xylem sap. Total soluble amino acids and soluble proteins also increased in the root under these conditions but decreased in the leaf. Under hypoxia the in vivo nitrate reductase activity declined in the roots of non-nodulated plants and in both the roots and leaves of nodulated plants. The inclusion of K15NO3 in the nutrient solution confirmed the uptake of nitrate under hypoxia, since roots, leaves and nodules became labelled. However, uptake under hypoxia was much lower than that observed under normoxia. Under both normoxia and hypoxia the roots showed the highest degree of 15N enrichment while the nodules showed the weakest. Incorporation of 15N in amino acids of all tissues shows that 15NO3 was not only taken up by the roots under hypoxia but that it was assimilated and transported to the shoot. The amino acids considered closest to N assimilation, Asp, Glu, Ala and Asn, were the most highly labelled. Nevertheless, lower levels of incorporation were generally found under hypoxia. The addition of nitrate to the hydroponic nutrient solution of five soybean cultivars, 7 days after flooding the root system, stimulated greater growth of the cultivar IAC Foscarin-31 as compared to plants with nitrate from the beginning of the experiment. It also stimulated greater root dry mass of the cultivar IAC-23, produced a similar growth increase of cultivars IAC-17 and IAC-18 compared to those with nitrate from the beginning, but resulted in less growth for the cultivar IAC-24. The addition of nitrate also stimulated formation of adventitious roots as well as aerenchyma which formed on both the stem and the main and adventitious roots. The data show that under conditions of hypoxia, nitrate is taken up by the roots although at a much lower rate than under normoxia, and in part is assimilated into amino acids while nearly 40% is reduced to nitrite which is excreted to the surrounding medium. The reduction of nitrate by the enzyme NR, the first step of nitrate metabolism, does not appear to be limiting since large quantities of the reaction product, nitrite, accumulate. With the addition of nitrate to the flooding medium of five soybean cultivars there was a tendency to overcome the absence of nitrogen and maintain plant development under flooded conditions. Of the five cultivars studied, IAC Foscarin-31 and IAC-24 responded positively through overall plant growth, with Foscarin-31 showing the greatest growth. Cultivar IAC-23 responded with greater root growth while IAC-17 and IAC-18 presented greater shoot growth / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal

Ribonucleotide Reductases (RNRs) are crucial enzymes that catalyze reduction of ribonucleotides to deoxyribonucleotides, required for the biosynthesis of DNA. Vital role played by RNR in the biosynthesis of DNA and its control on cell growth made it one of the main targets for anticancer therapy. Several laboratories clarified the aspects of reaction cascades at active site of RNR. Biochemical studies of RNR by Stubbe for the inactivation of RDPR by 2'-chloro-2'-deoxyuridine-5'-diphosphate emphasizes departure of chlorine as an anion, while biomimetic studies by Robins with 6'-O-nitro-2'-chloro-homonucleosides emphasizes the elimination of chlorine substituent from 2'-position as a radical. To clarify the ambiguity in the mechanism of inhibition of RNR by 2'-chloro-2'-deoxyuridine, biomimetic reactions with model 6-O-nitro-1,5-dideoxyhomosugar derivatives were investigated. The study includes several modes: (i) synthesis of 6-O-nitro-1,5-dideoxyhomosugar derivatives with chlorine, bromine or tosyl substituent at the C2 position with ribo and arabino configurations, (ii) biomimetic studies of 6-O-nitro-1,5-dideoxyhomosugar derivatives with Bu3SnH/AIBN to provide chemical evidences to distinguish the nature of elimination of chlorine from 2'-chloro-2'-deoxyuridine upon its incubation with enzyme, and (iii) kinetic studies to differentiate between heterolytic or homolytic C2'-chlorine bond cleavage. In the second half of this dissertation, azido and sulfenamide modified nucleosides and 2-azidolyxofuranoside derivatives have been synthesized with the azido or sulfenamide substitution at a specific site in the sugar or in the base moiety. The electron-induced site specific formation of neutral aminyl radicals (RNH●) and their subsequent reactions have been investigated using ESR spectroscopy. In 2'-AZdC the RNH● site is attached to a 2o C-atom, where as in 4'-AZdC, the RNH● site is attached to a 3o C-atom, respectively. These studies elucidated how stereo and electronic environment affect formation and subsequent reactivity of various types of RNH● generated from azidonucleosides. To avoid the interaction of transient radical with nucleoside heterocyclic bases, 2-azidolyxofuranoside derivatives as a simpler abasic model were synthesized and studied with ESR spectroscopy. Aminyl radical generated from 2-azidolyxofuranoside derivatives subsequently abstracted hydrogen from C5 intramolecularly. These studies were designed to understand the mechanism of damage in various DNA model structures.