Durante la regeneración hepática el contenido de fructosa 2,6-bisfosfato, Fru-2,6-P(2) disminuyó rápidamente (1 h) manteniéndose los niveles bajos durante las primeras 24 h. A partir de este tiempo, los niveles tendieron a recuperarse sin alcanzar los valores control a los 7 días. El contenido de glucógeno mostró un perfil similar siendo la disminución inicial menos rápida (mínimo a las 6 h) y restableciéndose el contenido a los 7 días. Los bajos niveles de Fru-2,6-P(2) después de una hepatectomía parcial correlacionan con el incremento de la gluconeogénesis y la disminución de la glucolisis descritos. Posiblemente la causa de la rápida disminución del contenido de Fru-2,6-P(2) después de una hepatectomía parcial sea la fosforilación del enzima por la proteína quinasa dependiente de cAMP como así lo sugiere la rápida disminución de la actividad PFK-2 activa (que representa la actividad quinasa de la forma no fosforilada del enzima bifuncional 6-fosfofmcto 2-quinasa/fructosa 2,6-bisfosfatasa, PFK-2/FB/Pasa-2) y del cociente de actividades PFK-2 activa/total (reflejo del grado de fosforilación del enzima bifuncional). Otros factores como la disminución del contenido de hexosas 6-fosfato y el aumento de citrato y fosfoenolpiruvato podrían también contribuir al mantenimiento de estos bajos niveles.Durante el proceso regenerativo aparece una forma del enzima bifuncional diferente a la del enzima de hígado adulto como lo indica su comportamiento cinético frente al glicerol 3-fosfato y a la incubación con la proteína quinasa dependiente de cAMP. El diferente reconocimiento de esta forma enzimática con anticuerpos específicos de la PFK-2/FBPasa-2 de hígado y con anticuerpos contra toda la proteína sugiere que tiene su extremo amino modificado. Durante todo el proceso proliferativo el ARNm que se expresa es específico de hígado por lo que la modificación del extremo amino no es debida a un alternativo "splicing" del gen sino a alguna modificación post-transcripcional aún no descrita para este enzima.Los niveles de ARNm del enzima bifuncional disminuyeron rápidamente después de una hepatectomía parcial con un mínimo a las 6 h y aumentando después de este tiempo con un máximo a las 48-60 h, y tendiendo a normalizarse después de este tiempo. Estos niveles de ARNm estuvieron regulados a nivel transcripcional, no correlacionando las variaciones del contenido de ARNm con variaciones en el contenido del enzima. La velocidad de degradación del ARNm del enzima bifuncional no se modificó durante las primeras horas después de una hepatectomía parcial sugiriendo un papel mis importante de la regulación transcripcional durante esta fase.Los niveles de ARNm de los enzimas considerados reguladores de la glucolisis/gluconeogénesis: glucoquinasa (GK), piruvato quinasa (L-PK), fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa-1) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) fueron analizados por "Northern blot". En general, durante la fase pre-replicativa (0-12 h) se observa una disminución del contenido de ARNnl de los enzimas glucolíticos y aumento del de PEPCK. Esta correlación se rompe durante la fase replicativa (>12 h) donde se aprecia la recuperación del mensajero de GK (24 h), junto con elevados niveles de PFK-2FBPasa-2 y PEPCK. El contenido del mensajero de la LPK se recuperó a los 7 días, mientras que los niveles de FBPasa-1 no se modificaron significativamente durante todo el proceso regenerativo. El contenido de ARNm de estos enzimas también fue analizado en los animales laparotomizados y, aunque mostraron algunas modificaciones, éstas fueron mucho menos pronunciadas que en los animales hepatectomizados, normalizándose alrededor de las 24 h.La administración de glucagón intraperitonealmente (1 mg/kg) produjo sobre el sistema de la Fru-2,6-P(2) (metabolito, enzima, mensajero) una situación similar a la detectada durante las primeras horas después de una hepatectomía parcial. Así se observó una disminución del contenido de Fru-2,6-P2 en paralelo a la fosforilación del enzima. La actividad PFK-2 total y el contenido de ARNm también disminuyeron. Los niveles de ARNm estuvieron regulados a nivel transcripcional observándose una disminución de la velocidad de transcripción del gen en paralelo al contenido del ARNm. Sorprendentemente, la estabilidad del ARNm del enzima bifuncional aumentó en presencia de glucagón sugiriendo que quizás las vidas medias de losARNm estimadas mediante este procedimiento "in vitro" no reflejen las vidas medias reales "in vivo". Esta estabilización de los niveles de ARNm en presencia de glucagón también ocurrió para la L-PK y la PEPCK. La estabilización de los ARNm se modificó en presencia de cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteínas, sugiriendo todos estos datos que en la estabilización de estos ARNm están involucradas proteínas con un recambio rápido y reguladas por un proceso dependiente de cAMP. / Glycogen and fmclose 2,6-bisphosphate levels in rat liver decreased quickiy after partial hepateciomy. After 7 days the glycogen level was normalyzed and fructose 2.6-bisphosphate concentration still remained low. The active (non-phosphorylaied) fonn of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose 2,6-bisphosphatase (PFK-2/FBPase-2) varied in parallel with fructose 2.6- bisphosphate levels. The mRNA of PFK-2/FBPase-2 expressed during the hepatic regeneration is the adult liver form. The kinetic and immunological differences found for PFK-2/FBPase-2 during liver regeneration could reflect some as yet unidentified post-translational change.The mRNA levels of glucokinase (GK), L-pyruvate kinase (L-PK), PFK-2EBPase-2, fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase-1) and phosphoenolpyurvate carboxykinase (PEFCK) were analyzed during liver regenerartion. The mRNA levels of glycolytic enzymes (GK, PFK-2/FBPase-2 and L-PK) decreased rapidly after partial hepatectomy. GK mRNA increased at 16-24 h, returning to normal values after his time. After six hours the PFK-2/FBPase-2 mRNA increased to a maximum at 48 hours, and returned to normal levels by 96 hours. L-pyruvate kinase mRNA recovered control levels al 168 h. In contrast, phosphoenolpyruvate carboxykinase mRNA increased rapidly after liver resection and remained high during the regenerative process. However, the levels of fructose 1,6-bisphosphatase mRNA, another gluconeogenic enzyme, were not modified significantly. These results correlate with reported rates and enzyme levels of increased gluconeogenesis after partial hepatectomy. The effect of stress on the mRNA levels was also studied. All enzymes showed variations in their mRNA levels following the surgical stress. The differences were more pronounced in regenerating than in sham animals, being practically normalized at 24 h. The rate of gene transcription of PEFCK, PFK-2/FBPase-2 and albumin was measured during liver regeneration. The transcription rate of albumin did not change whereas that of PEPCK was increased >12-fold at 6 hours and remained high during the regenerative process. The rate of gene transcription of PFK-2FBPase-2 decreased by 50 % at 6 hours and increased thereafter with a maximum at 72 hours, and then returned to control values at 96 hours. These results correlate with the mRNA levels and demonstrate that gene inscription of PEFCK and PFK-2FBPase-2 is specifically regulated, and that this regulation is in part responsible for the alterations in hepatic metabolism seen in regenerating liver.The administration of glucagon reproduced in fructose 2.6-bisphosphate system (meitabolite, protein, mRNA) a similar situation that we have described during the first hours after partial hepatectomy.

El procés de regeneració permet als organismes refer parts o teixits del seu cos que han sofert algun dany. Els discs imaginals de Drosophila melanogaster, primordis larvaris de les estructures adultes, tenen capacitat de promoure processos de cicatrització i proliferació, regenerant el teixit i donant lloc a estructures adultes completament normals. Hem estudiat el perfil d’expressió de discs d’ala a 0, 24 i 72h de regeneració. Els resultats obtinguts mostren un enriquiment significatiu de l’expressió de Factors de Transcripció lligats a importants vies de senyalització com Wingless (Wg), Notch (N) i Jun N-terminal Kinasa (JNK). Mitjançant la cerca computacional de motius d’unió d’AP-1 (factor de transcripció de la via de la JNK) en els promotors dels gens amb canvis d’expressió, hem descrit els gens diana d’aquesta la via procés durant la regeneració. Entre aquests gens es troba cabut (cbt), l’expressió del qual augmenta durant les primeres 24h i disminueix a les 72h, recuperant els seus nivells basals. Hem confirmat aquests resultats per qRT-PCR i amb tècniques d’hibridació in situ, demostrant a més, que l’increment de l’expressió de cbt està associat a cèl•lules del blastema. També hem comprovat que l’expressió de cbt augmenta per sobreactivació de la via de la JNK en el disc d’ala, tal i com s’havia vist prèviament en embrió. Mitjançant la tècnica EMSA hem validat la unió in vitro de les proteïnes Jun i DFos (que formen el dímer AP-1) a la seqüència predita en el promotor del gen cbt confirmant la regulació directe de la via de la JNK. L’anàlisi de discs mutants per cbt indica que l’expressió d’aquest gen és necessària per al tancament de la ferida i proliferació durant la regeneració. Cabut (Cbt) és un factor de transcripció Zn finger de la família dels Krüpple like Factors i els seus ortòleg en vertebrats són els gens TGFβ Inducible Early Genes (TIEG). Aquest gen s’ha descrit com a modulador de les vies Dpp i JAK/STAT en el disc d’ala. Una aproximació per descriure les funcions d’un factor de transcripció com Cbt és determinar els seus gens diana. Amb aquest objectiu hem realitzat un ChIP-Seq amb un anticòs contra la proteïna Cbt. Els resultats obtinguts mostren que Cbt es troba localitzat principalment als promotors dels gens. Aquest estudi ha reportat 2060 gens diana de Cbt en el disc d’ala. Les categories funcionals GO associades a aquest grup de gens són: Regulació de la transcripció, cicle cel•lular, desenvolupament dels discs imaginals i desenvolupament neuronal. També hem trobat un enriquiment en gens lligats a vies de senyalització com la JNK, Wg i N. L’anàlisi de les seqüències de les dianes de Cbt i altres estudis publicats apunten els factors Sin3A i GAF com a possibles cofactors de Cbt. Finalment hem analitzat el paper de Cbt en la regulació de la via de N, els resultats obtinguts mostren que Cbt regula positivament la via de N promovent el creixement i la formació del marge Dorso/Ventral del disc d’ala. Per tal d’establir quins factors de transcripció s’uneixen al promotor de cbt i regulen la seva expressió, hem realitzat un cribratge a gran escala utilitzant la tècnica de Yeast-One-Hybrid, que permet descriure la unió de factors de transcripció a una seqüència concreta. Hem obtingut factors de transcripció lligats al desenvolupament neural, a la segmentació i a la resposta immune amb capacitat d’unir-se al promotor de cbt. Aquestes dades no només ens donen informació sobre la regulació de Cbt sinó que també suggereixen la seva implicació en aquests processos. En conjunt el nostre treball mostra que Cbt regula el creixement i l’homeòstasi del disc d’ala durant el desenvolupament. I que quan es produeix un dany en aquest teixit l’expressió de Cbt incrementa, de manera depenent de la via de la JNK, per garantir la restauració del teixit perdut. / Regeneration is the ability to rebuild a body part that has been damaged or amputated. Drosophila imaginal discs are able to undergo wound healing and regenerative growth after ablation. Genome-wide expression profiling of regenerating wing discs at 0, 24 and 72 hours after fragmentation have revealed a significant enrichment of transcription factors and chromatin regulators. To identify JNK target genes among the differentially expressed genes we performed a computational search of AP-1 binding sites in the promoter regions of these gens. Among them we identified cabut (cbt), the Drosophila ortholog of TGFβ Inducible Early Genes (TIEG). During regeneration cbt expression is induced between 0 and 24 and down-regulated between 24 and 72 hours, suggesting a tight and controlled mechanism of regulation. qRT-PCR and in situ hybridization experiments confirmed cbt expression changes and highlighted that cbt upregulation is associated to cells located in the blastema region. Moreover the analysis of regenerated cbt mutant discs demonstrated that cbt upregulation is required for wound healing and growth during regeneration. Cbt is a Zn finger transcription factor related to JNK and Dpp pathways, but few is known about its target genes. In order to identify Cbt target genes in development, we performed a Cbt ChIP-Seq analysis of wing discs from larvae III. This study reveal that Cbt is located mostly in the promoter regions of its target genes. We identified 2060 Cbt target genes which were related to functional categories such imaginal disc development, transcription regulation, neuron development or cell cycle. Furthermore several Cbt target genes were associated to signaling pathways like JNK, Wg or Notch (N). The analysis of cbt targets and previous reports pointed the factors GAF and Sin3A as a possible cofactors of Cbt. Finally, genetic interactions between cbt and N mutants demonstrated that Cbt regulates positively N signaling contributing to growth and Dorso/Ventral wing margin regulation. Although we have demonstrated that JNK is upstream of cbt, there is no much data available about cbt regulation in normal development. To approach this question we performed a high throughput Yeast-One-Hybrid screening that allowed us to defined factors that bind to cbt proximal promoter. The identified factors were related to immune response, neuron development and segmentation. Our results contributed to decipher cbt regulation network and suggested possible new roles for Cbt. In summary Cbt regulates growth and homeoastasis of wing disc during development. However in front of injury cbt is upregulated in a JNK dependent manner to ensure complete regeneration.