Orientador: Jorge Vega / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T01:34:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grassi_CeliaReginaBaptista_D.pdf: 7491191 bytes, checksum: 42621d496c1b182927c242174286d9c9 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Esta tese teve como objetivos caracterizar as alterações histológicas e fisiológicas induzidas em plantas de laranja 'Pera¿ e limão 'Galego', inoculadas com isolados fracos (Pera IAC e Isolado 50) e severos (Pera Rio e Barão B) do vírus da tristeza dos citros (CTV); estudar as respostas das plantas à infecção pelo CTV quanto à variação de atividades enzimáticas envolvidas na reação da planta (PAL, CAD, Peroxidases ligadas à parede celular POX-lig); obter dados sobre a localização a nível morfo-histológico de peroxidases ligadas à parede celular; obter dados sobre isoenzimas de peroxidases envolvidas na resposta à infecção pelo CTV; caracterizar a resposta das plantas à infecção pelo CTV quanto a alterações no conteúdo de ácido salicílico total. Para tanto, plantas de laranja 'Pera¿ e limão 'Galego¿ foram inoculadas por união de tecido com borbulhas de plantas infectadas com os isolados do vírus. Como controle foram usadas plantas enxertadas com borbulhas sadias. As plantas foram mantidas em casa de vegetação. Nos experimentos onde determinou-se a atividade das enzimas PAL,CAD e Pox-lig foi verificado, com exceção da enzima CAD, que plantas infectadas pelos isolados severos do CTV apresentaram um aumento significativo na atividade dessas enzimas, enquanto que as plantas infectadas pelos isolados fracos do virus diminuíram a atividade ou não a modificaram. Quando guaiacol e siringaldazina, substratos específicos para determinar a atividade de peroxidases foram usados, observou-se que a atividade de guaiacol peroxidase não apresentou correlação com a severidade do isolado do CTV. As diferenças observadas na atividade de siringaldazina peroxidase foram de tal magnitude que poderiam ser consideradas na prática como um parâmetro na diferenciação entre isolados fracos e severos do CTV. A enzima CAD não foi estimulada pela infecção com os diferentes isolados do CTV, não foram observadas diferenças nas atividades entre a plantas infectadas com vírus e plantas sadias. Assim como na Pox -lig e P AL, o conteúdo de ácido salicilico foi mais elevado somente nas plantas infectadas pelos isolados severos do vírus. Plantas infectadas pelo isolado severo Barão B apresentaram teores de SA duas vezes mais elevados que as plantas sadias e 2,7 e 4,4 vezes o valor de plantas infectadas com os isolados Pera IAC e Galego 50, respectivamente. Nos experimentos de eletroforese as isoperoxidases foram separadas em gel ácido (pH 4,5) e gel alcalino (pH 8,3). Em gel alcalino utilizando carbazole como substrato genérico para peroxidases, observou-se duas bandas peroxidases citoplasmáticas nos materiais infectados com isolados severos, enquanto que com o isolado fraco e plantas sadias apresentaram apenas uma banda. Em pH ácido, utilizando siringaldazina como substrato, apenas uma peroxidase de parede celular foi detectada em plantas infectadas pelos isolados severos do CTV. Plantas sadias e infectadas com isolados fracos do vírus não apresentaram atividade. A análise da atividade de guaiacol peroxidase através de fracionamento por HPLC mostrou que as plantas infectadas com o isolado severo do CTV apresentaram dois picos de atividade, sendo o primeiro aos 16-17 minutos de eluição com atividade em tomo de 0,02 ?Abs / mino e o segundo pico, aos 19,5 mino de eluição, com atividade bem maior, em tomo de 0,09 ?Abs / min. Por outro lado, plantas sadias e plantas infectadas com isolado fraco do vírus apresentaram apenas um pico de atividade aos 20 mino de eluição com atividade ao redor de 0,04 e aos 21 min. de eluição com atividade ao redor de 0,06 ?Abs / min, respectivamente. Nos ensaios de microscopia de fluorescência, plantas de limão' Galego' infectadas pelo isolado severo Barão B apresentaram depressões no xilema que foram visualizadas quando utilizou-se excitação com luz UV (Fig. 13 a). O material apresentou fluorescência amarela com excitação por luz azul (Fig. 13 b). Em plantas sadias e plantas infectadas pelo isolado fraco Galego 50 não foram observadas alterações na fluorescência na região do floema e do câmbio vascular (Fig. 13 c,d, respectivamente). Em plantas de laranja 'Pera' infectadas pelos isolados severos Barão B e Pera Rio, foi observado um acúmulo de material fluorescente verde na região do câmbio vascular. o trabalho permite concluir que a atividade de peroxidase associada à lignificação (Pox-lig) pode ser considerada como um parâmetro bastante significativo para a diferenciação de isolados fracos e severos do CTV. Os isolados severos do vírus causam aumento na atividade de enzimas envolvidas nas reações de defesa das plantas, concomitante com o aumento no teor de SA, que atua como molécula sinalizadora. Plantas infectadas pelos isolados severos apresentam disfunção do floema, na região do câmbio vascular e também o aparecimento de uma proteína com atividade peroxidásica que pode ocorrer através de síntese de novo (ativação gênica) ou por ativação de proteína preexistente / Abstract: The present work had as objective the characterization of physiological and histological alterations induced in 'Pera' sweet orange and 'Mexican' lime plants infected by severe (Pera Rio and Barão B) or mild (pera IAC and Isolado 50) isolates of citrus tristeza virus (CTV). The response of plants to CTV infection was examined in relation to changes in enzymatic activities associated with the reaction of the plant to virus infection: P AL, CAD and cell wall-associated peroxidase (Pox-lig). Also examined were the content of salicylic acid, the histological localization of cell wall-associated peroxidases and their electrophoretic characteristics. All the experiments were conducted in 'Pera' orange and 'Mexican' lime plants, graft-inoculated with the different CTV isolates. As healthy controls, plants graft inoculated with healthy scions were used. The plants were kept in the greenhouse during the experiments. Two enzymes, P AL and cell wall-associated peroxidase, have their activity significantly increased in plants infected by severe CTV isolates. These enzyme activities were reduced or not changed by infections with mild isolates, as compared to healthy controls. This correlation between activity and severity of the virus isolate was not observed when guaiacol was used as generic substrate in the peroxidase assay. However, using syringaldazine as substrate for cell wall-associated peroxidase (Pox-lig), the correlation was evident. The differences in syringaldazine-peroxidase and in P AL activities were of such magnitude that they may be useful as a parameter in differentiating mild and severe isolates. The activity of the enzyme CAD was not changed by CTV infection, whether of severe or mild isolates. Paralleling the activity of Pox-lig, the content of salicylic acid was also increased only in plants infected by severe CTV isolates. 'Pera' oranges infected with the severe isolate "Barão B" had 2,7 and 4,4 times greater content of SA than plants infected with "Pera IAC" or "Galego 50" mild isolates, respectively. Using non-denaturing PAGE electrophoresis at an alkaline pH (pH 8.3) an additional band was detected only in plants infected with severe isolates. At acid pH (pH 4.5) it was possible to detect one band with syringaldazine-peroxidase activity only in plants infected with severe isolates. Separation of isoenzymes by HPLC showed an additional peak of guayacol activity (0.02 ?Abs /min) eluting at 16-17 minutes, which was absent in healthy or mild isolate-infected materiais. At 19.5-21 minutes eluted a peak of greater activity (0.09 ?Abs /min) that was common to infected and healthy materiais. Fluorescence microscopy of stem tips of 'Mexican' lime plants, infected with the severe isolate Barão B, showed depressions in the xylem, visualized using UV excitation light. With blue light excitation it was possible to visualize a yellow fluorescing material within the xylem depressions (Figs. 13 a and b). In healthy or mild isolate (Galego 50) materials, fluorescence alterations were not observed in the cambium zone. In 'Pera' orange plants infected with severe isolates (Barão B and Pera Rio) the accumulation of green-fluorescent material was observed in the cambium zone when UV excitation was used. It may be concluded that peroxidase activity associated with lignification can be considered as a significant parameter to differentiate severe from mild isolates of CTV. Severe isolates of CTV induce increases in enzyme activities involved in plant defense mechanisms, paralleling the increase of salicylic acid content, which functions as signaling molecule. Plants infected by severe isolates show disfunctional phloem and an altered cambium zone. They also show the appearance of a new band with peroxidasic activity that may arise from de novo synthesis (gene activation) or from activation of a pre-existing protein / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal

Resumo: O gênero Potyvirus é um dos maiores dentre os vírus de planta com genoma composto por RNA. O genoma dos potyvirus codifica um único polipeptídeo que é processado por três proteinases virais que originam todas as proteínas necessárias para complementar o ciclo da infecção. A proteína HC-Pro (Helper Component proteinase) é uma dessas proteínas multifuncionais que está envolvida na amplificação do genoma, transmissão por afídeo, movimento sistêmico e local, supressão do silenciamento gênico e proteólise. Nesse trabalho, foi realizada a substituição funcional de parte da região codificadora da HC-Pro do Lettuce mosaic virus (LMV) com a porção correspondente à HC-Pro do Potato virus Y (PVY), com o objetivo de melhor compreender os papéis dessa proteína no ciclo de infecção dos potyvirus. O LMV e o PVY diferem tanto em patogenicidade quanto em círculo de hospedeiros. O LMV infecta, principalmente, espécies da família Asteraceae (alface) enquanto o PVY infecta Solanaceae. Para avaliar o efeito de tal substituição na infectividade, dois vírus quiméricos foram construídos: um clone infeccioso de LMV contendo a HC-Pro selvagem do PVY (estendendo-se dos aminoácidos 1 a 352) e um segundo clone contendo a HC-Pro de PVY com mutação no motivo conservado IGN (mutado para RPN). Os vírus recombinantes e o LMV selvagem foram inoculados via biobalística em folhas de plântulas de alface cv. Trocadero (suscetível ao LMV). A presença e a natureza das progênies virais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The genus Potyvirus is one of the largest genera of plant RNA viruses. The potyvirus genome encodes a single polypeptide that is processed by three viral proteinases to yield all viral proteins needed for the infection cycle. One of these proteins is the multifunctional helper component proteinase (HC-Pro), which is involved in genome amplification, aphid transmission, local and systemic movement, suppression of gene silencing and proteolysis. To gain further understanding of the roles of this protein in the Potyvirus life cycle, the functional replacement of the HC-Pro coding region of Lettuce mosaic virus (LMV) with its corresponding counterpart of Potato virus Y (PVY) was performed. These viruses differ both in pathogenicity and in host range. LMV infects mainly Asteraceae while PVY infects Solanaceae. To assess the functional requirement of a homologous HC-Pro in infectivity, two different chimeric viruses were constructed i. e: a full-length LMV containing a wild type PVY HC-Pro (1aa to 352aa) and a full-length LMV containing a PVY HC-Pro with a mutation in the IGN motif (exchanged to RNP). The chimeras, and wild type LMV, were inoculated by biolistic in young lettuce plants. The presence and nature of viral progenies were checked by RT-PCR amplification followed by sequencing. All recombinant viruses were infectious and displayed systemic infection although the symptoms were weak when compared to the wild type LMV. The viruses accumulation were evaluated by differential cycles in the RT-PCR. The LMV wild type was amplified by 30 cycles while the chimerics viruses needed 40 cycles. Therefore this result indicating that the chimeric viruses titer were lower than LMV wild type. The results 4 described here demonstrated that the main biological functions of HC-Pro can be accomplished by heterologous protein. / Orientador: Marcelo Agenor Pavan / Coorientador: Ivan de Godoy Maia / Banca: Renate Krause Sakate / Banca: José Osmar Gaspar / Banca: João Roberto Spotti Lopes / Banca: Addolorata Colariccio / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-11-29Bitstream added on 2014-06-13T19:24:02Z : No. of bitstreams: 1 frangioni_dss_dr_botfca.pdf: 2302780 bytes, checksum: a3bab8cdfaa8a760d70900c13de09d8d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O gênero Potyvirus é um dos maiores dentre os vírus de planta com genoma composto por RNA. O genoma dos potyvirus codifica um único polipeptídeo que é processado por três proteinases virais que originam todas as proteínas necessárias para complementar o ciclo da infecção. A proteína HC-Pro (Helper Component proteinase) é uma dessas proteínas multifuncionais que está envolvida na amplificação do genoma, transmissão por afídeo, movimento sistêmico e local, supressão do silenciamento gênico e proteólise. Nesse trabalho, foi realizada a substituição funcional de parte da região codificadora da HC-Pro do Lettuce mosaic virus (LMV) com a porção correspondente à HC-Pro do Potato virus Y (PVY), com o objetivo de melhor compreender os papéis dessa proteína no ciclo de infecção dos potyvirus. O LMV e o PVY diferem tanto em patogenicidade quanto em círculo de hospedeiros. O LMV infecta, principalmente, espécies da família Asteraceae (alface) enquanto o PVY infecta Solanaceae. Para avaliar o efeito de tal substituição na infectividade, dois vírus quiméricos foram construídos: um clone infeccioso de LMV contendo a HC-Pro selvagem do PVY (estendendo-se dos aminoácidos 1 a 352) e um segundo clone contendo a HC-Pro de PVY com mutação no motivo conservado IGN (mutado para RPN). Os vírus recombinantes e o LMV selvagem foram inoculados via biobalística em folhas de plântulas de alface cv. Trocadero (suscetível ao LMV). A presença e a natureza das progênies virais... / The genus Potyvirus is one of the largest genera of plant RNA viruses. The potyvirus genome encodes a single polypeptide that is processed by three viral proteinases to yield all viral proteins needed for the infection cycle. One of these proteins is the multifunctional helper component proteinase (HC-Pro), which is involved in genome amplification, aphid transmission, local and systemic movement, suppression of gene silencing and proteolysis. To gain further understanding of the roles of this protein in the Potyvirus life cycle, the functional replacement of the HC-Pro coding region of Lettuce mosaic virus (LMV) with its corresponding counterpart of Potato virus Y (PVY) was performed. These viruses differ both in pathogenicity and in host range. LMV infects mainly Asteraceae while PVY infects Solanaceae. To assess the functional requirement of a homologous HC-Pro in infectivity, two different chimeric viruses were constructed i. e: a full-length LMV containing a wild type PVY HC-Pro (1aa to 352aa) and a full-length LMV containing a PVY HC-Pro with a mutation in the IGN motif (exchanged to RNP). The chimeras, and wild type LMV, were inoculated by biolistic in young lettuce plants. The presence and nature of viral progenies were checked by RT-PCR amplification followed by sequencing. All recombinant viruses were infectious and displayed systemic infection although the symptoms were weak when compared to the wild type LMV. The viruses accumulation were evaluated by differential cycles in the RT-PCR. The LMV wild type was amplified by 30 cycles while the chimerics viruses needed 40 cycles. Therefore this result indicating that the chimeric viruses titer were lower than LMV wild type. The results 4 described here demonstrated that the main biological functions of HC-Pro can be accomplished by heterologous protein.

Orientador:Jorge Vega / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T04:10:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Messias_Ueliton_D.pdf: 899792 bytes, checksum: c79dd05dd46e901a7add3fa66d7afc3f (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As plantas defendem-se continuamente contra ataques de bactérias, vírus, fungos, invertebrados e de outras plantas. O estresse oxidativo é um tipo de resposta fisiológica da planta após o reconhecimento do patógeno, podendo resultar em sintomas nas plantas dependendo da sensibilidade do hospedeiro, e também relacionada à mecanismos de defesa. Foram analisadas plantas de soja cultivares BRS132 (muito sensível) e IAC17 (pouco sensível) infectadas pelo Cowpea mild mottle virus (CPMMV) e plantas de feijoeiro cultivar BT2 infectado pelo Cowpea aphid-borne virus (CABMV). O trabalho teve como objetivos avaliar a concentração de peróxido de hidrogênio, analisar a resposta antioxidante das plantas à infecção viral quanto às variações na atividade da superóxido dismutase, catalase, ascorbato peroxidase, guaiacol peroxidase e siringaldazina peroxidase e verificar as localizações dos vírus e das peroxidases em diferentes tecidos das plantas. O CPMMV induziu uma doença aguda, com sintomas severos e culminando com a morte da planta de soja 'BRS132'. Na soja 'IAC17', o vírus induziu uma doença crônica com mosaico leve a partir da segunda folha trifoliolada. As concentrações de peróxido de hidrogênio e as atividades da catalase, ascorbato peroxidase, guaiacol peroxidase e siringaldazina peroxidase foram maiores nas plantas infectadas, tanto na soja 'BRS132' como na soja 'IAC17', em relação às plantas sadias. O CPMMV foi localizado nos tecidos do pecíolo e do caule, na soja 'BRS132' nas regiões periféricas e medula, e na soja 'IAC17' principalmente nas regiões periféricas. No feijoeiro cultivar BT2, o CABMV induziu resposta aguda na primeira folha foram maiores nas plantas infectadas, exceto a atividade da superóxido dismutase, que apresentou valores similares nas plantas infectadas e nas sadias. O CABMV foi localizado nas regiões periféricas e medula dos tecidos do pecíolo, e no caule a invasão foi limitada à região periférica. As peroxidases e a siringaldazina peroxidase foram localizadas nas mesmas regiões do pecíolo onde foram detectados o CPMMV e o CABMV. No feijoeiro 'BT2', a infecção viral induziu uma resposta semelhante à observada na soja 'BRS132', com algumas diferenças relacionadas ao fato de que neste caso, a infecção pelo CABMV não resultou na morte da planta de feijoeiro. Também se observou aumento expressivo de atividade da siringaldazina peroxidase no 7º dia após inoculação, diferente da soja 'BRS132' em que este aumento ocorreu mais tarde. A invasão generalizada dos vírus no pecíolo foi semelhante em feijoeiro 'BT2' e soja 'BRS132', principalmente nos dias em que começou a ocorrer abscisão dos folíolos. Já a invasão do caule foi generalizada em soja 'BRS132' e limitada à região periférica em feijoeiro. Possivelmente, o aumento precoce de atividade da siringaldazina peroxidase em feijoeiro, já no 7º dia após inoculação, limitou a invasão do vírus aos tecidos periféricos do caule. Isto explicaria o fato de o feijoeiro 'BT2' não sofrer morte da gema apical e da planta. trifoliolada, apresentando sintomas de mosaico, maior rugosidade, lesões necróticas nas nervuras e folíolos ''fechados''. Nesta cultivar, todos os parâmetros avaliados. / Abstract: Plants defend themselves from attacks of bacteria, fungi, viruses, invertebrate and other plants. Oxidative stress is a kind of physiological response of the plant related to defense mechanisms after recognition the pathogen, which may result in disease symptoms depending on host sensitivity. In this work, plants of two varieties of soybean infected by Cowpea Mild Mottle Virus (CPMMV), one highly sensitive (BRS132) and other with low sensitivity (IAC17) to the virus, were analyzed. Also, responses of bean plants (cv. Black Turtle 2, BT2) to Cowpea Aphid-Borne Mosaic Virus (CABMV) were examined. The parameters assessed included peroxide content (as hydrogen peroxide, H2O2), and activity of the following enzymes: superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, guayacol peroxidase and syringadazine peroxidase. Distribution of virus and peroxidases in different tissues was also examined. In soybean cv BRS132, CPPMV induced an acute disease with severe symptoms finally resulting in plant death. In the less sensitive soybean cv IAC17, CPMMV induced a chronic disease with mild mosaic which was only visible in the second trifoliate and later leaves. Peroxide content and activity of guayacol and syringaldazine peroxidases were higher in infected plants of both cultivars. The virus was immuno-localized in stem and petiole cross sections, appearing in peripheral tissues and pith in cv BRS132, whereas in cv IAC17 it was localized mainly in the peripheral portion. In bean cv BT2, CABMV induced a acute response in the first trifoliate leaf, which presented a rough mosaic, necrotic lesions in veins and a "wilted" aspect. In this species all the assessed parameters showed higher values in the infected plants. Only the activity of superoxide dismutase was similar in healthy and infected plants. The vírus was localized in the pith and peripheral tissues of bean petioles, and only in the peripheral region of stems. Peroxidase and syringaldazine peroxidase activities were localized in the same tissues of the petiole where the CPMMV was localized in soybean plants and CABMV in bean plants. The response to CABMV observed in bean cv BT2 was similar to the response of soybean BRS132 to CPMMV, with some differences, since in bean the virus infection did not induce plant death. A significant rise in syringadazine activity was detected seven days after inoculation (DAI) in beans, while in soybean this increase occurred one day later. Both species also showed similar pattern of invasion of petiole tissues by the virus, mainly at the moment of abscission of leaflets. However, the virus invasion of stem was generalized in soybean BRS132 and contrastingly, limited to the peripheral tissues in bean. One possibility is that the early increase in syringaldazine activity observed in bean 7 DAI is indicative of some type of restriction to the spread of the virus, limiting it to the stem peripheral tissues. Probably this restricted spread of the virus in the stem underlies the survival of the apical meristem in bean cv BT2 in contrast to the death of the meristem in soybean cv BRS132. / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal