Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4218.pdf: 11765337 bytes, checksum: cdae8703c8d7792c7037dde48c22c345 (MD5) Previous issue date: 2012-04-04 / Financiadora de Estudos e Projetos / Plant cell wall confers to the cell plant, structural support as well as protection against pathogens and phytophagous. Among the cell wall polysaccharides includes pectic substances, which are composed of partially methyl-esterified galacturonic acid residues linked by α-1,4 glycosidic bonds. These enzymes are often synthesized by phytophatogenic micro-organisms for invasion of host plant or by own plant for modeling plant cell wall. The pectic substances are the major component of middle lamella and are natural degraded by pectinases action. Pectin methylesterase (PME) catalysis removes methyl-ester groups, and the Endo-polygalacturonase (Endo-PG) promoves the randomly hydrolysis reaction of α-1,4 bonds. One of the most importante agricultural pest species of the family Curculionidae (Coleoptera: Curculionidae) is Sphenophorus levis, the sugarcane weevil. The larvae of this insect penetrate into the rhizome and build galleries in the stem, decreasing productivity and causing the death of the plant. Large damages to the crop like that are significant in the costs of products derived from sugarcane. Considering the impact of this pest in the sugarcane crop and the absence of efficient method for control, new strategies for controlling are still necessary. The analysis of the cDNA library of S. levis larvaes shows the presence of one PME and one Endo-PG genes that we called Sl-PME and Sl-EndoPG respectively. Considering the importance of studies of insect pests and the extensively use of theses pectinases in different industry fields, we performed the characterization of genomic sequences coding for S. levis pectinases (Sl-Pectinases). It was also carried out the production and characterization of a Sl-PME and a Sl-EndoPG recombinant, expressed in heterologous system. We also accomplished analysis of gene expression by qRTPCR in different stages of development as well as different tissues, and phylogenetic studies between Sl-Pectinases and other pectinases from different kingdoms. The Sl- Pectinases sequences identified, show more similar to homologous insect genes deposited in the GenBank, especially with Sitophilus oryzae. The phylogenetic analysis indicates that the insect group is more correlated with bacteria group and fungi group respectively to PMEs and EndoPGs sequences. Pectinases genomic sequences revealed two introns for Sl-EndoPG gene with 53 and 166 bp, but no one for Sl-PME gene. Both of Sl-Pectinases Recombinant showed catalytic activity. The recombinant Sl-EndoPG shows optimal activity at pH 5,06 ± 0,27 and 49,74 ± 2,49 oC, but extremely low thermostability. For the polygalacturonic acid no-methylated as substract, the enzyme revealed Km = 3,88 mg.mL-1, Vmax = 21.96 μM.s-1 e Kcat = 3.137 s-1; for the citrus pectin partially methylated as substract, the enzyme presented Km = 4,98 mg.mL-1, Vmax = 17,19 μM.s-1 e Kcat = 2.456 s-1. Results in expression analysis suggest that S. levis pectinases have a digestive enzymes role, actting on the midgut. The present work represents the first pectinases of insect produced in Pichia pastoris heterologous system and characterized as optimal conditions of activity, thermostability and kinetic parameters. / A parede celular vegetal confere à célula vegetal suporte estrutural, proteção contra patógenos e fitófagos. Dentre os polissacarídeos da parede celular vegetal são inclusas as substâncias pécticas, as quais são compostas por resíduos de ácido galacturônico, parcialmente esterificados, ligados em série via ligações glicosídicas α- 1,4. As substâncias pécticas são o maior componente da lamela média e são naturalmente degradadas pela ação enzimática das pectinases. A Pectina metilesterase (PME) catalisa a remoção dos grupos metil-ester, e a Endo- Poligalacturonase (Endo-PG) promove a reação de hidrólise aleatória das ligações α- 1,4. Essas enzimas são comumente sintetizadas por micro-organismos fitopatógenos para invasão ao hospedeiro ou pelas próprias plantas para modelamento da parede celular vegetal. Na agricultura, uma das mais importantes espécies pragas da família Curculionidae (Coleoptera: Curculionidae) é o Sphenophorus levis, o bicudo da canade- açúcar. As larvas deste inseto penetram no rizoma e constroem galerias ao longo do colmo, causando queda na produtividade ou até mesmo a morte da planta. Grandes danos na cultura como esses são significativos nos custos de produtos derivados da cana-de-açúcar. Considerando o impacto dessa praga na cultura e a ausência de eficientes métodos de controle, novas estratégias ainda são necessárias no combate à praga. A análise de uma biblioteca de cDNA de larvas do inseto S. levis mostrou a presença de genes codificantes para uma PME e uma Endo-PG, os quais nomeamos de Sl-PME e Sl-EndoPG respectivamente. Devido a importância nos estudos de insetos pragas e a extensa aplicação das pectinases em diversos campos industriais, foi promovida a caracterização das sequências genômicas codificantes para as pectinases de S. levis (Sl-Pectinases). Também foi realizada a produção e caracterização de uma Sl-PME e uma Sl-EndoPG recombinantes, expressas em sistema heterólogo. Além disso, foram conduzidas análises de expressão gênica por qRT-PCR em diferentes estágios de desenvolvimento e diferentes tecidos; e estudos filogenéticos entre as Sl-Pectinases e outras pectinases de diferentes reinos. As sequências das Sl-Pectinases identificadas apresentaram maior similaridade com genes homólogos de insetos depositados no GenBank, principalmente como o Sitophilus oryzae. A análise filogenética indicou que o grupo dos insetos é mais correlacionado com o grupo das bactérias e com o grupo de fungos, respectivamente para as sequências PMEs e Endo-PGs. As sequências genômicas das pectinases revelaram dois introns para Sl-EndoPG com 53 e 166 pb, mas nenhum para o gene Sl- PME. Ambas as Sl-Pectinases Recombinantes apresentaram atividade catalítica. A Sl- EndoPG recombinante mostrou maior atividade em pH 5,06 ± 0,27 e 49,74 ± 2,49 oC, mas baixa termoestabilidade. Para o substrato ácido poligalacturônico não metilado, a enzima revelou Km = 3,88 mg.mL-1, Vmax = 21.96 μM.s-1 e Kcat = 3.137 s-1, para o substrato pectina de citrus parcialmente metilada, a enzima apresentou Km = 4,98 mg.mL-1, Vmax = 17,19 μM.s-1 e Kcat = 2.456 s-1. Os resultados da análise de expressão sugerem que as pectinases de S. levis são enzimas digestivas atuantes no intestino médio. Este trabalho representa as primeiras pectinases de inseto produzidas em sistema heterólogo de Pichia pastoris e caracterizadas quanto a condições ótimas de atividade, termoestabilidade e parâmetros cinéticos.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dis Heleno Dias Ferreira - pre textuais.pdf: 666003 bytes, checksum: a67975494e3cb7ed970b88ad268aca1b (MD5) Previous issue date: 2010-04-29 / The genus Hyptis, with 280 species worldwide, belongs to the family Labiatae (Lamiaceae), subfamily Nepetoideae, tribe Ocimae, and subtribe Hyptidinae. The genus was divided in 27 sections, with 13 of them (Apodotes, Cephalohyptis, Cyanocephalanthus, Cyrta, Eriosphaeria, Gymneia, Induratae, Mesosphaeria, Polydesmia, Pusilae, Trichosphaeria, and Hylodontes) occur in the states of Goiás and Tocantins (Brazil). The collection of botanical material for morphological, taxonomical, anatomical, phytochemical studies, as well as geographical distribution and phylogenetic relationships, was realized with several field trips in the states of Goiás and Tocantins. For morphological studies, several loans of herbarium specimens of Hyptis were requested from Brazilian and international institutions. The genus Hyptis is mostly American, with Neotropical distribution, ranging from southern United States to Argentina. In South America, most species of Hyptis are associated with open areas, and occur from 300 m altitude in the valley of the Rio Araguaia, in Goiás, to 3300 m in the western slopes of the Peruvian Andes. In Goiás and Tocantins they can be found in several vegetation types: cerrado, rocky outcrops, margins of cow pastures, cultivated fields, wet fields, humid forests, and flooded areas with Mauritia palms. In these states they occur in a variety of soils: sandy, sandygravelly, with rocky outcrops, hydromorphic, and latossoils. Specie of the section Cyrta are exclusive of humid and flooded soils. The two main centers of diversity of Hyptis in Brazil are in the states of Minas Gerais and Goiás. Many herbarium specimens were analyzed and many species were studied and collected during field trips in Goiás and Tocantins. The geographic position of each collection was verified with the use of a GPS instrument. The specimens collected were deposited in the UFG Herbarium of the Federal University of Goiás. Thirty-two distribution maps of Hyptis in Goiás and Tocantins were elaborated from the specimens studied. A total of 89 species was catalogued, and 18 of them reported from Goiás and Tocantins were not found during the collecting trips. A key for the identification of the species was elaborated using morphological characters. A parsimony analysis using 35 morphological characters was realized, obtaining 1864 most parsimonious trees and a strict consensus tree. The parsimony analysis supports the monophyly of the sections Gymneya, Cyrta, Apodotes, and Cyanocephalus (except for the H. nitidula - H. peduncularis clade), and indicates that the sections Mesospheria, Xylodontes, Hyptis, Polydesmia, and Eriosphaeria are not monophyletic. Section Trichosphaeria is not well resolved. An anatomical study of 60 species, representing 11 sections of Hyptis, was undertaken. Some characters, as hypodermis, schlerenchimatic sheath extensions, trichomes, stomatal cripts, supply useful taxonomic for inferring phylogenetic relationships within the genus. For the analyses of chemical components, 29 species and two varieties of Hyptis were selected. With the chemical analises, 216 constituents of essential oils were identified, mostly monotherpenes and sesquiterpenes. Average percentage and pattern of each chemical component were calculated. The most common chemical components were arbitrarily selected, as present in nine or more species: sabinene (9 spp.), 1, alpha-tujene, alpha-cubebene, beta-selinene, and 14-hidroxy-(Z)-cariophyllene (10 spp.). alpha-muurolol and 8(13)-dien- 5beta-ol (11 spp.), mircene, cariophil-4 and germacrene B (12 spp.), gamma-cadinene, epialpha- caninol (13 spp.) and 14-hydroxy-9-epi-(E)-cariofilene (13 spp.), 1-epi-cubenol- and gamma-muurolene (14 spp.), humulene poxide II and bicyclogermacrene (16 spp.), betaelemene and alpha-cadinol (17 spp.), beta-pinene (18 spp.), limonene (19 spp.), espatulenol and germacrene D (24 spp.), alpha copaene and beta-bourbonene (25 spp.), delta-cadinene (26 spp.), alpha-humulene (27 spp.), cariofilene oxide and (E)-cariofilene (28 spp.). Two dendrograms were obtained with two multivariate analyses of chemical constituents, one with quantitative data and the other with qualitative data (presence/absence). Species of section Cyanocephalus were the only ones found in a consistent group in both dendrograms based on chemical constituents. The data obtained in the present study contribute important information for the taxonomy and phylogenetic relationships of the genus Hyptis and the subtribe Hyptidinae, and ultimately for the family Labiatae. / O gênero Hyptis, com 280 espécies, pertence à família Labiatae, subfamília Nepetoideae, tribo Ocimae e subtribo Hyptidinae. O gênero Hyptis foi dividido em 27 seções, sendo que 13 seções (Apodotes, Cephalohyptis, Cyanocephalus, Cyrta, Eriosphaeria, Pachyphyllae, Gymneia, Induratae, Mesosphaeria, Polydesmia, Pusilae, Trichosphaeria e Xylodontes) ocorrem em Goiás/Tocantins. Para coleta do material botânico, destinado aos estudos morfológicos, taxonômicos, anatômicos, fitoquímicos, distribuição geográficas e relações filogenéticas, foram realizadas excursões de campo em Goiás e algumas regiões do Tocantins.Para complementação dos dados morfológicos, foram solicitados exemplares de espécies de Hyptis dos diferentes herbários do Brasil e de outros países. O gênero Hyptis é essencialmente americano com distribuição na Região Neotropical, estendendo desde o sul dos Estados Unidos da América até a Argentina. As espécies de Hyptis estão associadas principalmente a áreas abertas. A altitude de ocorrência varia desde 300m, como no vale do Rio Araguaia em Goiás, até 3300m no oeste dos Andes do Peru. Habitat e solos em que ocorrem as espécies em Goiás/ Tocantins são variados. Podendo ser encontradas nos cerrados, campos rupestres, margens de lavouras, lotes baldios, brejos, campos úmidos e veredas. Podem ocorrer em solos arenosos, arenosopedregosos, solos com afloramento rochosos, latossolos e solos hidromórficos. As espécies da seção Cyrta são exclusivas de ambientes úmidos e pantanosos. Os dois principais centros de diversidade de Hyptis, no Brasil, são Minas Gerais e Goiás. Foram analisadas exsicatas de diversos herbários e indivíduos coletados de diferentes espécies nas excursões de campo em Goiás e Tocantins. Os espécimes coletados foram depositados no Herbário UFG, da Universidade Federal de Goiás. Foram elaborados 32 mapas de distribuição geográfica de Hyptis. A posição geográfica de cada espécime coletado no campo foi verificada com auxílio de GPS. Foram catalogadas 89 espécies, sendo que 18 espécies citadas para Goiás/Tocantins não foram coletadas nas excursões de campo. Baseado nos caracteres morfológicos foi elaborada uma chave de identificação das espécies. Desses caracteres foram selecionados 35 para análise de parcimônia, obtendo 1864 árvores igualmente parcimoniosas e a árvore consenso estrito. A análise de parcimônia suporta que as seções Gymneia, Pusillae, Apodotes e Cyanocephalus (exceto o clado formado por H. nitidula e H. peduncularis) são monofiléticas, enquanto que as seções Mesosphaeria, Xylodontes, Polydesmia e Eriosphaeria não são consideradas monofiléticas. Trichosphaeria é uma seção que não está bem resolvida. Foi realizado estudo anatômico de 60 espécies de Hyptis, distribuídas em 11 seções. Alguns caracteres como hipoderme, extensão de bainha parenquimática, tricomas, criptas estomáticas são úteis para a taxonomia e para inferir relações filogenéticas dentro do gênero. Para análise dos componentes químicos, dos óleos esssenciais foram selecionados 29 espécies e duas variedades de Hyptis. Através de análise química foram identificados 216 componente dos óleos essenciais, principalmente monoterpenos e sesquiterpenos. Foram feitos os cálculos das médias percentuais e desvios padrões de cada componente químico. Arbitrariamente foram considerados os componentes químicos mais comuns aqueles presentes em nove ou mais espécies: sabineno (9 spp), 1, α-tujeno, α-cubebeno (9 spp), β-selineno e 14-hidroxi-(Z)- cariofileno (10 spp), α-muurulol e 8(13)-dien-5 β-ol (11 spp), mircenno, cariofila-4 e germacreno β (12 spp), γ-cadineno, epi- α-cadinol e 14-hidroxi-9-epi-(E)-cariofileno (13 spp), 1-epi-cubenol e γ-muuroleno (14 spp), póxido de hemuleno II e biciclogermacreno (16 spp), β- elemeno e α-cadinol (17 spp), β-pineno (18 spp), limoneno (19 spp), espatulenol e germacreno D (24 spp), α-copaeno e β-bourboneno (25 spp), δ-cadineno (26 spp), α-humuleno (27 spp),óxido de cariofileno e (E)-cariofileno (28 spp). Atravé de análise multivariada dos constituintes químicos foram elaborados dois dendrogramas, um baseado em dados quantitativos e outro em dados qualitativos (presença/ausência). As espécies da seção Cyanocephalus foram as únicas que formaram grupos muito afim, em ambos os dendrogramas, baseados nos constituintes químicos. Os dados obtidos, no presente trabalho, contribuirá para a taxonomia, anatomia, distribuição geográfica e relações filogenéticas do gênero Hyptis e da subtribo Hyptidinae, bem como para melhor conhecimento da família Labiatae.