Tese de doutoramento. Engenharia Mecânica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Instituto Superior de Engenharia do Porto. 2009

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-22Bitstream added on 2014-06-13T18:55:38Z : No. of bitstreams: 1 milanese_ac_me_guara.pdf: 2514140 bytes, checksum: 9589c032265999cf58a6e043fe217bae (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A madeira foi o material mais empregado em estruturas, sendo amplamente encontrada em edificações históricas. Esse material sofre constantemente com a atuação de agentes físicos, químicos e biológicos que comprometem sua durabilidade, por isso muitas vezes, as peças estruturais acabam sendo restauradas e reforçadas com materiais que apresentam alta densidade, baixa resistência às altas temperaturas, no caso de incêndios, e susceptibilidade às intempéries, tornando complexo seu trabalho de recuperação. Diante do exposto, esta pesquisa se propôs a desenvolver compósitos poliméricos reforçados por fibras naturais e vidro para uso como material de reforço nas ligações de estruturas em madeira e a estudar o comportamento destes materiais. São apresentados os estudos e as caracterizações dos materiais empregados nos compósitos, tais como, síntese das resinas, cinética química de cura, análise térmica por meio das técnicas de termogravimetria (TG) e calorimetria exploratória diferencial (DSC), difração dos raios X, resistências à tração e à flexão e análise fractográfica com o auxílio do microscópio eletrônico de varredura (MEV). Em seqüência, o trabalho apresenta o processamento e as caracterizações térmica, física e mecânica de quatro placas laminadas formadas pelas matrizes, poliuretana à base de óleo de mamona e fenólica, reforçadas com fibras de vidro e sisal. Os laminados compostos por uma camada de tecido são ensaiados em tração e flexão, TG e por difração dos raios X. As análises termogravimétricas indicaram que os laminados podem ser utilizados em ambientes, onde a temperatura local não exceda 175ºC. Os dados de tração mostraram baixos valores para as resinas poliuretana e fenólica, 2,5 MPa e 4,9 MPa, respectivamente. Porém, uma vez reforçadas com fibras de sisal e de vidro foi observado... / Wood was the material used in higher amount to structures application and nowadays is noticed in historic buildings. This material is susceptible to the physical, chemical and biological degradations, which influence the usefulness and consequently the structures should be restored using high density material with low temperature resistance characteristic, environmental suitable make complex the restore process. This work proposes processing polymeric composites and studies the behavior of those materials which will be applied as reinforcement connection into wood structures. Characterizations of base materials as cure kinetic studies, thermal analysis by thermogravimetric and differential scanning calorimetric, X-ray diffraction, tensile tests and scanning electron microcopies are conducted. It will also present the thermal, physical and mechanical characterization of four composites laminates: PU resin based on castor oil reinforced by glass and sisal fibers and phenolic reinforced by glass and sisal fibers. Composites laminates produced by one fabric layers are tested in tensile and flexural modes, by thermogravimetric and X-ray diffraction. Thermogravimetric analyses show that the laminates can be used in environments, which the place temperature does not exceed 175ºC. Tensile tests results show low values to polyurethane and phenolic resins, 2.5 MPa and 4.9 MPa, respectively. However, it was observed that the presence of fibers in the laminates show an increase of tensile strength when compared to matrixes. Tensile strength values were 17 MPa, 95 MPa, 25 MPa and 205 MPa for polyurethane/sisal, polyurethane/glass, phenolic/sisal and phenolic/glass fibers laminates, respectively. Flexural strength presents values about 0.45 MPa, 8.6 MPa, 3.7 MPa, 14 MPa, 11 MPa and 21.8 MPa for polyurethane and phenolic resins and polyurethane/sisal, polyurethane/glass, phenolic/sisal and phenolic/glass laminates, respectively.

A Colômbia tem uma das maiores reservas de carvão do mundo, sendo o quinto exportador mundial do carvão de tipo térmico. Nos processos de extração de carvão a céu aberto uma grande quantidade de partículas de pó e metais pesados são liberados à atmosfera, onde podem formar misturas complexas, constituindo um risco significativo para a saúde dos trabalhadores ocupacionalmente expostos. Além disso, nas minas a céu aberto, o carvão extraído é armazenado na presença de luz solar, gerando incêndios espontâneos que constituem uma importante fonte de emissão de Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs) depois de sua combustão incompleta. O objetivo do presente estudo foi avaliar se polimorfismos nos genes do metabolismo de xenobióticos CYP1A1Msp1, GSTM1nulo, GSTT1nulo e de reparação do DNA XRCC1194Trp e OGG1326Cys podem modificar a suscetibilidade individual aos efeitos adversos causados pela exposição aos resíduos de mineração de carvão, considerando a formação de Micronúcleos (MN) e alguns parâmetros do Ensaio Cometa (Índice de Dano - DI, Frequência de dano - DF e porcentagem de DNA na cauda - Tail % DNA) como biomarcadores de mutagenicidade e genotoxicidade. A população de estudo foi formada por 100 trabalhadores de mineração de carvão a céu aberto ocupacionalmente expostos a resíduos de mineração e 100 controles não expostos. O estudo foi realizado na área mineira de “El Cerrejón”, a maior mina de carvão a céu aberto do mundo, localizada em Guajira, ao Norte da Colômbia. As análises dos valores do Ensaio Cometa demonstraram um incremento significativo no DI, DF e porcentagem de DNA na cauda (Tail % DNA) (p < 0,001) no grupo exposto, comparado com o grupo controle. Também houve um aumento significativo na frequência de MN em trabalhadores expostos, representado por um risco relativo (RR) de quase o triplo (2,88, 95% CI 2,525 – 3,284, p < 0,001) para a população exposta, representando um elevado risco de câncer em relação aos controles correspondentes. Apesar destes, os resultados demonstraram que os polimorfismos nos genes do metabolismo (CYP1A1Msp1, GSTM1nulo, GSTT1nulo) e nos genes de reparação do DNA (XRCC1194Trp e OGG1326Cys) não tiveram nenhum impacto sobre as frequências de MN em linfócitos periféricos dos trabalhadores expostos. Da mesma forma, polimorfismos em genes de metabolismo de xenobióticos (GSTM1nulo, GSTT1nulo e CYP1A1Msp1) não influenciaram os níveis de dano no DNA detectados pelo Ensaio cometa. O genótipo XRCC1194Trp/- apresentou uma tendência de proteção em indivíduos expostos, evidenciada em uma diminuição na frequência de MN, embora não tenha sido significante. A nosso conhecimento, este estudo fornece os primeiros dados para a Colômbia sobre o risco genotóxico associado à exposição os resíduos de mineração de carvão a céu aberto e contribui para estabelecer um mapa geral das frequências genotípicas representativas em populações Latino-Americanas, as quais apresentam uma alta complexidade devido ao elevado grau de mistura étnica. / Colombia has one of the world's largest coal reserves being the fifth biggest thermal coal exporter world-wide. In open-cast coal mining extraction, large amounts of dust particles and heavy metals are released into the atmosphere, where they can form complex mixtures, representing a significant health risks to occupationally exposed workers. In addition, in open-cast mines, extracted coal is stored under sunlight, causing spontaneous fires, being an important source of Polycyclic Hydrocarbons Aromatic (PHAs) emission after incomplete combustion. The aim of our study was to evaluate if polymorphisms in metabolisms genes CYP1A1Msp1, GSTM1null, GSTT1null and DNA repair XRCC1194Trp and OGG1326Cys could modify individual susceptibility to adverse coal exposure effects caused by the exposition to coal mining residues considering the Micronucleus formation (MN) and Comet Assay parameters (Damage Index (DI), Damage Frequency (DF) and Tail % DNA) as endpoint s for mutagenicity and genotoxicity. The study population comprised 100 open-cast coal mining workers occupationally exposed to coal residues and 100 non-exposed controls. The study was conducted in the coal mining area of “El Cerrejón”, the world’s largest open-cast coal mine, located in Guajira North Colombia. The analysis of Comet assay values indicated a significant increase in the DI, DF and Tail % DNA (p < 0.001) in the exposed group in comparison to the non-exposed control group. There was also a significant MN frequency increase in exposed workers, represented by a relative risk (RR) of almost the triple (2.88, 95% CI 2.525 – 3.284, p < 0.001) for the exposed population, representing a higher risk in relation to the matched non-exposed control. Despite of this, the results show that polymorphisms in the metabolism genes (CYP1A1Msp1,, GSTM1null, GSTT1null) and DNA repair genes (XRCC1194Trp and OGG1326Cys) had no impact on MN frequencies in peripheral lymphocytes of exposed workers. Similarly, polymorphisms in metabolism genes (CYP1A1Msp1,, GSTM1null, GSTT1null) did not influence levels of DNA damage detected by comet assay. XIV The XRCC1194Trp/- genotype shows a protective effect evidenced by a decreased MN frequency in exposed individuals, although with no statistics significance. To our knowledge, this study provides the first data in the country on a genotoxic hazard associated to exposure to coal residues by mining activities and contributes to establishing a general map of representative genotype frequencies in the Latin-American population, which is quite complex given the high degree of ethnic admixture and stratification.

A Colômbia tem uma das maiores reservas de carvão do mundo, sendo o quinto exportador mundial do carvão de tipo térmico. Nos processos de extração de carvão a céu aberto uma grande quantidade de partículas de pó e metais pesados são liberados à atmosfera, onde podem formar misturas complexas, constituindo um risco significativo para a saúde dos trabalhadores ocupacionalmente expostos. Além disso, nas minas a céu aberto, o carvão extraído é armazenado na presença de luz solar, gerando incêndios espontâneos que constituem uma importante fonte de emissão de Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs) depois de sua combustão incompleta. O objetivo do presente estudo foi avaliar se polimorfismos nos genes do metabolismo de xenobióticos CYP1A1Msp1, GSTM1nulo, GSTT1nulo e de reparação do DNA XRCC1194Trp e OGG1326Cys podem modificar a suscetibilidade individual aos efeitos adversos causados pela exposição aos resíduos de mineração de carvão, considerando a formação de Micronúcleos (MN) e alguns parâmetros do Ensaio Cometa (Índice de Dano - DI, Frequência de dano - DF e porcentagem de DNA na cauda - Tail % DNA) como biomarcadores de mutagenicidade e genotoxicidade. A população de estudo foi formada por 100 trabalhadores de mineração de carvão a céu aberto ocupacionalmente expostos a resíduos de mineração e 100 controles não expostos. O estudo foi realizado na área mineira de “El Cerrejón”, a maior mina de carvão a céu aberto do mundo, localizada em Guajira, ao Norte da Colômbia. As análises dos valores do Ensaio Cometa demonstraram um incremento significativo no DI, DF e porcentagem de DNA na cauda (Tail % DNA) (p < 0,001) no grupo exposto, comparado com o grupo controle. Também houve um aumento significativo na frequência de MN em trabalhadores expostos, representado por um risco relativo (RR) de quase o triplo (2,88, 95% CI 2,525 – 3,284, p < 0,001) para a população exposta, representando um elevado risco de câncer em relação aos controles correspondentes. Apesar destes, os resultados demonstraram que os polimorfismos nos genes do metabolismo (CYP1A1Msp1, GSTM1nulo, GSTT1nulo) e nos genes de reparação do DNA (XRCC1194Trp e OGG1326Cys) não tiveram nenhum impacto sobre as frequências de MN em linfócitos periféricos dos trabalhadores expostos. Da mesma forma, polimorfismos em genes de metabolismo de xenobióticos (GSTM1nulo, GSTT1nulo e CYP1A1Msp1) não influenciaram os níveis de dano no DNA detectados pelo Ensaio cometa. O genótipo XRCC1194Trp/- apresentou uma tendência de proteção em indivíduos expostos, evidenciada em uma diminuição na frequência de MN, embora não tenha sido significante. A nosso conhecimento, este estudo fornece os primeiros dados para a Colômbia sobre o risco genotóxico associado à exposição os resíduos de mineração de carvão a céu aberto e contribui para estabelecer um mapa geral das frequências genotípicas representativas em populações Latino-Americanas, as quais apresentam uma alta complexidade devido ao elevado grau de mistura étnica. / Colombia has one of the world's largest coal reserves being the fifth biggest thermal coal exporter world-wide. In open-cast coal mining extraction, large amounts of dust particles and heavy metals are released into the atmosphere, where they can form complex mixtures, representing a significant health risks to occupationally exposed workers. In addition, in open-cast mines, extracted coal is stored under sunlight, causing spontaneous fires, being an important source of Polycyclic Hydrocarbons Aromatic (PHAs) emission after incomplete combustion. The aim of our study was to evaluate if polymorphisms in metabolisms genes CYP1A1Msp1, GSTM1null, GSTT1null and DNA repair XRCC1194Trp and OGG1326Cys could modify individual susceptibility to adverse coal exposure effects caused by the exposition to coal mining residues considering the Micronucleus formation (MN) and Comet Assay parameters (Damage Index (DI), Damage Frequency (DF) and Tail % DNA) as endpoint s for mutagenicity and genotoxicity. The study population comprised 100 open-cast coal mining workers occupationally exposed to coal residues and 100 non-exposed controls. The study was conducted in the coal mining area of “El Cerrejón”, the world’s largest open-cast coal mine, located in Guajira North Colombia. The analysis of Comet assay values indicated a significant increase in the DI, DF and Tail % DNA (p < 0.001) in the exposed group in comparison to the non-exposed control group. There was also a significant MN frequency increase in exposed workers, represented by a relative risk (RR) of almost the triple (2.88, 95% CI 2.525 – 3.284, p < 0.001) for the exposed population, representing a higher risk in relation to the matched non-exposed control. Despite of this, the results show that polymorphisms in the metabolism genes (CYP1A1Msp1,, GSTM1null, GSTT1null) and DNA repair genes (XRCC1194Trp and OGG1326Cys) had no impact on MN frequencies in peripheral lymphocytes of exposed workers. Similarly, polymorphisms in metabolism genes (CYP1A1Msp1,, GSTM1null, GSTT1null) did not influence levels of DNA damage detected by comet assay. XIV The XRCC1194Trp/- genotype shows a protective effect evidenced by a decreased MN frequency in exposed individuals, although with no statistics significance. To our knowledge, this study provides the first data in the country on a genotoxic hazard associated to exposure to coal residues by mining activities and contributes to establishing a general map of representative genotype frequencies in the Latin-American population, which is quite complex given the high degree of ethnic admixture and stratification.

As células-tronco mesenquimais (MSC) foram originalmente isoladas da medula óssea, mas populações semelhantes foram isoladas do tecido adiposo e outros tecidos. A diferenciação das células-tronco derivadas do tecido adiposo (do inglês adipose derived stem cells; ADAS) para células neurais foram realizadas por vários grupos. Um aspecto muito importante relacionado com as células-tronco é a manutenção da integridade genômica durante o processo de diferenciação. Acredita-se que a manutenção da estabilidade genética por meio dos mecanismos de reparação do DNA devem ser particularmente rigorosos em células-tronco adultas, onde qualquer alteração genética pode comprometer a estabilidade genética e a funcionalidade destas células. O objetivo deste estudo foi observar a viabilidade e a integridade genética das células ADAS tratadas com o meio de indução neural, por meio do teste cometa, teste de micronúcleo e teste de viabilidade celular. Além disso, foi analisada a expressão de algumas proteínas relacionadas com a sinalização de danos no DNA, remodelagem de cromatina e proliferação. Os resultados obtidos no presente estudo claramente indicaram que o meio de indução neural pode ser genotóxico para as ADAS. O teste cometa revelou que a indução neural aumenta o índice e a freqüência de danos no DNA. A indução de micronúcleos não foi observada nas mesmas condições, indicando que o meio de indução neural não causa danos clastogênicos. Ao considerar a expressão de MCM3, TIP60, telomerase e a variação na expressão de marcadores neurais, o método de indução neural usada in vitro pode encaminhar a célula a uma transformação tumoral. Estes resultados alertam para a importância dos estudos relacionados com aos protocolos atualmente usados na diferenciação in vitro de células-tronco para fins terapêuticos. / Mesenchymal stem cells (MSC) were originally isolated from the bone marrow, although similar populations have been isolated from adipose and other tissues. The differentiation of ADAS (adipose derived stem cells) to neuronal cells has been accomplished by several groups. One important aspect related to stem cells is the maintenance of genomic integrity during the differentiation process. In this sense, the maintenance of genomic stability by DNA repair mechanisms in adult stem cells should be particularly stringent, where any genetic alteration can compromise the genomic stability and functionality of cell. Thus, the aim of this study was to observe the viability and integrity of ADAS cells treated with neural induction medium by using the comet, micronucleus, and cell viability assays. Moreover, the expression of some proteins and genes related to DNA damage signalling, chromatin remodeling, and cell proliferation was analyzed. The data obtained from the present study clearly indicate that the neuronal medium can be genotoxic to ADAS cells. Our results reveal that neuronal induction increases the damage frequency and damage index observed by comet assay. The induction of micronuclei was not observed for the same assay conditions, indicating that the neuronal induction medium does not cause chromosome loss and breakage. Considering the expression of MCM3, TIP60, telomerase and neuronal marker, it can be speculated that the neural induction conditions used in this work can drives ADAS cells to tumor transformation. These results call for the necessity of new studies related to in vitro stem cell differentiation protocols for therapeutical purposes.

COLARES, Regina Cláudia Ramos. Estudo comparativo da resistência de união entre resina composta e cerâmica submetida a diferentes tratamentos de superfície. 2010. 38 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-15T16:36:32Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_rcrcolares.pdf: 225991 bytes, checksum: c50aeb837c0cf715f48aa62c30bdc9d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-02T14:41:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_rcrcolares.pdf: 225991 bytes, checksum: c50aeb837c0cf715f48aa62c30bdc9d7 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-02T14:41:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_rcrcolares.pdf: 225991 bytes, checksum: c50aeb837c0cf715f48aa62c30bdc9d7 (MD5) Previous issue date: 2010 / The intraoral repair of ceramic restorations consisted of a clinically effective method for solving fracture of porcelain, and its success depends on quality and durability of the bond between the ceramic and the resin. The purpose of this study was to evaluate the bond strength between lithium disilicate-based ceramic and composite resin when subjected to airborne-particule abrasion with 50 μm aluminum oxide or hydrofluoric acid treatment using two silanization protocols: drying at room temperature or by heating. Twenty blocks (7×7×5mm) of lithium disilicate-based hot-pressed ceramic were fabricated and randomly divided into four groups (n = 5): G1- etched with 9.5% hydrofluoric acid for 20 seconds silanated surface were dried with room-temperature air; G2- treatment performed the same way as G1 employing the drying of the silane surface was 45± 5˚C warm air; G3- airborne-particle abrasion with 50-μm aluminum oxide for 5 seconds and silanated surface was dried 45± 5˚C warm air; G4-treatment performed in the same way that G3 employing drying of silane at room temperature. After an adhesive (Single Bond 2) was applied and before adding 5 mm layers of a composite resin (Filtek Z250), obtaining a block of 10 mm in height. Each blocks ceramic / resin were stored in 37˚C distilled-water for 24 h and cut into ceramic-composite beams with 1mm2 of cross-sectional area for immediately tested by microtensile bond strenght test at a speed of 1 mm / min. Data were analyzed by ANOVA and Student-Newman Keuls (p <0.05). The mean (standard deviation) in MPa were: G1 - 32.14 (7.98), G2 - 35 (7.77) and G3 - 18.36 (6.17). Group 4 can not be assessed because there was a detachment of the resin during the procedure for obtaining specimens. G1 and G2 presented greater tensile strenght than G3 (p<0.05). There was no statistically significant difference between the mean values for groups G1 and G2 (p> 0.05). It was concluded that silane drying by a stream of warm air had an important role in the surface treatment of ceramic with air abrasion. / O reparo intraoral de restaurações cerâmicas constitui-se de um método clinicamente efetivo para a resolução de fraturas de porcelana, e seu sucesso clínico depende da qualidade e durabilidade de união entre a resina composta e a superfície da cerâmica. O presente estudo teve como objetivo avaliar a resistência de união entre a cerâmica reforçada com dissilicato de lítio à resina composta quando submetida ao jateamento com óxido de alumínio 50 μm ou ao condicionamento com ácido fluorídrico a 9,5%, empregando-se dois protocolos de silanização: secagem à temperatura ambiente ou mediante o aquecimento. Um total de 20 blocos de cerâmica medindo-se (7x7x5mm) foram aleatoriamente dividos em 4 grupos (n=5): G1- condicionamento da superfície da porcelana com o ácido fluorídrico a 9,5% por 20 segundos com secagem do silano à temperatura ambiente; G2- tratamento realizado da mesma forma que G1 empregando-se a secagem do silano com um jato de ar aquecido a 45±5˚C; G3- jateamento com partículas de óxido de alumínio de 50 μm por 5 segundos e secagem do silano com um jato de ar aquecido e G4- tratamento realizado da mesma forma que G3 empregando-se a secagem à temperatura ambiente. Após a realização dos tratamentos, aplicou-se adesivo (Single Bond 2) e cinco camadas de 1,5 mm de resina composta (Filtek Z250), obtendo-se um bloco de 10 mm de altura. Os blocos cerâmica/resina foram armazenados em água destilada a 37° C por 24 h. Em seguida, foram feitos cortes seriados perpendiculares entre si para a obtenção de espécimes em forma de palito com área da secção transversal de 1mm2 que foram imediatamente testados através de ensaio de microtração à velocidade de 1 mm/min. Os dados foram analisados por ANOVA e teste de Student-Newman Keuls (p <0,05). As médias (desvio-padrão) foram em MPa: G1 - 32,14 (7,98); G2 – 35 (7,77) e G3 – 18,36 (6,17). O Grupo 4 não pode ser avaliado pois houve o desprendimento da resina composta durante o procedimento de obtenção dos espécimes. G1 e G2 apresentaram maiores valores de resistência à tração em relação ao G3 (p<0.05). Não houve diferença estatística significante entre os Grupos 1 e 2 (p> 0.05). Concluiu-se que o aquecimento do silano teve importante papel no tratamento de superfície da cerâmica jateada com óxido de alumínio.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.

As células-tronco mesenquimais (MSC) foram originalmente isoladas da medula óssea, mas populações semelhantes foram isoladas do tecido adiposo e outros tecidos. A diferenciação das células-tronco derivadas do tecido adiposo (do inglês adipose derived stem cells; ADAS) para células neurais foram realizadas por vários grupos. Um aspecto muito importante relacionado com as células-tronco é a manutenção da integridade genômica durante o processo de diferenciação. Acredita-se que a manutenção da estabilidade genética por meio dos mecanismos de reparação do DNA devem ser particularmente rigorosos em células-tronco adultas, onde qualquer alteração genética pode comprometer a estabilidade genética e a funcionalidade destas células. O objetivo deste estudo foi observar a viabilidade e a integridade genética das células ADAS tratadas com o meio de indução neural, por meio do teste cometa, teste de micronúcleo e teste de viabilidade celular. Além disso, foi analisada a expressão de algumas proteínas relacionadas com a sinalização de danos no DNA, remodelagem de cromatina e proliferação. Os resultados obtidos no presente estudo claramente indicaram que o meio de indução neural pode ser genotóxico para as ADAS. O teste cometa revelou que a indução neural aumenta o índice e a freqüência de danos no DNA. A indução de micronúcleos não foi observada nas mesmas condições, indicando que o meio de indução neural não causa danos clastogênicos. Ao considerar a expressão de MCM3, TIP60, telomerase e a variação na expressão de marcadores neurais, o método de indução neural usada in vitro pode encaminhar a célula a uma transformação tumoral. Estes resultados alertam para a importância dos estudos relacionados com aos protocolos atualmente usados na diferenciação in vitro de células-tronco para fins terapêuticos. / Mesenchymal stem cells (MSC) were originally isolated from the bone marrow, although similar populations have been isolated from adipose and other tissues. The differentiation of ADAS (adipose derived stem cells) to neuronal cells has been accomplished by several groups. One important aspect related to stem cells is the maintenance of genomic integrity during the differentiation process. In this sense, the maintenance of genomic stability by DNA repair mechanisms in adult stem cells should be particularly stringent, where any genetic alteration can compromise the genomic stability and functionality of cell. Thus, the aim of this study was to observe the viability and integrity of ADAS cells treated with neural induction medium by using the comet, micronucleus, and cell viability assays. Moreover, the expression of some proteins and genes related to DNA damage signalling, chromatin remodeling, and cell proliferation was analyzed. The data obtained from the present study clearly indicate that the neuronal medium can be genotoxic to ADAS cells. Our results reveal that neuronal induction increases the damage frequency and damage index observed by comet assay. The induction of micronuclei was not observed for the same assay conditions, indicating that the neuronal induction medium does not cause chromosome loss and breakage. Considering the expression of MCM3, TIP60, telomerase and neuronal marker, it can be speculated that the neural induction conditions used in this work can drives ADAS cells to tumor transformation. These results call for the necessity of new studies related to in vitro stem cell differentiation protocols for therapeutical purposes.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.

Interstrand DNA crosslinks (ICLs) são importantes lesões genotóxicas que podem causar morte celular se não for devidamente reparadas. Diversas drogas antitumorais atuam através da indução de ICLs no DNA, e a resistência a essas drogas está muitas vezes relacionada à maior capacidade de células tumorais para reparar tais lesões. As ICLs são lesões complexas que requerem o envolvimento de diferentes vias de reparação, tais como BER NER, TLS e vias de reparação de DSBs (RH e NHEJ). Além disso, foi demonstrado que Pso2p desempenha um papel importante na reparação de ICLs. Muitos estudos também apontam para as alterações epigenéticas como essenciais para a sobrevivência da célula em resposta ao dano genotóxico, através da indução de checkpoints de ciclo celular e da modulação da eficiência (e, possivelmente, da escolha) das vias de reparação de DNA. Assim, a primeira parte desta Tese apresenta uma revisão dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade dos ICLs induzidos pela furocumarina bifuncional 8-metoxipsoraleno (8-MOP) em Saccharomyces cerevisiae. A abordagem adotada discute a ação integrada de proteínas que atuam em vias de reparação de DNA envolvidas na remoção de ICLs, em combinação com fatores envolvidos no remodelamento da cromatina dependente de ATP. A fim de investigar o papel do remodelamento da cromatina em resposta a danos ao DNA induzidos pelo tratamento com furocumarinas mono e bifuncionais fotoativadas e ditelureto de difenila (DTDF), foram utilizadas linhagens de S. cerevisiae deficientes em diferentes proteínas relacionadas com a reparação do DNA e o remodelamento da cromatina. DTDF é um composto organotelurado proposto como um protótipo potencial para o desenvolvimento de novas drogas antitumorais. A sensibilidade do mutante pso2Δ ao DTDF, semelhante à observada para o 8-MOP, indica que este composto pode induzir lesões capazes de bloquear a replicação do DNA, tais como ligações cruzadas ou DSBs hairpin capped. Os resultados obtidos mostraram que os duplos mutantes pso2Δswr1Δ e rad52Δswr1Δ não são mais sensíveis aos agentes testados, DTDF, 3-CPS e 8-MOP, do que o mais sensível dos simples mutantes (pso2Δ e rad52Δ, respectivamente). Tendo em mente que Rad52p e Pso2p não têm interação epistática (aditiva ou sinergística) na reparação das lesões fotoinduzidas por 3-CPS e 8-MOP, sugere-se que Pso2p pode fornecer substrato para vias de reparação diferentes de HR, que poderiam ser NHEJ canônica e/ou MMEJ. O fato de que swr1Δ (deficiente em NHEJ) não aumenta a sensibilidade dos duplos mutantes, além da baixa sensibilidade observada para o mutante yku80Δ ao DTDF e à fotoadição de psoralenos, sugere que as lesões induzidas podem ser direcionadas para as vias HR ou MMEJ, ao invéz de NHEJ canônica. O envolvimento da via MMEJ sujeita a erros na reparação de lesões induzidas por DTDF pode explicar a indução de mutação frameshift, observada para este agente. Além disso, investigou-se a citotoxicidade induzida pelas drogas antitumorais cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) e sua combinação, em S. cerevisiae. Os resultados obtidos com os mutantes de reparação do DNA mostraram que a sensibilidade à CDDP + 5-FU parece refletir a sensibilidade de linhagens específicas a cada droga utilizada individualmente. Este resultado sugere que o efeito intensificado do tratamento combinado na terapia do câncer pode ser devido à ação de cada agente isoladamente, conforme observado em clones diferentes da população heterogênea de células transformadas. Os resultados referentes aos mutantes em remodelamento da cromatina demonstraram que o tratamento com CDDP + 5-FU provoca uma resposta mais eficaz na indução de morte celular, nos mutantes deficientes em CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ e hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, e hst3Δ), HML (dot1Δ) e HMT (erg6Δ), enquanto CDDP induz sensibilidade em mutantes HAT, além do mutante de HDAC hos3Δ, e o tratamento com 5-FU induz sensibilidade em HAT (gcn5Δ) e HDAC (sin3Δ e hos3Δ). Esses resultados apontam para o envolvimento de proteínas de remodelamento da cromatina como importantes alvos terapêuticos em resposta a agentes genotóxicos. Portanto, os resultados obtidos podem abrir novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta ao tratamento com CDDP + 5-FU, bem como auxiliar na escolha dos melhores protocolos terapêuticos. / Interstrand DNA crosslinks (ICLs) are important genotoxic lesions that can cause cell death if not properly repaired. Several antitumoral drugs act by inducing ICLs in DNA, and the resistance to these drugs is often related to an increased capacity of tumor cells to repair such lesions. The ICLs are complex lesions requiring involvement of different pathways for repair, such as BER, NER, TLS and DSB repair pathways (HR and NHEJ). In addition, Pso2p was shown to play an important role in ICLs repair. Many studies also point to the epigenetic changes as essential for cell survival in response to genotoxic damage, through induction of cell cycle checkpoints and modulating the efficiency (and possibly, the choice) of the DNA repair pathways. So, the first part of this Thesis gives a review of the mechanisms involved in the cytotoxicity of the ICLs induced by the bifunctional furocumarin 8-methoxypsoralen (8-MOP) in Saccharomyces cerevisiae. The adopted approach discusses the integrated action of proteins that work in the DNA repair pathways involved in ICLs removing in combination with factors involved in ATP-dependent chromatin remodeling. In order to investigate the role of the chromatin remodeling in response to DNA damage induced by treatment with mono- and bifunctional photoactivated furocumarins and diphenyl ditelluride (DPDT), we used S. cerevisiae strains deficient in different proteins related to DNA repair and chromatin remodeling. DPDT is organotellurium compound proposed as a potential prototype for development of new antitumoral drugs. The sensitivity of pso2Δ to DPDT, similar to that observed for 8-MOP, indicates that this compound could induce lesions able to block DNA replication, such as crosslinks or hairpin-capped DSBs. The obtained results showed that the double mutants pso2Δswr1Δ and rad52Δswr1Δ are not more sensitive to the tested DPDT, 3-CPS and 8-MOP agents than the more sensitive single mutant (pso2Δ and rad52Δ, respectively). Having in mind that Rad52p and Pso2p have non-epistatic interaction (additive or synergistic) in the repair of 3-CPS and 8-MOP photoinduced lesions, we suggest that Pso2p could provide substrate for repair pathway different from HR, which could be canonical NHEJ and/or MMEJ. The fact that swr1Δ (deficient in NHEJ) do not enhance the sensitivity of the double-mutants, in addition to the observed low sensitivity of the yku80Δ mutant to DPDT and psoralens photoaddition, suggests that the induced lesions could be directed to HR or MMEJ pathways rather than to canonical NHEJ. The involvement of the error-prone MMEJ in repair of DPDT-induced lesions could explain the observed frameshift mutation induction by this agent. Moreover, we investigated the cytotoxicity induced by the antitumoral drugs cisplatin (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU), and their combination in S. cerevisiae. The results obtained with DNA repair mutants showed that the sensitivity to cisplatin + 5-FU appears to reflect the sensitivity of the specific strains to each individual drug used. This finding suggests that the enhanced effect of the combined treatment in cancer therapy could be due to the action of each agent alone, as observed on different clones from the heterogeneous population of transformed cells. The results concerning chromatin remodeling mutants demonstrated that CDDP + 5-FU treatment causes a more effective response in the induction of cell death, in CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ and hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, and hst3Δ), HML (dot1Δ) and HMT (erg6Δ) mutants, while CDDP induces sensitivity in HAT mutants, besides the HDAC mutant hos3Δ, and 5-FU treatment induces sensitivity in HAT (gcn5Δ) and HDACs (sin3Δ and hos3Δ). These results point to involvement of chromatin remodeling proteins as important therapeutic targets in response to genotoxic agents. Therefore, our findings could provide new insights for understanding the mechanisms involved in the response to treatment with CDDP + 5-FU, as well as to help in the choice of optimal therapeutic protocols.