O 5-Fluorouracil (5-FU) é um agente antitumoral amplamente empregado no tratamento de diversos tipos de cânceres. Embora haja muitos trabalhos publicados com este antineoplásico, estudos sobre seus mecanismos de ação ainda tornam-se necessários a fim de se obter protocolos clínicos mais eficazes. Desta forma, novos aspectos sobre seu mecanismo de citotoxicidade foram investigados neste trabalho. Na primeira parte foram avaliadas as vias de reparação de DNA que participam em resposta a danos induzidos pelo 5-FU e seus efeitos comparados com o seu metabólito ativo FdUMP em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apontam que as lesões induzidas pelo 5-FU podem ser processadas pela vias de reparo por excisão de bases (BER), reparação de bases mal-emparelhadas (MMR), reparo pós-replicativo (PRR) e recombinação homóloga (HR), enquanto que os danos induzidos pelo FdUMP seriam reconhecidos e removidos apenas pelas vias BER e MMR. Estas diferenças no recrutamento das vias de reparo relacionam-se aos diferentes tipos de lesões que são geradas pelos antimetabólitos: o 5-FU induz quebras de fita simples (SSBs) e duplas (DSBs), enquanto que o FdUMP forma principalmente SSBs. Na segunda parte foi investigada a participação de modeladores da cromatina na citotoxicidade do 5-FU em S. cerevisiae. Os resultados em conjunto sugerem que os remodeladores da cromatina dependentes de ATP e algumas acetiltransferases de histona podem influenciar na citotoxicidade do agente 5-FU, possivelmente atuando no relaxamento da cromatina, e assim facilitando os processos de reparação de DNA por HR e PRR. Na terceira parte foi avaliada a resposta ao dano no DNA por ATR/Chk1 e ATM/Chk2 em células tumorais humanas. Os resultados mostraram que o 5-FU ativa principalmente a via ATR/Chk1. Ao se investigar os efeitos do 5-FU em combinação com o AZD7762, um inibidor de Chk1/2, observou-se aumento de sensibilidade ao agente antitumoral, diretamente relacionado ao aumento de células em sub-G1, diminuição em G2/M e indução de mitose prematura. Os resultados em conjunto obtidos neste trabalho nos permitem uma melhor compreensão destes mecanismos de ação do 5-FU, e fornece subsídios para melhora de protocolos terapêuticos. / 5-Fluorouracil (5-FU) is an antitumor drug employed in the treatment of several cancer types. Despite many studies have been conduced with this antineoplasic drug, investigations concerning on its action mechanism become necessary in order to obtain more efficient clinical protocols. Therefore, new aspects about its cytotoxicity mechanism were investigated in this work. First, DNA repair pathways involved in the repair of 5-FU-induced lesions were evaluated and compared to the effects of its active metabolite FdUMP in Saccharomyces cerevisiae. Our data showed that lesions induced by 5-FU may be processed by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), post-replication repair (PRR) and homologous recombination (HR), while FdUMP lesions are recognized and removed only by BER and MMR. These differences in repair pathways recruitment are related to the different lesion types induced by the antimetabolites: 5-FU induces single- and double stranded breaks (SSBs and DSBs), while FdUMP induces mainly SSBs. In the second part we investigated the participation of chromatin remodeling in the 5- FU cytotoxicity in S. cerevisiae. Together, our data suggest that ATP-dependent chromatin remodeling and some histone acetyltransferases may influence 5-FU cytotoxicity, probably acting in chromatin relaxation and facilitating DNA repair process by HR and PRR. In the third part, the DNA damage response by ATR/Chk1 and ATM/Chk2 were evaluated in human tumor cells. The data showed that 5-FU activates mainly ATR/Chk1 pathway. When we investigate the effects of 5-FU in combination with AZD7762, the Chk1/2 inhibitor, we observed increased sensitivity to this antitumor agent, directly related to enhanced number of sub-G1 cells, decrease in the G2/M cells, and premature mitose induction. Our data permit a better comprehension of 5-FU action mechanisms and provide clues to improve the current therapeutics protocols.

O câncer de mama é o mais freqüente tipo de câncer entre mulheres e representa a segunda causa de morte dentre elas (após o câncer de pulmão). O deterioramento do perfil antioxidante (atividade de SOD e CAT) e/ou do reparo de DNA podem elevar os riscos de uma transformação maligna, devido ao acúmulo de mutações espontâneas em genes importantes nos processos tumorais. Neste trabalho, foram determinados (capítulo 1) os níveis de danos no DNA, endógenos e induzidos por peróxido de hidrogênio, em linfócitos de sangue periféricos de pacientes com câncer de mama, e também se analisou o perfil antioxidante do plasma desses indivíduos. Os resultados demonstraram claramente uma relação entre os níveis de danos endógenos no DNA e a atividade de SOD, onde altos níves de danos endógenos estão correlacionados com uma baixa atividade dessa enzima. Além disso, as pacientes apresentaram uma menor capacidade de reparo aos danos induzidos pelo peróxido de hidrogênio, quando comparados com os controles. Sabe-se que muitas drogas qumioterápicas (como doxorrubicina) têm como alvo o DNA, com isso a citotoxicidade desses agentes está diretamente relacionada com sua habilidade de causar danos no material genético. Os mecanismos de reparo de danos no DNA constituem um dos tópicos mais interessantes na biologia moderna, uma vez que as proteínas inseridas nesses processos podem estar envolvidas na manutenção da integridade genômica, assim como na resistência de certos tumores a estratégias de terapia antitumoral. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) é um mecanismo de reparo altamente conservado que envolve mais de 30 proteínas, dentre elas a proteína XPD, a qual é uma subunidade do complexo TFIIH, envolvido nos processos de transcrição e reparo. Assim, no capítulo 2, foi determinada a sensibilidade de três linhagens de fibroblastos humanos deficientes no gene XPD à doxorrubicina (DOX). Os resultados apresentados nesse capítulo mostraram a maior sensibilidade das linhagens XPD e XP/CS quando comparados com TTD e MRC5 (linhagem normal), assim como a indução de foci de γH2AX (indicativo de quebras de dupla fita) pela DOX de forma tempo dependente. Com os resultados obtidos nesse trabalho é possível enfatizar a utilização de linfócitos de sangue periférico para o monitoramento de genotoxicidade a terapias antitumorais, bem como sugerir a participação do NER no reparo de lesões causadas por DOX. / Breast cancer is the most common malignancy among women and it is the second cause of death among them (after lung cancer). Impaired antioxidant status and/or DNA repair may elevate the risk of malignant transformation of breast cells due to the accumulation of spontaneous mutations in target genes in tumor processes. In this work, we have determined (chapter 1) the DNA damage levels, either endogenous or induced by hydrogen peroxide, in peripheral blood lymphocytes of breast cancer patients, as well as the antioxidant status in the plasma of these individuals. The results clearly showed a relation between endogenous DNA damage levels and SOD activity, where high endogenous damage levels are correlated with low SOD activity. Moreover, the patients presented a lower DNA damage repair capacity to the damages induced by hydrogen peroxide than the controls. It is very well known that many chemotherapeutic drugs (like doxorubicin) target DNA and therefore the citotoxicity of these agents is directly related to their ability to cause DNA damage. The mechanisms of DNA damage repair are one of the most interesting topics in modern biology, since the proteins that take part in these processes can be involved in both the maintenance of genomic integrity and in the resistance of certain tumors to anti-tumoral strategies. Nucleotide Excision Repair (NER) is a highly conserved repair mechanism that involves more than 30 proteins, among them the XPD protein, which is a subunit of the TFIIH complex, involved both in transcription and repair. Thus, in chapter 2, we have determined the sensitivity of three different human fibroblasts deficient in XPD gene to doxorubicin (DOX). The results showed in this chapter demonstrated a higher sensitivity of XPD and XP/CS cell lines to DOX than TTD and MRC5 (normal cells), as well as the induction of γH2AX foci (indicative of double strand breaks) by DOX in a time-dependent manner. With the results obtained in this work it is possible to emphasizes the use of peripheral blood lymphocytes to monitoring genotoxicity to therapies, as well as to suggest the a role of NER in the repair of lesions caused by DOX.

O 5-Fluorouracil (5-FU) é um agente antitumoral amplamente empregado no tratamento de diversos tipos de cânceres. Embora haja muitos trabalhos publicados com este antineoplásico, estudos sobre seus mecanismos de ação ainda tornam-se necessários a fim de se obter protocolos clínicos mais eficazes. Desta forma, novos aspectos sobre seu mecanismo de citotoxicidade foram investigados neste trabalho. Na primeira parte foram avaliadas as vias de reparação de DNA que participam em resposta a danos induzidos pelo 5-FU e seus efeitos comparados com o seu metabólito ativo FdUMP em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apontam que as lesões induzidas pelo 5-FU podem ser processadas pela vias de reparo por excisão de bases (BER), reparação de bases mal-emparelhadas (MMR), reparo pós-replicativo (PRR) e recombinação homóloga (HR), enquanto que os danos induzidos pelo FdUMP seriam reconhecidos e removidos apenas pelas vias BER e MMR. Estas diferenças no recrutamento das vias de reparo relacionam-se aos diferentes tipos de lesões que são geradas pelos antimetabólitos: o 5-FU induz quebras de fita simples (SSBs) e duplas (DSBs), enquanto que o FdUMP forma principalmente SSBs. Na segunda parte foi investigada a participação de modeladores da cromatina na citotoxicidade do 5-FU em S. cerevisiae. Os resultados em conjunto sugerem que os remodeladores da cromatina dependentes de ATP e algumas acetiltransferases de histona podem influenciar na citotoxicidade do agente 5-FU, possivelmente atuando no relaxamento da cromatina, e assim facilitando os processos de reparação de DNA por HR e PRR. Na terceira parte foi avaliada a resposta ao dano no DNA por ATR/Chk1 e ATM/Chk2 em células tumorais humanas. Os resultados mostraram que o 5-FU ativa principalmente a via ATR/Chk1. Ao se investigar os efeitos do 5-FU em combinação com o AZD7762, um inibidor de Chk1/2, observou-se aumento de sensibilidade ao agente antitumoral, diretamente relacionado ao aumento de células em sub-G1, diminuição em G2/M e indução de mitose prematura. Os resultados em conjunto obtidos neste trabalho nos permitem uma melhor compreensão destes mecanismos de ação do 5-FU, e fornece subsídios para melhora de protocolos terapêuticos. / 5-Fluorouracil (5-FU) is an antitumor drug employed in the treatment of several cancer types. Despite many studies have been conduced with this antineoplasic drug, investigations concerning on its action mechanism become necessary in order to obtain more efficient clinical protocols. Therefore, new aspects about its cytotoxicity mechanism were investigated in this work. First, DNA repair pathways involved in the repair of 5-FU-induced lesions were evaluated and compared to the effects of its active metabolite FdUMP in Saccharomyces cerevisiae. Our data showed that lesions induced by 5-FU may be processed by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), post-replication repair (PRR) and homologous recombination (HR), while FdUMP lesions are recognized and removed only by BER and MMR. These differences in repair pathways recruitment are related to the different lesion types induced by the antimetabolites: 5-FU induces single- and double stranded breaks (SSBs and DSBs), while FdUMP induces mainly SSBs. In the second part we investigated the participation of chromatin remodeling in the 5- FU cytotoxicity in S. cerevisiae. Together, our data suggest that ATP-dependent chromatin remodeling and some histone acetyltransferases may influence 5-FU cytotoxicity, probably acting in chromatin relaxation and facilitating DNA repair process by HR and PRR. In the third part, the DNA damage response by ATR/Chk1 and ATM/Chk2 were evaluated in human tumor cells. The data showed that 5-FU activates mainly ATR/Chk1 pathway. When we investigate the effects of 5-FU in combination with AZD7762, the Chk1/2 inhibitor, we observed increased sensitivity to this antitumor agent, directly related to enhanced number of sub-G1 cells, decrease in the G2/M cells, and premature mitose induction. Our data permit a better comprehension of 5-FU action mechanisms and provide clues to improve the current therapeutics protocols.

O 5-fluorouracil (5-FU) é um antineoplásico análogo pirimídico empregado no tratamento de muitos tipos de cânceres. Três diferentes mecanismos de citotoxicidade são atribuídos a este agente: incorporação de fluoronucleotídeos no DNA ou RNA e a inibição da enzima timidilato sintase. O 5-FU pode ser convertido ao seu metabólito ativo, o 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), que por sua vez, pode inibir a enzima timidilato sintase (TS), responsável pela síntese de timidina monofosfato a partir de uridina monofosfato; a inibição de TS leva ao desbalanço do pool de nucleotídeos, diminuindo a concentração de dTTP, aumentando a de dUTP e, como conseqüência, levando à incorporação de uracil na cadeia de DNA. No presente estudo comparamos a atividade citotóxica de 5-FU e de seu metabólito FdUMP e as vias de reparação de DNA envolvidas na eliminação das lesões induzidas por estas substâncias. A atividade citotóxica foi avaliada em células de adenocarcinoma de cólon humano, linhagem SW620. As vias de reparação foram estudadas em linhagens de Saccharomyces cerevisiae deficientes em genes de reparo para excisão de bases (BER), excisão de nucleotídeos (NER), recombinação homóloga (HR), recombinação não-homóloga (NHEJ) e síntese translesão (TLS). Para se investigar a possível sobreposição das vias de reparo, foram empregados quádruplos mutantes em BER e NER, HR ou TLS. Os resultados em células tumorais humanas mostraram que tanto 5-FU, quanto FdUMP desencadeiam morte celular por apoptose. Ao avaliar a progressão do ciclo celular, observou-se que 5-FU leva a parada em G1, enquanto que FdUMP, parada em G2. Com a finalidade de se investigar se estas paradas de ciclo celular estariam relacionadas a quebras de DNA, foram empregados ensaios de fosforilação da histona H2AX e os testes de cometa alcalino e de micronúcleos. Observou-se que ambas as drogas induzem fragmentação no DNA, uma vez que foram observadas quebras de fita simples e formação de micronúcleos. Logo, a diferença na progressão do ciclo celular não está relacionada com a habilidade das drogas em induzir quebras. Desta forma, sugere-se que o efeito diferencial de 5-FU e FdUMP na progressão do ciclo celular depende do tipo de lesão induzida pelas drogas e as vias de reparação de DNA implicadas no reconhecimento das mesmas. Ao empregar linhagens de S. cerevisiae proficientes e deficientes em reparo tratadas com 5-FU e FdUMP, observou-se que a proteína Apn1 é de extrema importância no reparo das mesmas, uma vez que apn1Δ foi o mais sensível de todos mutantes e ntg1Δntg2Δapn1Δ apresentou grande sensibilidade aos tratamentos com ambas as drogas. As lesões causadas por 5-FU seriam reconhecidas principalmente pela Ntg2, o que resulta em significativa sensibilidade em ntg2Δ e ntg1Δntg2Δ. Entretanto, para o reconhecimento dos danos por FdUMP são necessárias a participação tanto de Ntg1 quanto Ntg2, como visto na elevada sensibilidade do duplo mutante ntg1Δntg2Δ. As deficiências em Ung1 e Rad27 não revelaram diferenças significativas em relação às linhagens selvagens, bem como nos mutantes em NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), para ambas as drogas. No emprego de quádruplos mutantes, verificou-se que ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ mostrou uma acentuada sensibilidade quando tratado com 5-FU. Estes resultados sugerem que os danos gerados por 5-FU poderiam ser reconhecidos e removidos pela DNA glicosilase Ntg2 e AP endonucleases Apn1 do BER, levando a quebras de fita simples e dupla de DNA, que seriam reparadas por HR (Tipo RAD52). Entretanto, para o tratamento com FdUMP não foram observadas diferenças significativas quando comparado com a linhagem selvagem. Ao analisar a sensibilidade dos mutantes ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ e ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, verificou-se que os mesmos não foram sensíveis ao tratamento com FdUMP, entretanto apresentaram moderada sensibilidade quando tratados com 5-FU. O conjunto desses resultados nos leva a sugerir que uma pequena parte dos sítios AP produzidos pelo tratamento com 5-FU poderia ser processada por NER e TLS, sendo a participação de HR a mais importante. As lesões geradas por FdUMP seriam reparadas principalmente por BER, com a participação de Ntg1, Ntg2 e Apn1, porém não pode ser descartado o possível envolvimento da reparação de bases mal-emparelhadas - MMR, uma vez que se observou previamente, uma parada no ciclo celular em G2 em células de adenocarcinoma de cólon humano SW620. / 5-fluorouracil (5-FU) is an antineoplastic drug pyrimidic analogue employed in the treatment of several cancers. Three different mechanisms of cytotoxicity are attributed to this agent: misincorporation of fluoronucleotides in DNA or RNA and inhibition of thymidilate sintase enzime. 5-FU could be converted to its active metabolite, 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), that could inhibit the thymidilate sintase (TS), related to thymidine synthesis from uridine; TS inhibition leads to nucleotide pool imbalance, decreasing thymine concentration and increasing uracil, as consequence, it leads to uracil incorporation into DNA. The present study compared the cytotoxic activity of 5-FU and its active metabolite FdUMP, and the DNA repair pathways involved in removing lesions induced by these substances. Cytotoxicity was evaluated in human colon adenocarcinoma cells, SW620. DNA repair pathwayas were studied in Saccharomyces cerevisiae deficient in base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), homologous recombination (HR), non-homologous end joining (NHEJ) and translesion synthesis (TLS). To investigate the overlapping of DNA repair pathways, we employed quadruple mutants in BER and NER, HR or TLS. Results in human tumor cells showed that both 5-FU and FdUMP induce cell death by apoptosis. When we investigated the cell cycle progression, we observed that 5-FU lead G1 arrest, while FdUMP induced G2 arrest. In order to investigate if these arrests would be related to DNA breaks, alkaline comet assay, fosforilation of H2AX histone and micronucleus assay were employed. We observed that both drugs induce DNA fragmentation, since single strand breaks and micronucleus were evidenced. Thus, the difference in cell cycle progression is not related to the ability of 5-FU and FdUMP in induce breaks. This way, we suggest that the differential effect of 5-FU and FdUMP in cell cycle progression depends on the type of lesion originated by drugs and the DNA repair pathways implicated in recognize them. By employing S. cerevisiae strains proficient and deficient in DNA repair treated with 5-FU and FdUMP, it was observed that Apn1 protein is extremely important in repairing these lesions, since apn1Δ was the most sensitive of all mutants employed and ntg1Δntg2Δapn1Δ showed high sensitivity to treatments with both drugs. Lesions caused by 5-FU would be recognized mainly by Ntg2, what results in significant sensitivity in ntg2Δ and ntg1Δntg2Δ. However, for recognition of FdUMP damage it is necessary the participation of both Ntg1 and Ntg2, as observed in high sensitivity of ntg1Δntg2Δ double mutant. Deficiencies in Ung1 and Rad27 did not reveal significant differences in relation to WT, as well as mutants in NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), for both drugs. When we employed quadruple mutants, we verified that ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ showed higher sensitivity when treated with 5-FU. These data suggest that damage generated by 5-FU could be recognized and removed by DNA glycosylases Ntg2 and AP endonuclease Apn1 from BER, generating DNA single and double strand breaks, that could be repaired by HR (RAD52 Type). However, for FdUMP, we did not observe significant differences in comparison to WT. By investigating the sensitivity of ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ and ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, we observed that they were not sensitized by FdUMP, however, they present a slight sensitivity when treated with 5-FU. These results lead us to suggest that a small part of AP sites generated by 5-FU could be processed by NER and TLS, and HR would be the most significant. Lesions by FdUMP would be repaired mainly by BER, with participation of Ntg1, Ntg2 and Apn1, however, we can not discharge the possible involvement of mismatch repair pathway - MMR, since we previous observed G2 arrest in SW620 human colon adenocarcinoma cells.

Orientador : Prof. Dr. Eroulths Cortiano Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Jurídicas, Programa de Pós-Graduação em Direito. Defesa: Curitiba, 16/09/2016 / Inclui referências : f. 193-212 / Área de concentração: Direito das relações sociais / Linha de pesquisa: Novos paradigmas do direito / Resumo: A reparação de danos, em suas contemporâneas feições, orbita em torno do problema da identificação do dano reparável, que se resume na seleção dos interesses protegidos. A tradição europeia continental conta com variadas respostas a este problema, dentre as quais se destacam as albergadas pelas codificações civis brasileira e alemã. Os modelos de reparação civil por elas contemplados são radicalmente diferentes em termos de estrutura: no primeiro, impera a atipicidade determinada pelo amplo emprego de cláusulas gerais; no segundo, predomina a tipicidade haurida da enunciação em abstrato de determinados interesses juridicamente tutelados. Não obstante estas diferenças, ambos os modelos enfrentam problemas ligados a seu esgotamento e a sua aparente inaptidão para promover segurança jurídica. Diante destes desafios, delineia-se inusitada convergência em torno de uma resposta comum, consistente no reconhecimento de que a atividade de interpretação e aplicação do Direito tem forte componente criativo e na consequente deferência à autoridade da atividade jurisdicional. Isto é sinal da revisão das relações entre Jurisdição e Legislação promovida pela progressiva transição entre os modelos de Estado de Direito e de Estado Constitucional em ambos os cenários, a qual clama por reconsideração do sentido atribuído à segurança jurídica, cada vez mais distanciado da certeza na lei (sentido formal) e próximo da controlabilidade de razões (sentido substancial), conforme reconhecido pelas comunidades jurídicas especializadas em ambos os contextos. Esta constatação de estudo comparado realizado em dimensão micro, segundo o pro obpleemra- sao plvairntgir approach. Analisa-se, assim, o problema da possibilidade de segurança jurídica na identificação dos interesses protegidos, diante do aparente esgotamento de ambos os modelos (pelas contrastantes flexibilidade e rigidez que lhes são inatas), de modo a identificar contrastes e pontos de contato permissivos da verificação da hipótese de que, nos dois contextos, a melhor solução ora oferecida reside no paulatino reconhecimento e valorização do caráter criativo da atividade jurisdicional. Palavras-chave: Reparação Civil. Direito Comparado. Interesses protegidos. Segurança Jurídica em sentido substancial. Legislação e Jurisdição. Estado Constitucional. / Abstract: injury, which comes down to the selection of protected interests. Continental Law has several different answers to this problem, among which the ones carved in Brazilian and German Civil Codes stand out. The respective models hosted by each of them are radically different in terms of structure: while the first follows the general clause model, the latter is delict-based and indicates interests in abstracto. In spite of such differences, both model sc efarctaei nc hparolletencgteeds related to their exhaustion and to their apparent inability to promote legal certainty. In face of these problems, an unexpected convergence towards the very same response outskirts itself: the widespread recognition that legal interpretation and the application of norms have a notable creative component, from where follows a necessary deference to the authority of judge-made law. This is a remarkable sign of the recalibration of traditional relations between JRuercishdtsicttaioant maondde l tLoe tghiesl aVteurrfea,s spurnogmsostteada t ibny b oththe scgernadauriaosl . tTrahniss irteiovnie wfr ocamll s tfhoer reconsideration of the meaning attached to legal certainty, which is becoming ian scurebasstainngtilya l dciosntacnecpetido nfr o(lmyin igts o fno rtmhea cl ocontnrcoellpabt i(lciteyr otaf irnetay soofn lsa)w, a) sa nadck mnoowrele kding etdo abyn alelygsaisl csochnodluacrtse din i nb oththe mcoicnrtoe xdtsim. eTnhsisio cno, ninc laucscioonrd daenrcivee tso ftrhoem p rao bcloemmp-saoralvtiinvge aprpoptreocatecdh .i nTtheere psrtosb, lveims-à c-ovniss tishtee natp ipna trheen tp eoxshsiabuilsittyio onf olef gbaol tche mrtaoidnetyls i n(d iudee ntoti ftyhinegir congenital and contrasting flexibility and rigidity), is thus scrutinized in order to identify contrasts and points of contact that allow us to verify the hypothesis that, in the two contexts analysed, the current best solution available lies on the recognition and appreciation of the creative character of judicial activity. cKeerytawionrtyd.s L: eCgivisill alitaubreili tayn. dC oJumrpisadriacttiivoen .L Vaewr.f aPsrsoutencgtsesdta Iantt.e rests. Substantial legal

Este estudo analisou a validade da estimulação ultra-sônica de baixa intensidade na reparação tecidual em úlceras vasculares através de estudos anatomo-patológicos com biópsias colhidas da borda e fundo das úlceras, antes e depois da estimulação ultra-sônica. Trabalhos experimentais utilizando a aplicação do ultra-som terapêutico têm sido extensivamente usados desde 1955, para uma variedade de condições traumáticas, músculo-esqueléticas, articulares, incluindo osteoartrites, periartrites, bursites e tenosinovites. Recentemente, aplicações adicionais como a aceleração da reparação tecidual e cicatrização das feridas têm sido relatadas na literatura. Com base nos estudos descritos anteriormente e em estudos da aplicação do ultra-som de baixa intensidade para a reparação tecidual de pacientes portadores de úlceras vasculares, iniciou-se a realização desse trabalho no setor de curativos do Posto de Saúde de Franca. Nessa pesquisa participaram 28 pacientes voluntários encaminhados com diagnóstico de úlceras flebopáticas. Estes pacientes inicialmente foram submetidos ao tratamento de ultra-som pulsado de baixa intensidade, com um protocolo previamente estabelecido. A freqüência utilizada foi de 1 KHz e intensidade 25mW/cm2. Para comprovação da ação reparadora do ultra-som foram feitos dois estudos: estudo microscópico e estudo macroscópico. O estudo microscópico consiste da análise histopatológica dos tecidos excisados do leito da úlcera através da técnica \"punch\". A excisão foi feita por um médico dermatologista com o consentimento dos pacientes antes, durante e depois da estimulação ultra-sônica. Para a aquisição das fotomicrografias foi utilizada uma câmera Olympus DP10, acoplada a um microscópio Olympus DX60. O estudo macroscópico foi feito com o uso de técnicas de processamento de imagens. Para isto foi utilizado um sistema de aquisição e processamento de imagens (software) desenvolvido no Departamento de Engenharia Elétrica, no Laboratório de Microprocessadores da EESC-USP, que analisou características da evolução das úlceras fornecendo como resultados gráficos dessas mesmas características, ao longo do tempo de tratamento. As imagens foram anteriormente capturadas a cada duas semanas e armazenadas. Foram estabelecidos protocolos de aplicação do ultra-som de 4, 8 e 12 semanas de acordo com a área das úlceras. Os resultados obtidos da análise macroscópica revelaram a redução da área das úlceras. Esses achados coincidiram com as características observadas no processo de reparação tecidual através do sistema de monitoramento com o uso de visão computacional. O exame histopatológico de casos correspondentes mostrou em alguns casos a neoformação de vasos e o aumento de fibroblastos. Os resultados obtidos neste trabalho comprovam que o tratamento com o ultra-som pulsado de baixa intensidade agiu significativamente na redução das úlceras, promovendo a aceleração da reparação tecidual e a cicatrização das mesmas. / This study analysed the validity of low intensity, ultrasound stimulation in the tissue healing among vascular ulcers through anatomic pathological studies with biopsies collected from the edge and middle of the ulcers, before and after the ultrasound stimulation. Experimental work utilizing therapeutic ultrasound applications have been used since 1955 for a variety of trauma, muscular-skeletal and joint conditions including osteoarthritis, periarthritis, bursitis and fenosinovites. Recently results of additional applications such as the acceleration of tissue repair and healing in wounds has been reported in the literature available. Based on the aforementioned studies, and on further studies of low intensity, ultrasound applications for tissue repair among patients suffering from vascular ulcers, the present work was initiated within the wound dressirig sector located in the Public Health Center of the City of Franca, SP, Brazil. Twenty-eight volunteer patients diagnosed with phlebopathic ulcers participated in this research. To prove the healing action of ultrasound, two studies were made: a rnicroscopic study and a macroscopic study. The microscopic study consisted of a histopathological analysis of tissues cut from the base of the ulcer applying the punch technique. The cut was made by a dermatologist with the patients\' consent, before, during and after the ultrasound stimulation. An Olyrnpus DP10 camera coupled to an Olympus DX60 rnicroscope was used in taking the photomicrographs. The macroscopic study was made using image processing techniques. This was carried out using a system of capturing and processing images (software) developed by the Department of Electrical Engineering\'s Microprocessor Laboratory at EESC-USP (University of São Paulo), which analysed the characteristics of the evolution of the ulcers supplying graphs of these characteristics during the whole treatment. The images were taken every two weeks and the stored away. Registers of the ultrasound applications were established at 4, 8 and 12 weeks according to the area of the ulcers. The results obtained from the macroscopic analysis revealed a reduction in the area o f the ulcers. They coincided with the observed characteristics within the process of the observed tissue repair through the Monitoring System which uses a computational view point. The histopathological exam showed in some cases a neo-formation of veins and the increase of fibroblasts. The results obtained in this work proved that the treatment with ultrasound pulsed at low intensity acted significantly on the reduction of the ulcers, promoting the acceleration of tissue repair and healing.

Este estudo analisou a validade da estimulação ultra-sônica de baixa intensidade na reparação tecidual em úlceras vasculares através de estudos anatomo-patológicos com biópsias colhidas da borda e fundo das úlceras, antes e depois da estimulação ultra-sônica. Trabalhos experimentais utilizando a aplicação do ultra-som terapêutico têm sido extensivamente usados desde 1955, para uma variedade de condições traumáticas, músculo-esqueléticas, articulares, incluindo osteoartrites, periartrites, bursites e tenosinovites. Recentemente, aplicações adicionais como a aceleração da reparação tecidual e cicatrização das feridas têm sido relatadas na literatura. Com base nos estudos descritos anteriormente e em estudos da aplicação do ultra-som de baixa intensidade para a reparação tecidual de pacientes portadores de úlceras vasculares, iniciou-se a realização desse trabalho no setor de curativos do Posto de Saúde de Franca. Nessa pesquisa participaram 28 pacientes voluntários encaminhados com diagnóstico de úlceras flebopáticas. Estes pacientes inicialmente foram submetidos ao tratamento de ultra-som pulsado de baixa intensidade, com um protocolo previamente estabelecido. A freqüência utilizada foi de 1 KHz e intensidade 25mW/cm2. Para comprovação da ação reparadora do ultra-som foram feitos dois estudos: estudo microscópico e estudo macroscópico. O estudo microscópico consiste da análise histopatológica dos tecidos excisados do leito da úlcera através da técnica \"punch\". A excisão foi feita por um médico dermatologista com o consentimento dos pacientes antes, durante e depois da estimulação ultra-sônica. Para a aquisição das fotomicrografias foi utilizada uma câmera Olympus DP10, acoplada a um microscópio Olympus DX60. O estudo macroscópico foi feito com o uso de técnicas de processamento de imagens. Para isto foi utilizado um sistema de aquisição e processamento de imagens (software) desenvolvido no Departamento de Engenharia Elétrica, no Laboratório de Microprocessadores da EESC-USP, que analisou características da evolução das úlceras fornecendo como resultados gráficos dessas mesmas características, ao longo do tempo de tratamento. As imagens foram anteriormente capturadas a cada duas semanas e armazenadas. Foram estabelecidos protocolos de aplicação do ultra-som de 4, 8 e 12 semanas de acordo com a área das úlceras. Os resultados obtidos da análise macroscópica revelaram a redução da área das úlceras. Esses achados coincidiram com as características observadas no processo de reparação tecidual através do sistema de monitoramento com o uso de visão computacional. O exame histopatológico de casos correspondentes mostrou em alguns casos a neoformação de vasos e o aumento de fibroblastos. Os resultados obtidos neste trabalho comprovam que o tratamento com o ultra-som pulsado de baixa intensidade agiu significativamente na redução das úlceras, promovendo a aceleração da reparação tecidual e a cicatrização das mesmas. / This study analysed the validity of low intensity, ultrasound stimulation in the tissue healing among vascular ulcers through anatomic pathological studies with biopsies collected from the edge and middle of the ulcers, before and after the ultrasound stimulation. Experimental work utilizing therapeutic ultrasound applications have been used since 1955 for a variety of trauma, muscular-skeletal and joint conditions including osteoarthritis, periarthritis, bursitis and fenosinovites. Recently results of additional applications such as the acceleration of tissue repair and healing in wounds has been reported in the literature available. Based on the aforementioned studies, and on further studies of low intensity, ultrasound applications for tissue repair among patients suffering from vascular ulcers, the present work was initiated within the wound dressirig sector located in the Public Health Center of the City of Franca, SP, Brazil. Twenty-eight volunteer patients diagnosed with phlebopathic ulcers participated in this research. To prove the healing action of ultrasound, two studies were made: a rnicroscopic study and a macroscopic study. The microscopic study consisted of a histopathological analysis of tissues cut from the base of the ulcer applying the punch technique. The cut was made by a dermatologist with the patients\' consent, before, during and after the ultrasound stimulation. An Olyrnpus DP10 camera coupled to an Olympus DX60 rnicroscope was used in taking the photomicrographs. The macroscopic study was made using image processing techniques. This was carried out using a system of capturing and processing images (software) developed by the Department of Electrical Engineering\'s Microprocessor Laboratory at EESC-USP (University of São Paulo), which analysed the characteristics of the evolution of the ulcers supplying graphs of these characteristics during the whole treatment. The images were taken every two weeks and the stored away. Registers of the ultrasound applications were established at 4, 8 and 12 weeks according to the area of the ulcers. The results obtained from the macroscopic analysis revealed a reduction in the area o f the ulcers. They coincided with the observed characteristics within the process of the observed tissue repair through the Monitoring System which uses a computational view point. The histopathological exam showed in some cases a neo-formation of veins and the increase of fibroblasts. The results obtained in this work proved that the treatment with ultrasound pulsed at low intensity acted significantly on the reduction of the ulcers, promoting the acceleration of tissue repair and healing.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.

Interstrand DNA crosslinks (ICLs) são importantes lesões genotóxicas que podem causar morte celular se não for devidamente reparadas. Diversas drogas antitumorais atuam através da indução de ICLs no DNA, e a resistência a essas drogas está muitas vezes relacionada à maior capacidade de células tumorais para reparar tais lesões. As ICLs são lesões complexas que requerem o envolvimento de diferentes vias de reparação, tais como BER NER, TLS e vias de reparação de DSBs (RH e NHEJ). Além disso, foi demonstrado que Pso2p desempenha um papel importante na reparação de ICLs. Muitos estudos também apontam para as alterações epigenéticas como essenciais para a sobrevivência da célula em resposta ao dano genotóxico, através da indução de checkpoints de ciclo celular e da modulação da eficiência (e, possivelmente, da escolha) das vias de reparação de DNA. Assim, a primeira parte desta Tese apresenta uma revisão dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade dos ICLs induzidos pela furocumarina bifuncional 8-metoxipsoraleno (8-MOP) em Saccharomyces cerevisiae. A abordagem adotada discute a ação integrada de proteínas que atuam em vias de reparação de DNA envolvidas na remoção de ICLs, em combinação com fatores envolvidos no remodelamento da cromatina dependente de ATP. A fim de investigar o papel do remodelamento da cromatina em resposta a danos ao DNA induzidos pelo tratamento com furocumarinas mono e bifuncionais fotoativadas e ditelureto de difenila (DTDF), foram utilizadas linhagens de S. cerevisiae deficientes em diferentes proteínas relacionadas com a reparação do DNA e o remodelamento da cromatina. DTDF é um composto organotelurado proposto como um protótipo potencial para o desenvolvimento de novas drogas antitumorais. A sensibilidade do mutante pso2Δ ao DTDF, semelhante à observada para o 8-MOP, indica que este composto pode induzir lesões capazes de bloquear a replicação do DNA, tais como ligações cruzadas ou DSBs hairpin capped. Os resultados obtidos mostraram que os duplos mutantes pso2Δswr1Δ e rad52Δswr1Δ não são mais sensíveis aos agentes testados, DTDF, 3-CPS e 8-MOP, do que o mais sensível dos simples mutantes (pso2Δ e rad52Δ, respectivamente). Tendo em mente que Rad52p e Pso2p não têm interação epistática (aditiva ou sinergística) na reparação das lesões fotoinduzidas por 3-CPS e 8-MOP, sugere-se que Pso2p pode fornecer substrato para vias de reparação diferentes de HR, que poderiam ser NHEJ canônica e/ou MMEJ. O fato de que swr1Δ (deficiente em NHEJ) não aumenta a sensibilidade dos duplos mutantes, além da baixa sensibilidade observada para o mutante yku80Δ ao DTDF e à fotoadição de psoralenos, sugere que as lesões induzidas podem ser direcionadas para as vias HR ou MMEJ, ao invéz de NHEJ canônica. O envolvimento da via MMEJ sujeita a erros na reparação de lesões induzidas por DTDF pode explicar a indução de mutação frameshift, observada para este agente. Além disso, investigou-se a citotoxicidade induzida pelas drogas antitumorais cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) e sua combinação, em S. cerevisiae. Os resultados obtidos com os mutantes de reparação do DNA mostraram que a sensibilidade à CDDP + 5-FU parece refletir a sensibilidade de linhagens específicas a cada droga utilizada individualmente. Este resultado sugere que o efeito intensificado do tratamento combinado na terapia do câncer pode ser devido à ação de cada agente isoladamente, conforme observado em clones diferentes da população heterogênea de células transformadas. Os resultados referentes aos mutantes em remodelamento da cromatina demonstraram que o tratamento com CDDP + 5-FU provoca uma resposta mais eficaz na indução de morte celular, nos mutantes deficientes em CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ e hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, e hst3Δ), HML (dot1Δ) e HMT (erg6Δ), enquanto CDDP induz sensibilidade em mutantes HAT, além do mutante de HDAC hos3Δ, e o tratamento com 5-FU induz sensibilidade em HAT (gcn5Δ) e HDAC (sin3Δ e hos3Δ). Esses resultados apontam para o envolvimento de proteínas de remodelamento da cromatina como importantes alvos terapêuticos em resposta a agentes genotóxicos. Portanto, os resultados obtidos podem abrir novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta ao tratamento com CDDP + 5-FU, bem como auxiliar na escolha dos melhores protocolos terapêuticos. / Interstrand DNA crosslinks (ICLs) are important genotoxic lesions that can cause cell death if not properly repaired. Several antitumoral drugs act by inducing ICLs in DNA, and the resistance to these drugs is often related to an increased capacity of tumor cells to repair such lesions. The ICLs are complex lesions requiring involvement of different pathways for repair, such as BER, NER, TLS and DSB repair pathways (HR and NHEJ). In addition, Pso2p was shown to play an important role in ICLs repair. Many studies also point to the epigenetic changes as essential for cell survival in response to genotoxic damage, through induction of cell cycle checkpoints and modulating the efficiency (and possibly, the choice) of the DNA repair pathways. So, the first part of this Thesis gives a review of the mechanisms involved in the cytotoxicity of the ICLs induced by the bifunctional furocumarin 8-methoxypsoralen (8-MOP) in Saccharomyces cerevisiae. The adopted approach discusses the integrated action of proteins that work in the DNA repair pathways involved in ICLs removing in combination with factors involved in ATP-dependent chromatin remodeling. In order to investigate the role of the chromatin remodeling in response to DNA damage induced by treatment with mono- and bifunctional photoactivated furocumarins and diphenyl ditelluride (DPDT), we used S. cerevisiae strains deficient in different proteins related to DNA repair and chromatin remodeling. DPDT is organotellurium compound proposed as a potential prototype for development of new antitumoral drugs. The sensitivity of pso2Δ to DPDT, similar to that observed for 8-MOP, indicates that this compound could induce lesions able to block DNA replication, such as crosslinks or hairpin-capped DSBs. The obtained results showed that the double mutants pso2Δswr1Δ and rad52Δswr1Δ are not more sensitive to the tested DPDT, 3-CPS and 8-MOP agents than the more sensitive single mutant (pso2Δ and rad52Δ, respectively). Having in mind that Rad52p and Pso2p have non-epistatic interaction (additive or synergistic) in the repair of 3-CPS and 8-MOP photoinduced lesions, we suggest that Pso2p could provide substrate for repair pathway different from HR, which could be canonical NHEJ and/or MMEJ. The fact that swr1Δ (deficient in NHEJ) do not enhance the sensitivity of the double-mutants, in addition to the observed low sensitivity of the yku80Δ mutant to DPDT and psoralens photoaddition, suggests that the induced lesions could be directed to HR or MMEJ pathways rather than to canonical NHEJ. The involvement of the error-prone MMEJ in repair of DPDT-induced lesions could explain the observed frameshift mutation induction by this agent. Moreover, we investigated the cytotoxicity induced by the antitumoral drugs cisplatin (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU), and their combination in S. cerevisiae. The results obtained with DNA repair mutants showed that the sensitivity to cisplatin + 5-FU appears to reflect the sensitivity of the specific strains to each individual drug used. This finding suggests that the enhanced effect of the combined treatment in cancer therapy could be due to the action of each agent alone, as observed on different clones from the heterogeneous population of transformed cells. The results concerning chromatin remodeling mutants demonstrated that CDDP + 5-FU treatment causes a more effective response in the induction of cell death, in CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ and hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, and hst3Δ), HML (dot1Δ) and HMT (erg6Δ) mutants, while CDDP induces sensitivity in HAT mutants, besides the HDAC mutant hos3Δ, and 5-FU treatment induces sensitivity in HAT (gcn5Δ) and HDACs (sin3Δ and hos3Δ). These results point to involvement of chromatin remodeling proteins as important therapeutic targets in response to genotoxic agents. Therefore, our findings could provide new insights for understanding the mechanisms involved in the response to treatment with CDDP + 5-FU, as well as to help in the choice of optimal therapeutic protocols.

Tese de mestrado. Construção de Edifícios. 1991. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto