OBJETIVOS: Caracterizar o perfil de imunoexpressão de MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2 em adenocarcinomas gástricos, explorando seu desempenho na identificação de características clínicas e patológicas, bem como sua influência prognóstica isolada e em relação aos demais parâmetros. MÉTODOS: Cento e trinta e três casos de adenocarcinomas gástricos esporádicos localmente avançados (pT2a ou mais) operados no Hospital das Clínicas/FMUSP foram incluídos pela ausência de metástases a distância ao diagnóstico (M0) e caracterizados clínica (idade, sexo e sobrevida) e patologicamente (tamanho, local, tipo de Borrmann, tipo histológico, infiltração vascular, perineural e variáveis de estadiamento locorregional). Amostras de 1,0 mm foram dispostas em micromatrizes teciduais (TMA) para pesquisa imuno-histoquímica das enzimas MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2, com detecção por sistema de polímeros curtos conjugados a peroxidase. Casos com resultados negativos ou incertos nas amostras de TMA tiveram repetidas as reações em secções convencionais. A associação entre o estado de expressão dos marcadores com variáveis clínicopatológicas foi avaliada através do teste do qui-quadrado ou exato de Fisher. O impacto dos parâmetros clínico-patológicos e estado de expressão das enzimas na sobrevida foi explorado em modelos uni e multivariados de Cox, com construção de curvas de Kaplan-Meyer. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas ao nível de p<0,05. RESULTADOS: Quarenta e cinco casos (33,6%) exibiram perda de expressão de ao menos uma enzima, sendo frequente a perda de duas (9/45: 20%), três (14/45:31,2%) ou quatro enzimas (7/45:15,5%). Anormalidade mais frequente ocorreu com o MLH1 (26,7%), seguida de MSH6 (23%), PMS2 (21%) e MSH2 (20,8%). Quando avaliadas em conjunto, houve correlação entre o estado de expressão de todos os possíveis pares, com destaque para MLH1/PMS2 (rho=0,467, p<0,001) e MSH2/MSH6 (rho=0,666, p<0,001). Perda de MLH1 associou-se a tipos I/II de Borrmann (p<0,001), fenótipo intestinal de Lauren (p=0,005), tubular/túbulo-papilífero (p=0,009), expansivo de Ming (p=0,027) e infiltração em muscular própria (p=0,011). Com relação a perda de MSH2, tipos I/II de Borrmann (p<0,001), padrões tubular/túbulo-papilífero (p=0,008), intestinal (p=0,001), expansivo (p=0,001), infiltração da muscular própria (p=0,025), reação desmoplásica ausente a discreta (p=0,021) e ausência de infiltração perineural (p=0,016) foram mais frequentes. Perda de MSH6 associou-se aos tipos macroscópicos de Borrmann e histológicos de Lauren, OMS e Ming (p<0,001) e ausência de infiltração perineural (p=0,036). Idade mais avançada (p=0,046), tipos I/II de Borrmann (p=0,002), padrão intestinal de Lauren (p=0,021) e menos frequente infiltração perineural (p=0,035) foram identificados nos casos com perda de PMS2. A co-negatividade para os pares MLH1/PMS2 e MSH2/MSH6, além de reproduzir as associações mencionadas, identificou infiltrado linfoplasmocitário intra/peritumoral acentuado (p=0,011 e p=0,013), reação estromal desmoplásica ausente a leve para MSH2/MSH6 (p=0,037) e tamanho maior do tumor primário para MLH1/PMS2 (p=0,021). Pior sobrevida associou-se ao sexo masculino (LogRank: 5,11, p=0,024), tamanho do tumor (3,98, p=0,046), tipos III/IV de Borrmann (4,75, p=0,029), histologia mucinosa/anel-de-sinete da OMS (8,61, p=0,003) e difuso (11,62, p=0,003), infiltração perineural (12,62, p<0,001), metástase linfonodal (23,25, p<0,001) e estadio TNM (35,60, p<0,001) em análises univariadas. Melhor sobrevida associou-se a perda de MLH1, MSH6 e PMS2 isoladamente (5,46, p=0,019; 6,08, p=0,014; 7,46, p=0,006) e dos pares MLH1/PMS2 (7,89, p=0,005) e MSH2/MSH6 (5,29, p=0,021). Em modelos multivariados compostos pelos parâmetros clínicopatológicos, apenas o sexo masculino (HR=2,42, p=0,047), tipo histológico difuso (4,94, p=0,037) e estadios II, IIIA e IV (2,23, p=0,088; 3,12, p=0,022; 33,24, p=0,005), constituíram variáveis independentes de determinação prognóstica. Nas análises multivariadas incluindo o estado de expressão das enzimas, evidenciou-se que as perdas de PMS2 e do par MLH1/PMS2 associaram-se significativamente a maior sobrevida (3,84, p=0,029 e 9,82, p=0,028).CONCLUSÕES: O presente estudo demonstra o valor da imunohistoquímica na identificação de alterações na expressão de enzimas MMR, sendo a mais frequentemente negativa a MLH1. A frequente co-negatividade aponta para a importância da dimerização na funcionalidade do sistema de reparo. A perda isolada destes marcadores, e especialmente do par MLH1/PMS2, define perfil clínico-patológico característico, permitindo avanços no conhecimento previamente atribuído a fenótipo microssatélite instável conforme determinado em métodos moleculares. Em análises multivariadas, o estado de expressão de PMS2 isoladamente ou do par MLH1/PMS2 constitui fator independente de determinação prognóstica / OBJECTIVES: To characterize immunoexpression profile of MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2 in gastric adenocarcinomas, exploring its performance to identify distinctive clinico-pathological features, as well as their prognostic implications in univariate and multivariate analyses. METHODS: A hundred and thirty three cases of locally advanced (pT2a or higher) sporadic gastric adenocarcinomas operated on Hospital das Clínicas/FMUSP were included due to absence of distant metastases at diagnosis (M0). Clinical (age, gender and survival) and pathological features (size, local, Borrmann´s type, histological type, vascular and perineural infiltration and locorregional staging parameters) were characterized. One millimeter samples were placed on tissue microarray blocks (TMA) and immunohistochemical detection of MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 performed on obtained sections, with revelation developed by peroxidase conjugated short-polymer based reagents. Negative or equivocal results obtained with TMA samples were repeated on conventional sections. Association between expression status for these markers and clinico-pathological features were evaluated by chisquare or Fisher´s exact test when appropriate. Impact of clinico-pathological features and expression status on disease specific survival were explored by Cox uni and multivariate models, with Kaplan-Meyer curves being fitted to illustrate these. All statistical results were considered significant at p<0,05. RESULTS: Forty five cases (33.6%) showed loss of at least one mismatchrepair enzyme, being frequent loss of two (9/45: 20%), three (14/45:31.2%) or even the four evaluated enzymes (7/45:15.5%). The most frequent abnormality addressed MLH1 (26.7%), followed by MSH6 (23%), PMS2 (21%) and MSH2 (20.8%). When analyses were performed in conjunction, correlation was identified for the expression status of all possible pairs, mainly the functional heterodimers MLH1/PMS2 (rho=0.467, p<0.001) and MSH2/MSH6 (rho=0.666, p<0.001). MLH1 loss was associated to Borrmann´s types I/I (p<0.001), Lauren´s intestinal phenotype (p=0.005), tubular/tubulo-papillary architecture (p=0.009), Ming´s expansile type (p=0.027) and infiltration limited by muscular propria (p=0.011). Among cases showing MSH2 loss, Borrmann´s I/I (p<0.001), tubular/tubulo-papillary (p=0.008), intestinal (p=0.001), expansile (p=0.001), muscular propria infiltration (p=0.025), absent to mild stromal desmoplasia (p=0.021) and absent perineural infiltration (p=0.016) were more frequent. MSH6 loss was associated to Borrmann´s gross type and Lauren, WHO and Ming´s histological types (p<0.001), as well as absent perineural infiltration (p=0.036). More advanced age (p=0.046), Borrmann´s types I/I (p=0.002), Lauren´s intestinal morphology (p=0.021) and less frequent perineural infiltration (p=0.035) were identified as associated to PMS2 loss. Conegativity for MLH1/PMS2 and MSH2/MSH6 pairs resumed all the above mentioned associations and additionally identified heavy lymphoplasmacytic infiltrate (p=0.011 e p=0.013), absent to mild stromal desmoplasia for MSH2/MSH6 (p=0.037) and increased primary tumor size for MLH1/PMS2 (p=0.021). In univariate analyses, decreased disease-specific survival was associated to male gender (LogRank: 5.11, p=0.024), tumor size (3.98, p=0.046), Borrmann´s types III/IV (4.75, p=0.029), mucinous/signet-ring cell morphology according to WHO (8.61, p=0.003) and Lauren´s diffuse morphology (11.62, p=0.003), perineural infiltration (12.62, p<0.001), lymph node metastases (23.25, p<0.001) and TNM staging (35.60, p<0.001). Better survival was seen in cases showing loss of MLH1, MSH6 and PMS2 when individually analyzed (5.46, p=0.019; 6.08, p=0.014; 7.46, p=0.006), as well as MLH1/PMS2 (7.89, p=0.005) and MSH2/MSH6 heterodimeric pairs (5.29, p=0.021). In multivariate models addressing clinico-pathological features, only male gender (HR=2.42, p=0.047), diffuse histological type (4.94, p=0.037) and stages II, IIIA and IV (2.23, p=0.088; 3.12, p=0.022; 33.24, p=0.005, respectively) were independent prognostic features. Multivariate analyses including status of MMR enzymes and the most significant clinicopathological features disclosed that PMS2 and MLH1/PMS2 losses were independent predictors of increased disease-specific survival (3.84, p=0.029 e 9.82, p=0.028). CONCLUSIONS: The present study demonstrates immunohistochemical detection of mismatch-repair enzymes as a tool to identify losses of these markers, being the most frequently negative MLH1. The frequently observed co-negativity points toward the importance of heterodimerization of these proteins in functional activity of mismatch-repair system. Losses of these markers, mainly MLH1/PMS2 pair, define a distinctive clinico-pathological profile and add knowledge to the previously reported associations with microsatellite instability as defined by molecular approach. In multivariate analyses, expression status of PMS2, as well as MLH1/PMS2 pair, revealed independent prognostic impact on diseasespecific survival

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T16:42:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Viana_DaniloVilela_D.pdf: 5689445 bytes, checksum: ecee0316f70f957068dbfd39107b9161 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Há muito tempo reconhece-se a importância de fatores hereditários na oncogênese. Dentre os genes associados ao câncer, um importante grupo é formado por aqueles direta ou indiretamente relacionados ao reparo do DNA, entre os quais está um grupo de genes pertencentes ao sistema de reparo de erros de pareamento de bases do DNA (mismatch repair - MMR), do qual fazem parte hMLH1, hMSH2, hMSH6 e hPMS2. Quando mutações monoalélicas nesses genes são herdadas, elas são responsáveis pela síndrome de Lynch, que cursa com predisposição ao câncer de cólon e endométrio, entre outros, geralmente na terceira ou quarta década de vida. A ocorrência de câncer na infância ou de tumores hematológicos não é comum na síndrome de Lynch. Nos últimos anos, entretanto, foram relatados diversos casos de pacientes que, na primeira ou segunda década de vida, apresentam tumores de sistema nervoso central, gastrintestinais, hematológicos, alguns deles com manifestações cutâneas semelhantes à neurofibromatose tipo 1. Nesses pacientes, foram identificadas mutações bialélicas nos genes do sistema MMR. O presente estudo propôs-se a analisar os tecidos tumorais de uma série retrospectiva de pacientes de zero a 35 anos de idade (inclusive), com diagnóstico de câncer de sistema nervoso central, visando a identificação de pacientes com mutações bialélicas nos genes do sistema MMR e a caracterização de seu quadro clínico. Teve por objetivos específicos: identificar os casos com instabilidade de microssatélites (MSI); determinar a proporção de tumores instáveis e o genótipo para os genes do sistema MMR nos casos que foram instáveis; correlacionar as mutações encontradas com o fenótipo e história familial. Um total de 79 pacientes foram incluídos no estudo. O diagnóstico era de glioma em 42 e meduloblastoma em 37. Inicialmente foi realizada a pesquisa de MSI nos tumores de todos os pacientes, seguido de avaliação clínica e coleta de sangue para pesquisa de mutações deletérias nos genes do sistema MMR, naqueles que apresentavam instabilidade. Foi encontrada baixa MSI (MSI-L) em sete casos de glioma e oito casos de meduloblastoma. Esses pacientes foram convocados para avaliação quanto à história clínica, exame físico e história familial. Seis pacientes atenderam ao convite, foram avaliados e tiveram sequenciamento e pesquisa de deleções por meio da técnica de MLPA realizados para os genes hMLH1, hMSH2, hMSH6. Não foram encontradas mutações deletérias em nenhum desses indivíduos. Procedeu-se, ainda, a determinação do intervalo de variação quase monomórfico para a população estudada, após o qual, cinco dos pacientes com diagnóstico de meduloblastoma, originalmente classificados como MSI-L, foram reclassificados como sendo estáveis (MSS). No presente estudo demonstrou-se que 8,3% dos pacientes com diagnóstico de meduloblastoma e 17,5% daqueles com gliomas possuíam MSI-L. A correlação do genótipo com o fenótipo e história familial não pôde ser realizada, visto não terem sido encontradas mutações deletérias. Sugere-se que sejam realizados estudos adicionais, preferencialmente prospectivos, para estabelecer a frequência de mutações nos genes do sistema MMR em pacientes pediátricos e adultos jovens com tumores de sistema nervoso central e instabilidade de microssatélites, uma questão importante para o aconselhamento genético, e, possivelmente, para implantação de uma rotina de rastreamento com pesquisa de MSI nessa população de pacientes / Abstract: Lynch syndrome (LS) is an autosomal dominant hereditary cancer predisposition disorder characterized by early onset of cancer (mean age, approximately 40-45 years), especially edometrium and/or colorectal cancer in the absence of gastrointestinal polyposis, and which, in addition, shows increased frequency of carcinomas of the ovary, small intestine, ureter, renal pelvis, stomach, among others. Its molecular hallmark is a type of genetic instability known as miscrosattelite instability (MSI) that affects short sequences of DNA repeats (miscrosattelites) found throughout the genome, leading to accumulation of genetic alterations. In LS, Cancer predisposition is due almost exclusively to heterozygous germline mutations in one of the DNA MMR genes (hMSH2, hMLH1, hPMS1, hPMS2, and hMSH6). Childhood cancers and hematological neoplasia generally do not belong to the Lynch tumour spectrum. However, over the past few years there have been reports of children that have presented with the constellation of early onset gastrointestinal cancers, along with features of neurofibromatosis type-1 and/or hematologic malignancies, and/or neurological tumors due to homozygous mutations in the mismatch repair genes. The present study analyzed a retrospective series of central nervous system tissue from patients with 0 to 35 years of age, with the aim to identify biallelic mutations in MMR genes and characterization of its clinical tumor spectrum. The aims of this study were to analyze: the frequency of microsattelite instability in tumors; the genotype and the frequency of germline mutations in MMR genes in patients who had MSI; its correlation to the phenotype and family history. A total of 42 gliomas and 37 medulloblastomas were analyzed. Initially, they were screened for microsatellite instability (MSI), followed by clinical evaluation, family history taking and sequence analysis of DNA obtained from blood lymphocytes. Low MSI (MSI-L) was found in seven gliomas and eight meduloblastomas. These patients were invited for clinical examination, family history taking and blood drawing. Six attended the clinical evaluation and had their sequence analysis done for hMLH1, hMSH2, hMSH6. No deleterious mutations were found among these patients. In adition, the quasi-monomorphic variation range was determined for this population, a important step previously not investigated in Brazilian population, that showed that with the proper values for the target population, 5 from the original MSI-L medulloblastomas were reclassified as stable (MSS). In clonclusion, the present study showed that 8,3% of the medulloblastomas and 17,5% of gliomas had MSI-L. The correlation of the genotype with clinical characteristics and family history could not be done, as no deleterious mutations were found. It was suggestd that new prospective studies are necessary to properly address the issue of the frequency of biallelic mutations in pediatric and young adults patients with MSI-L tumors of the CNS / Doutorado / Genetica Medica / Doutor em Ciências Médicas

OBJETIVOS: Caracterizar o perfil de imunoexpressão de MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2 em adenocarcinomas gástricos, explorando seu desempenho na identificação de características clínicas e patológicas, bem como sua influência prognóstica isolada e em relação aos demais parâmetros. MÉTODOS: Cento e trinta e três casos de adenocarcinomas gástricos esporádicos localmente avançados (pT2a ou mais) operados no Hospital das Clínicas/FMUSP foram incluídos pela ausência de metástases a distância ao diagnóstico (M0) e caracterizados clínica (idade, sexo e sobrevida) e patologicamente (tamanho, local, tipo de Borrmann, tipo histológico, infiltração vascular, perineural e variáveis de estadiamento locorregional). Amostras de 1,0 mm foram dispostas em micromatrizes teciduais (TMA) para pesquisa imuno-histoquímica das enzimas MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2, com detecção por sistema de polímeros curtos conjugados a peroxidase. Casos com resultados negativos ou incertos nas amostras de TMA tiveram repetidas as reações em secções convencionais. A associação entre o estado de expressão dos marcadores com variáveis clínicopatológicas foi avaliada através do teste do qui-quadrado ou exato de Fisher. O impacto dos parâmetros clínico-patológicos e estado de expressão das enzimas na sobrevida foi explorado em modelos uni e multivariados de Cox, com construção de curvas de Kaplan-Meyer. Todas as análises estatísticas foram consideradas significativas ao nível de p<0,05. RESULTADOS: Quarenta e cinco casos (33,6%) exibiram perda de expressão de ao menos uma enzima, sendo frequente a perda de duas (9/45: 20%), três (14/45:31,2%) ou quatro enzimas (7/45:15,5%). Anormalidade mais frequente ocorreu com o MLH1 (26,7%), seguida de MSH6 (23%), PMS2 (21%) e MSH2 (20,8%). Quando avaliadas em conjunto, houve correlação entre o estado de expressão de todos os possíveis pares, com destaque para MLH1/PMS2 (rho=0,467, p<0,001) e MSH2/MSH6 (rho=0,666, p<0,001). Perda de MLH1 associou-se a tipos I/II de Borrmann (p<0,001), fenótipo intestinal de Lauren (p=0,005), tubular/túbulo-papilífero (p=0,009), expansivo de Ming (p=0,027) e infiltração em muscular própria (p=0,011). Com relação a perda de MSH2, tipos I/II de Borrmann (p<0,001), padrões tubular/túbulo-papilífero (p=0,008), intestinal (p=0,001), expansivo (p=0,001), infiltração da muscular própria (p=0,025), reação desmoplásica ausente a discreta (p=0,021) e ausência de infiltração perineural (p=0,016) foram mais frequentes. Perda de MSH6 associou-se aos tipos macroscópicos de Borrmann e histológicos de Lauren, OMS e Ming (p<0,001) e ausência de infiltração perineural (p=0,036). Idade mais avançada (p=0,046), tipos I/II de Borrmann (p=0,002), padrão intestinal de Lauren (p=0,021) e menos frequente infiltração perineural (p=0,035) foram identificados nos casos com perda de PMS2. A co-negatividade para os pares MLH1/PMS2 e MSH2/MSH6, além de reproduzir as associações mencionadas, identificou infiltrado linfoplasmocitário intra/peritumoral acentuado (p=0,011 e p=0,013), reação estromal desmoplásica ausente a leve para MSH2/MSH6 (p=0,037) e tamanho maior do tumor primário para MLH1/PMS2 (p=0,021). Pior sobrevida associou-se ao sexo masculino (LogRank: 5,11, p=0,024), tamanho do tumor (3,98, p=0,046), tipos III/IV de Borrmann (4,75, p=0,029), histologia mucinosa/anel-de-sinete da OMS (8,61, p=0,003) e difuso (11,62, p=0,003), infiltração perineural (12,62, p<0,001), metástase linfonodal (23,25, p<0,001) e estadio TNM (35,60, p<0,001) em análises univariadas. Melhor sobrevida associou-se a perda de MLH1, MSH6 e PMS2 isoladamente (5,46, p=0,019; 6,08, p=0,014; 7,46, p=0,006) e dos pares MLH1/PMS2 (7,89, p=0,005) e MSH2/MSH6 (5,29, p=0,021). Em modelos multivariados compostos pelos parâmetros clínicopatológicos, apenas o sexo masculino (HR=2,42, p=0,047), tipo histológico difuso (4,94, p=0,037) e estadios II, IIIA e IV (2,23, p=0,088; 3,12, p=0,022; 33,24, p=0,005), constituíram variáveis independentes de determinação prognóstica. Nas análises multivariadas incluindo o estado de expressão das enzimas, evidenciou-se que as perdas de PMS2 e do par MLH1/PMS2 associaram-se significativamente a maior sobrevida (3,84, p=0,029 e 9,82, p=0,028).CONCLUSÕES: O presente estudo demonstra o valor da imunohistoquímica na identificação de alterações na expressão de enzimas MMR, sendo a mais frequentemente negativa a MLH1. A frequente co-negatividade aponta para a importância da dimerização na funcionalidade do sistema de reparo. A perda isolada destes marcadores, e especialmente do par MLH1/PMS2, define perfil clínico-patológico característico, permitindo avanços no conhecimento previamente atribuído a fenótipo microssatélite instável conforme determinado em métodos moleculares. Em análises multivariadas, o estado de expressão de PMS2 isoladamente ou do par MLH1/PMS2 constitui fator independente de determinação prognóstica / OBJECTIVES: To characterize immunoexpression profile of MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2 in gastric adenocarcinomas, exploring its performance to identify distinctive clinico-pathological features, as well as their prognostic implications in univariate and multivariate analyses. METHODS: A hundred and thirty three cases of locally advanced (pT2a or higher) sporadic gastric adenocarcinomas operated on Hospital das Clínicas/FMUSP were included due to absence of distant metastases at diagnosis (M0). Clinical (age, gender and survival) and pathological features (size, local, Borrmann´s type, histological type, vascular and perineural infiltration and locorregional staging parameters) were characterized. One millimeter samples were placed on tissue microarray blocks (TMA) and immunohistochemical detection of MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 performed on obtained sections, with revelation developed by peroxidase conjugated short-polymer based reagents. Negative or equivocal results obtained with TMA samples were repeated on conventional sections. Association between expression status for these markers and clinico-pathological features were evaluated by chisquare or Fisher´s exact test when appropriate. Impact of clinico-pathological features and expression status on disease specific survival were explored by Cox uni and multivariate models, with Kaplan-Meyer curves being fitted to illustrate these. All statistical results were considered significant at p<0,05. RESULTS: Forty five cases (33.6%) showed loss of at least one mismatchrepair enzyme, being frequent loss of two (9/45: 20%), three (14/45:31.2%) or even the four evaluated enzymes (7/45:15.5%). The most frequent abnormality addressed MLH1 (26.7%), followed by MSH6 (23%), PMS2 (21%) and MSH2 (20.8%). When analyses were performed in conjunction, correlation was identified for the expression status of all possible pairs, mainly the functional heterodimers MLH1/PMS2 (rho=0.467, p<0.001) and MSH2/MSH6 (rho=0.666, p<0.001). MLH1 loss was associated to Borrmann´s types I/I (p<0.001), Lauren´s intestinal phenotype (p=0.005), tubular/tubulo-papillary architecture (p=0.009), Ming´s expansile type (p=0.027) and infiltration limited by muscular propria (p=0.011). Among cases showing MSH2 loss, Borrmann´s I/I (p<0.001), tubular/tubulo-papillary (p=0.008), intestinal (p=0.001), expansile (p=0.001), muscular propria infiltration (p=0.025), absent to mild stromal desmoplasia (p=0.021) and absent perineural infiltration (p=0.016) were more frequent. MSH6 loss was associated to Borrmann´s gross type and Lauren, WHO and Ming´s histological types (p<0.001), as well as absent perineural infiltration (p=0.036). More advanced age (p=0.046), Borrmann´s types I/I (p=0.002), Lauren´s intestinal morphology (p=0.021) and less frequent perineural infiltration (p=0.035) were identified as associated to PMS2 loss. Conegativity for MLH1/PMS2 and MSH2/MSH6 pairs resumed all the above mentioned associations and additionally identified heavy lymphoplasmacytic infiltrate (p=0.011 e p=0.013), absent to mild stromal desmoplasia for MSH2/MSH6 (p=0.037) and increased primary tumor size for MLH1/PMS2 (p=0.021). In univariate analyses, decreased disease-specific survival was associated to male gender (LogRank: 5.11, p=0.024), tumor size (3.98, p=0.046), Borrmann´s types III/IV (4.75, p=0.029), mucinous/signet-ring cell morphology according to WHO (8.61, p=0.003) and Lauren´s diffuse morphology (11.62, p=0.003), perineural infiltration (12.62, p<0.001), lymph node metastases (23.25, p<0.001) and TNM staging (35.60, p<0.001). Better survival was seen in cases showing loss of MLH1, MSH6 and PMS2 when individually analyzed (5.46, p=0.019; 6.08, p=0.014; 7.46, p=0.006), as well as MLH1/PMS2 (7.89, p=0.005) and MSH2/MSH6 heterodimeric pairs (5.29, p=0.021). In multivariate models addressing clinico-pathological features, only male gender (HR=2.42, p=0.047), diffuse histological type (4.94, p=0.037) and stages II, IIIA and IV (2.23, p=0.088; 3.12, p=0.022; 33.24, p=0.005, respectively) were independent prognostic features. Multivariate analyses including status of MMR enzymes and the most significant clinicopathological features disclosed that PMS2 and MLH1/PMS2 losses were independent predictors of increased disease-specific survival (3.84, p=0.029 e 9.82, p=0.028). CONCLUSIONS: The present study demonstrates immunohistochemical detection of mismatch-repair enzymes as a tool to identify losses of these markers, being the most frequently negative MLH1. The frequently observed co-negativity points toward the importance of heterodimerization of these proteins in functional activity of mismatch-repair system. Losses of these markers, mainly MLH1/PMS2 pair, define a distinctive clinico-pathological profile and add knowledge to the previously reported associations with microsatellite instability as defined by molecular approach. In multivariate analyses, expression status of PMS2, as well as MLH1/PMS2 pair, revealed independent prognostic impact on diseasespecific survival