Le nombre d’enfants nés par Assistance Médicale à la Procréation (AMP) dans le monde est estimé à plus de 5 millions, représentant jusqu’à 4% des naissances. Environ 10% des couples en âge de procréer sont actuellement infertiles, et leur apporter des techniques pour devenir parents est devenu un problème de santé publique. Cependant, l’innocuité de ces techniques n’a pas été totalement démontrée. Notamment, le risque de pathologies d’origine placentaire pourrait être augmenté. De plus, des issues périnatales défavorables, un risque majoré de malformations majeures et de pathologies liées à l’empreinte ont été rapportés chez ces enfants. Ceci soulève la question d’une éventuelle vulnérabilité épigénétique induite par l’AMP. L’objectif de ce travail de thèse était d’étudier la régulation épigénétique des gènes soumis à empreinte (GSE) et des éléments transposables (TE) dans le placenta et le sang de cordon d’enfants conçus par AMP comparés à des enfants conçus naturellement. En guise d’introduction, nous avons rédigé une revue détaillée des modifications phénotypiques et épigénétiques induites par l’AMP dans les embryons, le placenta et le sang de cordon chez l’Homme et sur les modèles animaux.Au cours de cette thèse, une cohorte de presque 250 patientes a été incluse prospectivement, répartie en 4 groupes de patientes selon la technique d’AMP et 4 groupes de témoins selon la durée d’infertilité.A partir de cette cohorte, la première question posée a été l’effet de la Fécondation in vitro (FIV) sur la méthylation de l’ADN et/ou la transcription des GSE et TE dans le sang de cordon et le placenta à la naissance. Pour cela, nous avons sélectionné 51 patientes enceintes après FIV avec ou sans ICSI avec transfert d’embryon frais à J2 et les avons comparées à 48 témoins enceintes dans l’année après l’arrêt de la contraception. Nous avons étudié la méthylation de l’ADN et l’expression de 3 GSE et 4 TE. Les niveaux de méthylation de l’ADN placentaire pour H19/IGF2, KCNQ1OT1, LINE-1 et ERVFRD-1 et le niveau d’expression placentaire d’ERVFRD-1 étaient plus bas dans le groupe FIV/ICSI que dans le groupe contrôle. Ces modifications épigénétiques pourraient faire partie des mécanismes de compensation développés pendant la grossesse après AMP, comme discuté dans notre revue.Ensuite, nous avons voulu déterminer si ces changements de méthylation de l’ADN des GSE pouvaient être associés à des modifications des histones. A partir de la cohorte précédente, nous avons sélectionné 16 patientes du groupe FIV/ICSI avec des niveaux de méthylation dans le placenta inférieurs au 5ème percentile pour au moins un des GSE étudiés. Elles ont été appariées à 16 témoins sur la parité, le sexe du nouveau-né et l’âge gestationnel à l’accouchement. Des marques permissives (H3K4me2 et me3 et H3K9ac) et répressives (H3K9me2 et me3) ont été étudiées. Les résultats ont révélé une quantité significativement augmentée de H3K4me2 dans le groupe FIV/ICSI pour H19/IGF2 et KCNQ1OT1. La quantité des deux marques répressives pour H19/IGF2 et SNURF était significativement abaissée dans le groupe FIV/ICSI.Ces données montrent que l’hypométhylation de l’ADN au niveau des GSE pourrait être associée à une augmentation des marques permissives et une diminution des marques répressives des histones, ce qui permettrait de favoriser un état « actif » de la chromatine au niveau de l’allèle normalement réprimé.Nos résultats, ainsi que les données de la littérature, renforcent l’hypothèse de potentiels mécanismes mis en place dans le placenta après AMP, utiles pour compenser des anomalies précoces de la placentation, qui seraient écrits à travers des modifications épigénétiques comme la méthylation de l’ADN mais aussi les modifications des histones.Bien que certaines questions restent en suspens, cette thèse a permis de bâtir les fondations de travaux futurs, notamment pour étudier l’impact de la congélation/décongélation des embryons et le rôle joué par l’infertilité en elle-même. / It is estimated that more than five million children have been born by Assisted Reproductive Technologies (ART) worldwide, representing up to 4% of all births. As around 10% of reproductive-aged couples are currently infertile, providing them with treatment options is a public health issue. However, the safety of these techniques has not been fully demonstrated. Notably, the rate of placenta-related adverse pregnancy outcomes could be increased after ART. Moreover, adverse perinatal outcomes, a higher risk of major malformations and imprinting disorders have also been reported in children born following ART. These issues combined raise the question of a potential ART-induced epigenetic vulnerability.The aim of this thesis was to investigate the epigenetic regulation of imprinted genes (IGs) and transposable elements (TEs) in the placenta and cord blood of children conceived by ART and to compare them to children conceived naturally.By way of introduction, we wrote a comprehensive review about phenotypic and epigenetic modifications induced by ART in embryos, placenta and cord blood either in human or animal models.Then, an extensive cohort of almost 250 patients was prospectively included, resulting in 4 groups of ART techniques and 4 groups of controls stratified on the time to pregnancy.From this cohort, the first question we investigated was the effect of in vitro fertilization (IVF) on DNA methylation and/or transcription of TEs and IGs in cord blood and placenta collected at birth. For this purpose, we selected 51 pregnant women after IVF with fresh embryo transfer at day -2 and compared them with 48 controls pregnant within 1 year of stopping contraception. We studied the DNA methylation and expression of 3 imprinted DMRs and 4 TEs. DNA methylation levels for H19/IGF2 and KCNQ1OT1 DMRs, LINE-1 and ERVFRD-1 in the placenta were lower in the IVF/ICSI group than in the control group. The expression level of ERVFRD-1 in the placenta was also lower in the IVF/ICSI group than in the control group. These modifications in epigenetic regulation may influence some compensation mechanisms developed throughout pregnancy after ART, as discussed in our review.We then intended to determine if these DNA methylation changes in IGs were associated with histone modifications. From the previously mentioned cohort, we selected the 16 patients from the IVF/ICSI group who presented with below the 5th percentile of percentage placenta DNA methylation for at least one of the previously studied DMRs. These patients were compared with 16 controls matched for parity, new-born sex, and gestational age at delivery. Permissive (H3K4me2 and me3 and H3K9ac) and repressive (H3K9me2 and me3) histone marks were studied. The results revealed a significantly higher quantity of H3K4me2 in the IVF/ICSI group than in the natural conception group for H19/IGF2 and KCNQ1OT1 DMRs. The quantity of both repressive marks at H19/IGF2 and SNURF DMRs was significantly lower in the IVF/ICSI group than in the natural conception group.These data demonstrate that DNA hypomethylation at imprinted DMRs may be associated with an increase in permissive histone marks and a decrease in repressive histone marks. This is consistent with a more “active” chromatin conformation on the normally repressed allele.Our findings, together with the literature data, reinforce the hypothesis that some mechanisms are established in the placenta after ART, probably to mediate placental plasticity and compensate primary disorders in trophoblastic invasion, and written through epigenetic changes such as DNA methylation but also histone modifications.Although some questions remain unanswered, this thesis paves the way for further original studies, notably to assess the impact of frozen-thawed embryo transfer and to decipher the role of infertility per se.

Despite being found in all presently sequenced genomes, the evolution of tandemly repeated sequences has only just begun to be understood. We can represent the duplication history of tandemly repeated sequences with duplication trees. Most phylogenetic techniques need to be modified to be used on duplication trees. Due to gene loss, it is not always possible to reconstruct the duplication history of a tandemly repeated sequence. This thesis addresses this problem by providing a polynomial-time locally optimal algorithm to reconstruct the duplication history of a tandemly repeated sequence in the presence of gene loss. Supertree methods cannot be directly applied to duplication trees. A polynomial-time algorithm that takes a forest of ordered phylogenies and looks for a super duplication tree is presented. If such a super duplication tree is found then the algorithm constructs the super duplication tree. However, the algorithm does not always find a super duplication tree when one exists. The SPR topological rearrangement in its current form cannot be used on duplication trees. The necessary modifications are made to an agreement forest so that the SPR operation can be used on duplication trees. This operation is called the duplication rooted subtree prune and regraft operation (DrSPR). The size of the DrSPR neighbourhood is calculated for simple duplication trees and the tree shapes that maximize and minimize this are given.

L’instabilité des séquences répétées microsatellites du génome (courtes répétitions en tandem d’un à cinq nucléotides) est une conséquence de l’inactivation du système MMR (MisMatch Repair), en charge de la réparation des erreurs produites au cours de la réplication de l’ADN. Cette instabilité est associée à un processus de transformation cellulaire original, observé chez l’homme dans des pathologies tumorales fréquentes, nommées MSI (pour Microsatellite Instability). Les localisations primaires les plus fréquentes de ces tumeurs sont le côlon, l’endomètre et l’estomac. Elles peuvent avoir une origine héréditaire (prédisposition familiale ; syndrome de Lynch et apparentés), mais sont dans la majorité des cas de survenue sporadique. La transformation des cellules MMR-déficientes s’observe dans le contexte de l’accumulation de nombreuses mutations somatiques dans l’ADN tumoral. Certaines ont un caractère oncogénique en favorisant la troncature et la perte de fonction de gènes suppresseurs de tumeur ou apparentés, impliqués dans des voies de signalisations diverses et qui contiennent des microsatellites codants (mutations indels d’une à deux paires de base, décalant le cadre de lecture, fréquemment rapportées dans ces tumeurs). Les travaux présentés dans le cadre de mon doctorat visent à mieux comprendre le rôle de l’instabilité microsatellitaire dans la tumorigenèse MSI. Ils s’inscrivent dans le contexte du décryptage et de l’analyse des données de séquençage d’exome de 47 cancers colorectaux primitifs MSI. Dans le contexte d’un niveau élevé d’instabilité génomique caractérisant ces tumeurs, la mise au point par mon laboratoire d’accueil de modèles probabilistes a permis de dresser une liste restreinte de gènes, remarquables par le fait qu’ils sont affectés par des mutations somatiques dont les fréquences sont exceptionnellement élevées ou basses dans l’ADN tumoral. Sous l’hypothèse que de tels évènements somatiques affectent des gènes clés de la tumorigenèse MSI colique, j’ai focalisé mes recherches sur les gènes dont les altérations sont peu fréquentes. Brièvement, j’ai pu démontrer le caractère délétère d’un petit nombre d’altérations microsatellitaires codantes dont la survenue semble soumise à une pression de sélection négative (N=13). Mes résultats indiquent que ces mutations semblent fragiliser le phénotype tumoral des cellules dans lesquelles elles surviennent, la perte de fonction des gènes qu’elles affectent conduisant à diverses conséquences délétères en fonction du gène candidat (e.g. sensibilisation à la mort cellulaire, perte des capacités proliférative et migratoire, ralentissement de la croissance tumorale). Ces résultats rapportent pour la première fois et à grande échelle, la sélection négative de mutations dans des tumeurs à forte instabilité génomique MSI. Ils ouvrent de nouvelles voies pour la compréhension de ce mode particulier de transformation cellulaire, et sont potentiellement d’intérêt pour la mise au point de thérapies personnalisées pour les patients. / Since the discovery of a link between mismatch repair (MMR) deficiency and cancer, microsatellite instability (MSI) is thought as a process underlying cell transformation and tumour progression and invasion. MSI tumours are a subset of frequent human neoplasms, both inherited and sporadic, associated with several primary locations (colon, stomach, endometrium…). In MMR-deficient cells, MSI generates hundreds of frameshift mutations in genes (MSI Target Genes, MSI-TGs) containing coding microsatellite sequences (e.g. -1/+1 bp, insertions/deletions, i.e. indels). Some of these mutations affect genes with a role in human carcinogenesis and are thus expected to promote the MSI-driven tumorigenic process. During my PhD, I aimed to decipher the role of MSI in colon tumorigenesis. I exploited exome-sequencing data available in my lab that were generated from the analysis of a series of 47 human MSI primary colorectal cancer (CRC). Through biostatistics analysis and mathematical models that we designed to interpret mutation rates in the context of the high background for instability characterizing MSI in CRC, we identified a few microsatellites containing genes coding mutations that were negatively selected in MSI colon tumours (N=13). Under the hypothesis that these events may have a negative impact in colon tumorigenesis, I demonstrated that the silencing of these MSI target genes (siRNA/shRNA) was deleterious for MSI cancer cells using in vitro and in vivo models (impairment of proliferation and/or migration and/or response to chemotherapy and/or tumour growth) (Jonchère*, Marisa*, Greene* et al., submitted).

Les plantes doivent assurer la protection de trois génomes localisés dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries. Si les mécanismes assurant la réparation de l’ADN nucléaire sont relativement bien compris, il n’en va pas de même pour celui des chloroplastes et des mitochondries. Or il est important de bien comprendre ces mécanismes puisque des dommages à l’ADN non ou mal réparés peuvent entraîner des réarrangements dans les génomes. Chez les plantes, de tels réarrangements dans l’ADN mitochondrial ou dans l’ADN chloroplastique peuvent conduire à une perte de vigueur ou à un ralentissement de la croissance. Récemment, notre laboratoire a identifié une famille de protéines, les Whirly, dont les membres se localisent au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Ces protéines forment des tétramères qui lient l’ADN monocaténaire et qui accomplissent de nombreuses fonctions associées au métabolisme de l’ADN. Chez Arabidopsis, deux de ces protéines ont été associées au maintien de la stabilité du génome du chloroplaste. On ignore cependant si ces protéines sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Notre étude chez Arabidopsis démontre que des cassures bicaténaires de l’ADN sont prises en charge dans les mitochondries et les chloroplastes par une voie de réparation dépendant de très courtes séquences répétées (de cinq à cinquante paires de bases) d’ADN. Nous avons également montré que les protéines Whirly modulent cette voie de réparation. Plus précisément, leur rôle serait de promouvoir une réparation fidèle de l’ADN en empêchant la formation de réarrangements dans les génomes de ces organites. Pour comprendre comment les protéines Whirly sont impliquées dans ce processus, nous avons élucidé la structure cristalline d’un complexe Whirly-ADN. Nous avons ainsi pu montrer que les Whirly lient et protègent l’ADN monocaténaire sans spécificité de séquence. La liaison de l’ADN s’effectue entre les feuillets β de sous-unités contiguës du tétramère. Cette configuration maintient l’ADN sous une forme monocaténaire et empêche son appariement avec des acides nucléiques de séquence complémentaire. Ainsi, les protéines Whirly peuvent empêcher la formation de réarrangements et favoriser une réparation fidèle de l’ADN. Nous avons également montré que, lors de la liaison de très longues séquences d’ADN, les protéines Whirly peuvent s’agencer en superstructures d’hexamères de tétramères, formant ainsi des particules sphériques de douze nanomètres de diamètre. En particulier, nous avons pu démontrer l’importance d’un résidu lysine conservé chez les Whirly de plantes dans le maintien de la stabilité de ces superstructures, dans la liaison coopérative de l’ADN, ainsi que dans la réparation de l’ADN chez Arabidopsis. Globalement, notre étude amène de nouvelles connaissances quant aux mécanismes de réparation de l’ADN dans les organites de plantes ainsi que le rôle des protéines Whirly dans ce processus. / Plants must protect the integrity of three genomes located respectively in the nucleus, the chloroplasts and the mitochondria. Although DNA repair mechanisms in the nucleus are the subject of multiple studies, little attention has been paid to DNA repair mechanisms in chloroplasts and mitochondria. This is unfortunate since mutations in the chloroplast or the mitochondrial genome can lead to altered plant growth and development. Our laboratory has identified a new family of proteins, the Whirlies, whose members are located in plant mitochondria and chloroplasts. These proteins form tetramers that bind single-stranded DNA and play various roles associated with DNA metabolism. In Arabidopsis, two Whirly proteins maintain chloroplast genome stability. Whether or not these proteins are involved in DNA repair has so far not been investigated. Our studies in Arabidopsis demonstrate that DNA double-strand breaks are repaired in both mitochondria and chloroplasts through a microhomology-mediated repair pathway and indicate that Whirly proteins affect this pathway. In particular, the role of Whirly proteins would be to promote accurate repair of organelle DNA by preventing the repair of DNA double-strand breaks by the microhomology-dependant pathway. To understand how Whirly proteins mediate this function, we solved the crystal structure of Whirly-DNA complexes. These structures show that Whirly proteins bind single-stranded DNA with low sequence specificity. The DNA is maintained in an extended conformation between the β-sheets of adjacent protomers, thus preventing spurious annealing with a complementary strand. In turn, this prevents formation of DNA rearrangements and favors accurate DNA repair. We also show that upon binding long ssDNA sequences, Whirly proteins assemble into higher order structures, or hexamers of tetramers, thus forming spherical particles of twelve nanometers in diameter. We also demonstrate that a lysine residue conserved among plant Whirly proteins is important for the stability of these higher order structures as well as for cooperative binding to DNA and for DNA repair. Overall, our study elucidates some of the mechanisms of DNA repair in plant organelles as well as the roles of Whirly proteins in this process.

Les plantes doivent assurer la protection de trois génomes localisés dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries. Si les mécanismes assurant la réparation de l’ADN nucléaire sont relativement bien compris, il n’en va pas de même pour celui des chloroplastes et des mitochondries. Or il est important de bien comprendre ces mécanismes puisque des dommages à l’ADN non ou mal réparés peuvent entraîner des réarrangements dans les génomes. Chez les plantes, de tels réarrangements dans l’ADN mitochondrial ou dans l’ADN chloroplastique peuvent conduire à une perte de vigueur ou à un ralentissement de la croissance. Récemment, notre laboratoire a identifié une famille de protéines, les Whirly, dont les membres se localisent au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Ces protéines forment des tétramères qui lient l’ADN monocaténaire et qui accomplissent de nombreuses fonctions associées au métabolisme de l’ADN. Chez Arabidopsis, deux de ces protéines ont été associées au maintien de la stabilité du génome du chloroplaste. On ignore cependant si ces protéines sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Notre étude chez Arabidopsis démontre que des cassures bicaténaires de l’ADN sont prises en charge dans les mitochondries et les chloroplastes par une voie de réparation dépendant de très courtes séquences répétées (de cinq à cinquante paires de bases) d’ADN. Nous avons également montré que les protéines Whirly modulent cette voie de réparation. Plus précisément, leur rôle serait de promouvoir une réparation fidèle de l’ADN en empêchant la formation de réarrangements dans les génomes de ces organites. Pour comprendre comment les protéines Whirly sont impliquées dans ce processus, nous avons élucidé la structure cristalline d’un complexe Whirly-ADN. Nous avons ainsi pu montrer que les Whirly lient et protègent l’ADN monocaténaire sans spécificité de séquence. La liaison de l’ADN s’effectue entre les feuillets β de sous-unités contiguës du tétramère. Cette configuration maintient l’ADN sous une forme monocaténaire et empêche son appariement avec des acides nucléiques de séquence complémentaire. Ainsi, les protéines Whirly peuvent empêcher la formation de réarrangements et favoriser une réparation fidèle de l’ADN. Nous avons également montré que, lors de la liaison de très longues séquences d’ADN, les protéines Whirly peuvent s’agencer en superstructures d’hexamères de tétramères, formant ainsi des particules sphériques de douze nanomètres de diamètre. En particulier, nous avons pu démontrer l’importance d’un résidu lysine conservé chez les Whirly de plantes dans le maintien de la stabilité de ces superstructures, dans la liaison coopérative de l’ADN, ainsi que dans la réparation de l’ADN chez Arabidopsis. Globalement, notre étude amène de nouvelles connaissances quant aux mécanismes de réparation de l’ADN dans les organites de plantes ainsi que le rôle des protéines Whirly dans ce processus. / Plants must protect the integrity of three genomes located respectively in the nucleus, the chloroplasts and the mitochondria. Although DNA repair mechanisms in the nucleus are the subject of multiple studies, little attention has been paid to DNA repair mechanisms in chloroplasts and mitochondria. This is unfortunate since mutations in the chloroplast or the mitochondrial genome can lead to altered plant growth and development. Our laboratory has identified a new family of proteins, the Whirlies, whose members are located in plant mitochondria and chloroplasts. These proteins form tetramers that bind single-stranded DNA and play various roles associated with DNA metabolism. In Arabidopsis, two Whirly proteins maintain chloroplast genome stability. Whether or not these proteins are involved in DNA repair has so far not been investigated. Our studies in Arabidopsis demonstrate that DNA double-strand breaks are repaired in both mitochondria and chloroplasts through a microhomology-mediated repair pathway and indicate that Whirly proteins affect this pathway. In particular, the role of Whirly proteins would be to promote accurate repair of organelle DNA by preventing the repair of DNA double-strand breaks by the microhomology-dependant pathway. To understand how Whirly proteins mediate this function, we solved the crystal structure of Whirly-DNA complexes. These structures show that Whirly proteins bind single-stranded DNA with low sequence specificity. The DNA is maintained in an extended conformation between the β-sheets of adjacent protomers, thus preventing spurious annealing with a complementary strand. In turn, this prevents formation of DNA rearrangements and favors accurate DNA repair. We also show that upon binding long ssDNA sequences, Whirly proteins assemble into higher order structures, or hexamers of tetramers, thus forming spherical particles of twelve nanometers in diameter. We also demonstrate that a lysine residue conserved among plant Whirly proteins is important for the stability of these higher order structures as well as for cooperative binding to DNA and for DNA repair. Overall, our study elucidates some of the mechanisms of DNA repair in plant organelles as well as the roles of Whirly proteins in this process.