DE LA TESIS:Desde la aparición de las quinolonas, las resistencias bacterianas a las mismas han evolucionado de forma paralela. Conforme han ido apareciendo nuevas moléculas con mayor capacidad bactericida y mejores parámetros farmacodinámicos y farmacocinéticos, también se han ido identificando nuevos y más sofisticados mecanismos de resistencia, que se han ido adaptando a las necesidades de cada momento. Es por ello que se hace necesaria una nueva metodología para el diseño y la síntesis de nuevos agentes antibacterianos con el objetivo de aumentar su potencia antibacteriana y, al mismo tiempo, disminuir la probabilidad de generar a corto plazo nuevos mecanismos de resistencia. Con este fin, es fundamental conocer todos los mecanismos de resistencia y cuál es, en detalle, su mecanismo de acción, para poder diseñar nuevas moléculas capaces de, manteniendo su capacidad bactericida, eludir dichos mecanismos.En esta tesis nos propusimos como objetivos fundamentales, en primer lugar, investigar las bases moleculares de los mecanismos de resistencia a quinolonas en bacterias Gram-negativas. En concreto, en Escherichia coli, Yersinia enterocolitica y Citrobacter freundii. Por otro lado, se llevaron a cabo cálculos de acoplamiento o "docking" mediante la utilización de programas informáticos con el fin de incrementar nuestros conocimientos respecto al modelo de interacción entra ADN-ADN girasa-quinolona, para de esta manera mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de resistencia a fluoroquinolonas asociados a las mutaciones más comúnmente encontradas en el gen gyrA. Finalmente, el último de los objetivos que nos propusimos fue el de diseñar, sintetizar y evaluar diferentes derivados de ciprofloxacino y norfloxacino con el fin de encontrar entre ellos alguno que tuviera la capacidad de interaccionar con la enzima ADN girasa, poseyendo ésta uno o dos cambios aminoacídicos en su subunidad A.

Resistance to antimicrobials is a well-known phenomenon leading to difficulties in the treatment of infectious diseases. The genetic determinants of such resistance are in general well understood: plasmids, transposons, insertion sequences and integrons are the most frequently related genetic elements. The word epigenetics refers to changes in the phenotype or in the gene expression caused by mechanisms other than underlying DNA sequence. In some cases these changes can remain for generations. Serratia marcescens is an enterobacterium characterized by its natural (intrinsic) resistance to most antibiotics. It is also a relevant opportunistic pathogen which has been involved in several pathologies such as urinary tract infections, prostheses infections, cellulitis, bacteremia and others. P. aeruginosa is a Gram-negative bacterium considered one of the major nosocomial pathogens worldwide. It causes several infections such as wound and burn infections as well as respiratory tract infections mostly affecting cystic fibrosis patients. An increasing prevalence of infections caused by multidrug-resistant (MDR) isolates has been reported in many countries and is actually a cause of concern. Both, P. aeruginosa and S. marcescens are relevant nosocomial pathogens. Some of the classic antimicrobials used to treat these pathogens are out-of-date and several of the new drugs available have already become targets for bacterial mechanism of resistance. Environmental conditions exert high pressure not only in the selection of genes encoding resistance to antibiotics or integron fixation in bacterial genomes or plasmids and other mobile elements transmission, but also in the expression of these potentialities that leads to resistance. Thus the role of epigenetics remains to be investigated. In addition it is well known that bacteria causing infections are naturally forming part of biofilms instead the planktonic way of life normally assumed to be in laboratory conditions. The aim of this thesis was the study of unconventional mechanisms of antimicrobial resistance contributing to MDR phenotypes in both S.marcescens and P. aeruginosa. Also the exploration of changes in antimicrobial susceptibilities of Serratia marcescens in the last 50 years by comparing isolates collected between 1945 and 1950, and current isolates. ¬The main conclusions obtained from this study are: 1. The resistome of Serratia marcescens did not change significantly during the antibiotic era. 2. Antibiotic withdrawing tends to restore original susceptible phenotypes, irrespective to the molecular mechanism involved in resistance. 3. None of Serratia strains studied presented integrons, any extended spectrum ß-lactamases. 4. Phenotypically determination of susceptibilities of old strains inactive during the last 60 years have confirmed results obtained by metagenomics i.e. the genes of resistance already existed before antibiotics discovery and use. 5. Multiresistant Pseudomonas aeruginosa harbored class 1 integrons containing a cassette encoding aminoglycoside adenylyltransferase (aadB). 6. Multiresistant Pseudomonas aeruginosa overexpressed MexAB-OprM and MexXY efflux machinery. 7. CCCP use should be avoided in experiments performed with P. aeruginosa and probably in other aerobic bacteria. 8. Meropenem induces the formation of aberrant long rods which can survive, accumulate less antibiotic than normal bacteria, and can revert to normal forma when antibiotic pressure disappears. 9. Colistin, the last therapeutic option to fight against Pseudomonas infections in cystic fibrosis patients, is normally active although cases of resistance have arisen recently. 10. Resistance to colistin seems to be mediated by lipopolysaccharide singular properties. 11. Colistin induces injuries in lipid bilayers, which can be studied by means of planar black lipid bilayer techniques. Preliminary results showed the ability of colistin to induce transient channels in the bilayers, with some dependence to voltage. 12. Recovery of susceptibility to imipenem is slower than acquision of resistance, since the selective advantage conferred by imipenem resistance in the presence of the antimicrobial is strong whereas OprD expression is likely evolutionarily advantageous only under certain and unknown environmental conditions. / Es van explorar els mecanismes no convencionals de resistència als agents antimicrobians que contribueixen a l’aparició de fenotips multiresistents en els bacteris Gram-negatius Serratia marcescens i Pseudomonas aeruginosa. Es van examinar també els canvis en la susceptibilitat als agents antimicrobians en S. marcescens durant els darrers 50 anys, comparant soques aïllades entre els anys 1945-1950 y soques actuals. ¬Les principals conclusions obtingudes d’aquest estudi són les següents: 1. El resistoma de Serratia marcescens no ha canviat significativament des de l’era pre-antibiòtica fins l’actualitat. 2. La retirada dels antibiòtics tendeix a recuperar els fenotips de susceptibilitat originals, independentment del mecanisme molecular implicat en la resistència. 3. Cap de las soques de Serratia estudiades va presentar integrons ni tampoc ß-lactamases d’espectre estès. 4. La determinació fenotípica de les susceptibilitats de las soques “antigues” de Serratia inactives durant 60 anys ha confirmat els resultats obtinguts mitjançant metagenòmica, és a dir, els gens de resistència als antibiòtics ja existien amb anterioritat al descobriment i ús dels antibiòtics. 5. En les soques clíniques de P. aeruginosa multiresistents es va detectar un integró de classe 1 que contenia el cassette gènic aadB, que codifica l’enzim aminoglicòsid 2’-O- adeniltransferasa, que confereix resistència a gentamicina, tobramicina i kanamicina. 6. Les soques multiresistents de P. aeruginosa van sobreexpressar els sistemes de reflux MexAB-OprM i MexXY-OprM. 7. L’ús de l’inhibidor de bombes de reflux CCCP s’hauria d’evitar als experiments realitzats amb P. aeruginosa i probablement amb altres bacteris de metabolisme aeròbic. 8. El meropenem indueix la formació de llargs bacils aberrants capaços de sobreviure en presència de l’antibiòtic. Aquests bacils acumulen menys antibiòtic que els bacteris normals, i poden revertir a la forma normal quan s’elimina la pressió selectiva. 9. La colistina, la última alternativa terapèutica per lluitar contra P. aeruginosa en pacients amb fibrosis quística, és normalment efectiva, encara que recentment han sorgit casos de resistència a aquest agent antimicrobià. 10. La resistència a colistina sembla estar causada per propietats singulars del lipopolisacàrid. 11. La colistina produeix danys en les membranes lipídiques que poden ser estudiats mitjançant tècniques de Black lipid bilayer. Estudis preliminars van mostrar la capacitat de la colistina para induir canals transitoris en les bicapes lipídiques, amb certa dependència de voltatge. 12. La recuperació de la susceptibilitat a l’imipenem en P. aeruginosa és més lenta que l’adquisició de resistència, donat que l’avantatge selectiva conferida per la resistència a l’imipenem en presència de l’agent antimicrobià és forta, mentre que l’expressió d’ OprD és probablement avantatjosa solament sota certes i desconegudes condicions ambientals. / Se exploraron los mecanismos no convencionales de resistencia a agentes antimicrobianos que contribuyen a la aparición de fenotipos multiresistentes en las bacterias Gram-negativas Serratia marcescens y Pseudomonas aeruginosa. Se examinaron también los cambios en la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos en S. marcescens en los últimos 50 años, comparando cepas aisladas entre los años 1945-1950 y cepas actuales. ¬Las principales conclusiones obtenidas de este estudio son las siguientes: 1. El resistoma de Serratia marcescens no ha cambiado significativamente desde la era pre-antibiótica hasta la actualidad. 2. La retirada de los antibióticos tiende a recuperar los fenotipos de susceptibilidad originales, independientemente del mecanismo molecular implicado en la resistencia. 3. Ninguna de las cepas de Serratia estudiadas presentó integrones ni tampoco ß-lactamasas de espectro extendido. 4. La determinación fenotípica de las susceptibilidades de las cepas “antiguas” de Serratia inactivas durante 60 años ha confirmado los resultados obtenidos mediante metagenómica, es decir, los genes de resistencia a los antibióticos ya existían con anterioridad al descubrimiento y uso de los antibióticos. 5. En las cepas clínicas de P. aeruginosa multiresistentes se detectó un integrón de clase 1 que contenía el cassette génico aadB, que codifica la enzima aminoglicósido 2’-O- adeniltransferasa, que confiere resistencia a gentamicina, tobramicina y kanamicina. 6. Las cepas multiresistentes de P. aeruginosa sobreexpresaron los sistemas de reflujo MexAB-OprM y MexXY-OprM. 7. El uso del inhibidor de bombas de reflujo CCCP se debería evitar en los experimentos realizados con P. aeruginosa y probablemente con otras bacterias de metabolismo aeróbico. 8. El meropenem induce la formación de largos bacilos aberrantes capaces de sobrevivir en presencia del antibiótico. Estos bacilos acumulan menos antibiótico que las bacterias normales, y pueden revertir a la forma normal cuando se elimina la presión selectiva. 9. La colistina, la última alternativa terapéutica para luchar contra P. aeruginosa en pacientes con fibrosis quística, es normalmente efectiva, aunque recientemente han surgido casos de resistencia a este agente antimicrobiano. 10. La resistencia a colistina parece estar mediada por propiedades singulares del lipopolisacárido. 11. La colistina produce daños en las membranas lipídicas que pueden ser estudiados mediante técnicas de Black lipid bilayer. Estudios preliminares mostraron la capacidad de la colistina para inducir canales transitorios en las bicapas lipídicas, con cierta dependencia de voltaje. 12. La recuperación de la susceptibilidad al imipenem en P. aeruginosa es más lenta que la adquisición de resistencia, dado que la ventaja selectiva conferida por la resistencia al imipenem en presencia del agente antimicrobiano es fuerte, mientras que la expresión de OprD es probablemente ventajosa sólo bajo ciertas y desconocidas condiciones ambientales.