Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-29T19:41:10Z No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-30T17:37:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-30T17:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Peptídeos antimicrobianos (PAM) são componentes do sistema imune inato da maioria dos seres vivos. Estas moléculas vêm despertando um crescente interesse como alternativas aos antibióticos clássicos, uma vez que podem apresentar atividade antimicrobiana potente contra um amplo espectro de microrganismos, inclusive contra microrganismos resistentes aos antimicrobianos disponíveis. Por mais dinâmica que sejam as indústrias farmacêuticas na busca por novos fármacos, é praticamente impossivel o mercado farmacêutico acompanhar o espantoso fenômeno da multirresistência apresentada por muitos microrganismos. Neste contexto, os PAMs surgem como uma alternativa farmacológica, pois podem ser usados isoladamente ou combinados entre si ou com outros antibióticos clássicos. Neste estudo foi avaliada a atividade antimicrobiana de dois peptídeos sintéticos e análogos denominados Pa-MAP 1.5 e Pa-MAP 1.9, derivados de um peptídeo do peixe Pleuronectes americanus. Os dois análogos tiveram sua homogeneidade e grau de pureza analisados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e posteriormente foram submetidos a ensaios antimicrobianos, isoladamente e em combinação, contra a bactéria Gram-negativa Klebsiella pneumoniae e avaliados também, com relação à sua atividade citotóxica Os resultados in vitro evidenciaram uma forte atividade sinérgica com CIM de 4/4g.ml-1, dos peptídeos, sendo que esta concentração não se mostrou citotóxica. Resultados dos testes In vivo, mostraram que a combinação de peptídeos foi eficiente, sendo observado um decréscimo notável de UFCs de K. pneumoniae no sangue bem como nos pulmões, de camundongos Black C57/bl6. Os animais foram tratados com os peptídeos combinados, inoculados por via intravenosa, utilizando concentrações de 36 mg.Kg-1, 18mg.Kg-1 e 9mg.Kg-1 para o peptídeo Pa-MAP 1.5; e para o peptídeo Pa-MAP 1.9 as doses utilizadas foram de 4mg.Kg-1, 2mg.Kg-1 e 1mg.Kg-1. Com o objetivo de entender como ocorre o acoplamento e a interação destes peptídeos, foram propostos modelos tridimensionais in silico através de modelagem molecular. Resultados das modelagens in silico sugerem uma estrutura em α-hélice anfipática, para ambos os peptídeos. Quando se realizou o acoplamento molecular dos peptídeos com uma membrana aniônica, os peptídeos conjugados 11 apresentaram uma alta taxa de afinidade, corroborando assim com os resultados experimentais in vitro e in vivo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial peptides (AMPs) are innate immune system components, which are present in several living organisms. This molecules interesting is growing as an alternative for traditional antibiotics due to their potent antimicrobial activities against a broad range of microorganisms including those resistant to classical antibiotics. In spite of pharmaceutical companies dynamism for new drugs discovery, have been virtually impossible to pharmaceutical market to keep up the amazing multidrug resistance phenomen shown by many microorganisms. By this way, antimicrobial peptides stand out as promising pharmacological alternatives, since they can be used alone or in combination to classic antibiotic. In this view, the present study characterized the activity of two synthetic analogues, named Pa-MAP 1.5 and Pa-MAP 1.9 from Pleuronectes americanus fish. Both analogs had the homogeinity and purity degree checked by MALDI-ToF mass spectrometry. Moreover, peptides were assayed according their antibacterial activity, alone and in combination against Gram-negative Klebsiella pneumonia as well as their hemolytic activity. Data in vitro assay demonstrate a strong synergistic activity between peptides, with MIC of 4/4g.ml-1. Nevertheless at this concentration they did not showed cytolytic effects. The in vivo results showed that peptides combination were capable to pronounced decrease K. pneumoniae’s UFCs in blood count, as well in black C57/bl6 mouse’s lung. The animals were treated with the combined peptides via intravenously using concentrations of 36 mg.Kg-1, 18 mg.Kg-1 and 9 mg.Kg-1 for Pa-MAP 1.5; and 4mg.Kg-1, 2mg.Kg-1 e 1mg.Kg-1 for Pa-MAP 1.9. In order to understand these peptides interact in silico three-dimensional models were constructed by molecular modeling. Results of in silico modeling suggest amphipathic α-helical structures for both peptides. When molecular peptide docking was performed with anionic membranes, conjugated peptides showed high affinity rates, thus corroborating with in vitro and in vivo data presented.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulo 2 e Apêndice I. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-18T18:32:08Z No. of bitstreams: 1 2016_DéboraFarageKnuppdosSantos_Parcial.pdf: 6708225 bytes, checksum: 0340ad0794bc4ae6a1b51344c09e8c3c (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-27T12:23:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DéboraFarageKnuppdosSantos_Parcial.pdf: 6708225 bytes, checksum: 0340ad0794bc4ae6a1b51344c09e8c3c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T12:23:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DéboraFarageKnuppdosSantos_Parcial.pdf: 6708225 bytes, checksum: 0340ad0794bc4ae6a1b51344c09e8c3c (MD5) / A resistência antimicrobiana tem sido uma grande ameaça à saúde humana, dada a disseminação de genes de resistência a antibióticos (ARGs) em patógenos e micro-organismos clinicamente importantes, promovendo o aparecimento de cepas multirresistentes de difícil tratamento, complicado também pela queda na quantidade de novos antibióticos lançados no mercado. Assim, pesquisas por determinantes genéticos da resistência a antibióticos em isolados clínicos têm sido intensificadas desde os primeiros relatos de resistência antimicrobiana no começo do século XX. Neste contexto, a diversidade ambiental dos ARGs vem sendo subestimada, apesar do conhecimento de que a origem destes genes são os ambientes naturais, em particular o solo. Os micro-organismos presentes nesses ambientes são, em sua maioria, ainda não cultiváveis e consequentemente desconhecidos, o que os torna importantes fontes de novos genes e biomoléculas de interesse biotecnológico. Entretanto, analisar sua totalidade depende de técnicas independentes de cultivo. A metagenômica apresenta-se como uma ferramenta importante, já que acessa os micro-organismos de uma dada amostra ambiental pela extração do seu DNA total, permitindo identificar genes de interesse por abordagem de sequência ou funcional. Na pesquisa por novos ARGs, a metagenômica funcional é de grande valia para identificar novos mecanismos de resistência antimicrobiana e inferir a real diversidade de ARGs no meio ambiente, além de investigar os papéis ecológicos destes genes fora do ambiente clínico. Em trabalho anterior, observou-se a presença de três genes para putativas dioxigenases em dois clones resistentes isolados de biblioteca metagenômica de pequenos insertos (com insertos de 3-8 Kb) construída com DNA de amostras de solo de Cerrado. Nesta Tese, apresentam-se dois capítulos: o primeiro aborda a hipótese de que as dioxigenases putativas estão associadas ao fenótipo resistente observado. Dessa forma, três subclones foram construídos e denominados AMX3(2), AMX3(3) e CRB2(1), para posteriores análises fenotípicas e estruturais, onde CRB2(1) mostrou-se capaz de causar resistência à carbenicilina em Escherichia coli – adicionalmente, também mostrou-se capaz de resistir à ação do fenol. Em análises estruturais e enzimáticas, inferiu-se que o inserto é uma extradioldioxigenase com domínio bicupina, sendo uma provável gentisato 1,2-dioxigenase (GDO). Estas enzimas são importantes no metabolismo de compostos aromáticos, o que as torna potenciais em processos de biorremediação. No segundo capítulo está descrita a análise das sequências de seis clones resistentes isolados de biblioteca metagenômica de grandes insertos (com insertos de mediana de 35 Kb), também construída com amostras de DNA de micro-organismos de solo de Cerrado. A anotação gênica somou um conjunto de dados de aproximadamente 0,27 Mb, num total de 172 prováveis genes. Tais ORFs foram agrupadas em oito diferentes classes, de acordo com funções selecionadas. Dentre elas, 1,2% eram referentes a enzimas previamente relacionadas à resistência antimicrobiana e 5,8% a transportadores, que também são importantes protagonistas na resistência a xenobióticos. Apesar da grande diversidade de funções observadas, a maior parte das ORFs foi anotada como hipotéticas, sendo fontes para descrição de possíveis novos ARGs, assim como de genes de interesse biotecnológico. Essas observações indicam que a diversidade de ARGs em ambientes naturais difere daquela classicamente encontrada em isolados clínicos, o que evidencia a importância em acessar micro-organismos ambientais na tentativa de revelar novos mecanismos de resistência a antibióticos, que vem a enriquecer o conhecimento sobre seus papéis ecológicos e auxiliar pesquisas das indústrias biotecnológicas, como na prospecção de antimicrobianos e em processos de biorremediação. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial resistance poses a grave threat to human health given the dissemination of antibiotic resistance genes (ARGs) in pathogens and in clinically important microorganisms, promoting the rise of multiresistant strains of difficult treatment, also aggravated by the decreasing quantity of new antimicrobials launched onto the market. Hence, since the first reports of antimicrobial resistance in the beginning of the 20th century, the research for the genetic determinants of antimicrobial resistance have been intensified. In this context, the environmental diversity of ARGs was underestimated, despite the knowledge that such genes are environmental-born, especially on the soil. The majority of environmental microorganisms are not yet cultivable and remain unknown, being an important source for novel genes and biomolecules of biotechnological interest. However, analyzing them requires culture independent techniques. Metagenomics rise as a powerful tool, since it access the microorganisms from an environmental sample by the extraction of their total DNA, allowing for the identification of genes of interest by sequence and functional approaches. In the search for new ARGs, functional metagenomics is a valuable method to identify novel mechanisms for antibiotic resistance and infer the actual diversity of environmental ARGs, while exploring their ecological roles outside the clinical setting. In a former work, three putative dioxigenase genes were observed in two resistant clones isolated from a small-insert metagenomic library (insert size 3-8 Kb) constructed with DNA samples from Cerrado soil. In this Thesis, two chapters are provided: the former addresses the hypothesis in which putative dioxygenases are involved in the resistant phenotype observed. In this manner, three subclones were constructed and named AMX3(2), AMX3(3) and CRB2(1), for further phenotypical and structural analysis, where CRB2(1) proved resistant to carbenicillin in Escherichia coli – additionally, it was also able to resist the action of phenol. In the structural and enzymatic assays, the insert was presupposed as an extradioldioxygenase with a bicupin domain, most probably a gentisate 1,2-dioxygenase (GDO). These are important enzymes on aromatic metabolism and potential resources in the bioremediation industry. The latter chapter describes the sequence analysis of six resistant clones isolated from a large-insert metagenomic library (insert size around 35 Kb), also constructed with DNA samples from Cerrado soil. Gene annotation comprised a 0.27 Mb dataset, summing 172 probable genes. Such ORFs were grouped in eight different classes, according to preselected functions. Within these, 1.2% were related to enzymatic mechanisms of resistance and 5.8% were classified as transporters, that also play important roles on xenobiotic resistance. Although a great diversity of functions were observed, a greater number of ORFs was classified as hypothetical, being sources for the description of novel ARGs as well as of other genes of biotechnological relevance. These observations imply that the diversity of environmental ARGs differ from that classically observed in clinical isolates, which shows the importance in accessing environmental microorganisms in the attempt to reveal new mechanisms to antibiotic resistance, which may enrich the knowledge on their ecological roles and aid biotechnological researches, such as in antimicrobial bioprospection and in bioremediation processes.

As bactérias do gênero Enterococcus spp. estão amplamente distribuídas na natureza, atuando como patógenos oportunistas e freqüentemente causam infecções em pacientes imunocomprometidos. Uma característica destes microrganismos é a resistência intrínseca a muitos dos antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infecções por cocos Gram positivos. Por outro lado, os Enterococos têm adquirido diferentes determinantes genéticos que conferem resistência a vários antimicrobianos. Este trabalho tem como objetivo determinar a freqüência da resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos (gentamicina), tetraciclina, bem como avaliar a diversidade genética das amostras, pesquisando os genes envolvidos na resistência, além de detectar o fator de virulência gelatinase em isolados clínicos e alimentares de Enterococcus spp. Os testes de suscetibilidade antimicrobiana dos 52 isolados de alimentos revelaram que 7,7% (n=4) apresentaram resistência somente à tetraciclina, 5,8% (n=3) foram resistentes somente a gentamicina e 28,9% (n=15) apresentaram resistência a ambos antimicrobianos. Nos 40 isolados clínicos, 42,5% (n=17) foram resistentes a tetraciclina, 20% (n=8) resistentes a gentamicina e 17,5% (n=7) foram resistentes a ambos antimicrobianos. A pesquisa de genes de resistência em isolados alimentares revelou que 90% (n=17) dos microrganismos resistentes a tetraciclina apresentaram o gen tet(M), e 100% das amostras resistentes a gentamicina apresentaram o gene aac(6’)-le-aph(2”)-Ia. Entretanto, 30% dos microrganismos sensíveis apresentaram algum dos genes de resistência. Nos isolados clínicos 95,8% (n=23) das amostras resistentes a tetraciclina apresentaram o gene tet(M) e 100% dos Enterococos resistentes a gentamicina apresentaram o gen aac(6’)-le-aph(2”)-Ia. No entanto, dos isolados que se mostraram sensíveis, 37,5% apresentaram algum dos genes de resistência analisados. Ainda, foi verificado que 78% (n=49) dos microrganismos isolados de alimentos hidrolisaram a gelatina, e somente 50% (n=20) dos isolados clínicos apresentaram a mesma atividade. / Bacteria of the Enterococcus spp. genus are widely distributed in the natural environment, Enterococci are opportunistic pathogens, and often are the causal agents of infections in immunosuppressed patients. One of the remarkable characteristics of these microorganisms is the intrinsic resistance they offer against several of the antimicrobial agents routinely prescribed in the treatment of Gram-positive cocci. On the other hand, enterococci have been proved to acquire different genetic markers that lend resistance to a variety of other antimicrobial ,searching the involved genes in the resistance, besides detecting the virulence factor gelatinase in isolated of Enterococcus spp. from foods and humans samples. This study aimed to determine the frequency of antimicrobial resistance against high concentrations of aminoglycosides (gentamicin), tetracycline, as well as assess the genetic diversity of microbial strains isolated from foods and humans. Antibiotic susceptibility tests of Enterococcus spp. isolated from food showed that of the 52 isolates, 7,7% (n=4) were tetracycline resistant, 5,8% (n=3) were resistant only the gentamicin and 28,9% (n=15) was resistant to both antibiotics. Already in 40 clinical samples 42,5% (n=17) of the samples were tetracycline resistant, 20% (n=8) were gentamicin resistant and 17,5% (n=7) were resistant to both antimicrobials. The research of genes of resistance in isolates from food disclosed that in 90% (n=17) of tetraciclyn resistant Enterococcus had the tet(M) gen, and 100% gentamicin resistant samples had aac(6')-le-aph(2")-Ia gene and 30% of the sensible microorganism had presented some of the resistance genes. Already in clinical isolates 95,8% (n=23) tetraciclyn resistant samples contained the tet(M) gene and 100% of the gentamicin resistant enterococcus had presented gen aac(6')-le-aph(2")-Ia; however 37,5% enterococcus sensible had presented some of the genes of resistance in research. In this work, also it was verified that 78% (n=49) of the foods isolates produced gelatinase, and 50% (n=20) of the clinical isolates demonstrated the capacity of degradation of the gelatin substrate.

As bactérias do gênero Enterococcus spp. estão amplamente distribuídas na natureza, atuando como patógenos oportunistas e freqüentemente causam infecções em pacientes imunocomprometidos. Uma característica destes microrganismos é a resistência intrínseca a muitos dos antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infecções por cocos Gram positivos. Por outro lado, os Enterococos têm adquirido diferentes determinantes genéticos que conferem resistência a vários antimicrobianos. Este trabalho tem como objetivo determinar a freqüência da resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos (gentamicina), tetraciclina, bem como avaliar a diversidade genética das amostras, pesquisando os genes envolvidos na resistência, além de detectar o fator de virulência gelatinase em isolados clínicos e alimentares de Enterococcus spp. Os testes de suscetibilidade antimicrobiana dos 52 isolados de alimentos revelaram que 7,7% (n=4) apresentaram resistência somente à tetraciclina, 5,8% (n=3) foram resistentes somente a gentamicina e 28,9% (n=15) apresentaram resistência a ambos antimicrobianos. Nos 40 isolados clínicos, 42,5% (n=17) foram resistentes a tetraciclina, 20% (n=8) resistentes a gentamicina e 17,5% (n=7) foram resistentes a ambos antimicrobianos. A pesquisa de genes de resistência em isolados alimentares revelou que 90% (n=17) dos microrganismos resistentes a tetraciclina apresentaram o gen tet(M), e 100% das amostras resistentes a gentamicina apresentaram o gene aac(6’)-le-aph(2”)-Ia. Entretanto, 30% dos microrganismos sensíveis apresentaram algum dos genes de resistência. Nos isolados clínicos 95,8% (n=23) das amostras resistentes a tetraciclina apresentaram o gene tet(M) e 100% dos Enterococos resistentes a gentamicina apresentaram o gen aac(6’)-le-aph(2”)-Ia. No entanto, dos isolados que se mostraram sensíveis, 37,5% apresentaram algum dos genes de resistência analisados. Ainda, foi verificado que 78% (n=49) dos microrganismos isolados de alimentos hidrolisaram a gelatina, e somente 50% (n=20) dos isolados clínicos apresentaram a mesma atividade. / Bacteria of the Enterococcus spp. genus are widely distributed in the natural environment, Enterococci are opportunistic pathogens, and often are the causal agents of infections in immunosuppressed patients. One of the remarkable characteristics of these microorganisms is the intrinsic resistance they offer against several of the antimicrobial agents routinely prescribed in the treatment of Gram-positive cocci. On the other hand, enterococci have been proved to acquire different genetic markers that lend resistance to a variety of other antimicrobial ,searching the involved genes in the resistance, besides detecting the virulence factor gelatinase in isolated of Enterococcus spp. from foods and humans samples. This study aimed to determine the frequency of antimicrobial resistance against high concentrations of aminoglycosides (gentamicin), tetracycline, as well as assess the genetic diversity of microbial strains isolated from foods and humans. Antibiotic susceptibility tests of Enterococcus spp. isolated from food showed that of the 52 isolates, 7,7% (n=4) were tetracycline resistant, 5,8% (n=3) were resistant only the gentamicin and 28,9% (n=15) was resistant to both antibiotics. Already in 40 clinical samples 42,5% (n=17) of the samples were tetracycline resistant, 20% (n=8) were gentamicin resistant and 17,5% (n=7) were resistant to both antimicrobials. The research of genes of resistance in isolates from food disclosed that in 90% (n=17) of tetraciclyn resistant Enterococcus had the tet(M) gen, and 100% gentamicin resistant samples had aac(6')-le-aph(2")-Ia gene and 30% of the sensible microorganism had presented some of the resistance genes. Already in clinical isolates 95,8% (n=23) tetraciclyn resistant samples contained the tet(M) gene and 100% of the gentamicin resistant enterococcus had presented gen aac(6')-le-aph(2")-Ia; however 37,5% enterococcus sensible had presented some of the genes of resistance in research. In this work, also it was verified that 78% (n=49) of the foods isolates produced gelatinase, and 50% (n=20) of the clinical isolates demonstrated the capacity of degradation of the gelatin substrate.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-06-22T14:53:35Z No. of bitstreams: 1 2017_NaraRúbiaSouza.pdf: 1094041 bytes, checksum: 5b066bd9df59cb7e71acf5c98349863b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-09T16:44:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_NaraRúbiaSouza.pdf: 1094041 bytes, checksum: 5b066bd9df59cb7e71acf5c98349863b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-09T16:44:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_NaraRúbiaSouza.pdf: 1094041 bytes, checksum: 5b066bd9df59cb7e71acf5c98349863b (MD5) Previous issue date: 2017-08-09 / Os objetivos deste trabalho foram pesquisar Salmonella spp., promover a caracterização microbiológica em amostras de ovos inspecionados comercializados na região do Distrito Federal, realizar antibiograma e detectar genes de resistência antimicrobiana nos isolados.Nas 140 amostras de ovos analisadas,não foi encontrada presença do microrganismo Salmonella spp.. Na caracterização microbiológica das 140 amostras de ovos foram isolados 42 microrganismos em 38 ovos, sendo 24/140 (17,1%) de Staphylococcus coagulase negativa, 4/140 (2,8%) de Enterobacter spp., 4/140 (2,8%) de Escherichia coli, 3/14 (2,14%) de Hafnia alvei, 2/140 (1,42%) de Pseudomonas spp., 1/140 (0,71%) de Corynebacterium spp., 1/140 (0,71%) de Proteus mirabilis, 1/140 (0,71%) de Providencia spp., 1/140 (0,71%) de Yersinia spp., 1/140 (0,71%) de Acinetobacter spp. O perfil de susceptibilidade antimicrobiana demonstrou que os 42 microrganismos apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano sendo o maior índice de resistência, 14/42 (58,3%), dos microrganismos isolados foram para Tetraciclina e Vancomicina. Não foram detectados os genes de resistência antimicrobiana para Sulfonamidas, Beta-lactâmicos, Clorafenicol, Aminoglicosídeos e Tetraciclina nos isolados. Foi detectado o gene da integrase Intl1 em 3/42 microrganismos. Não foi detectada a presença de Salmonella spp. nas amostras analisadas e vários diferentes microrganismos foram isolados na caracterização microbiológica. Foram detectados ainda a presença fenotípica de resistência antimicrobiana e o gene da integrase 1. No entanto maiores estudos devem ser realizados para pesquisa de Salmonella spp em ovos e a verificação da origem da resistência antimicrobiana nos microrganismos isolados de ovos inspecionados comercializados na região do Distrito Federal. / The objectives of this work were to investigate Salmonella spp., to promote the microbiological characterization in samples of inspected eggs commercialized in the Federal District, to perform antibiogram and to detect antimicrobial resistance genes in the isolates. In the 140 samples of eggs analyzed, no microorganism was found Salmonella spp. In the microbiological characterization of the 140 egg samples, 42 microorganisms were isolated in 38 eggs, 24/140 (17.1%) of coagulase negative Staphylococcus, 4/140 (2.8%) Enterobacter spp., 4 / 140 (2.8%) of Escherichia coli, 3/14 (2.14%) of Hafnia alvei, 2/140 (1.42%) of Pseudomonas spp., 1/140 (0.71%) of Corynebacterium spp., 1/140 (0,71%) Protein mirabilis, 1/140 (0.71%) Providencia spp., 1/140 (0.71%) Yersinia spp., 1/140 (0, 71%) of Acinetobacter spp. The antimicrobial susceptibility profile showed that the 42 microorganisms showed resistance to at least one antimicrobial being the highest resistance index, 14/42 (58.3%), of the isolated microorganisms were for Tetracycline and Vancomycin. No antimicrobial resistance genes were detected for Sulfonamides, Beta-lactams, Chlorphenicol, Aminoglycosides and Tetracycline in the isolates. Intl1 integrase gene was detected in 3/42 microorganisms. No evidence of Salmonella spp. In the analyzed samples and several different microorganisms were isolated in the microbiological characterization. The phenotypic presence of antimicrobial resistance and the integrase 1 gene were also detected. However, further studies should be carried out to investigate Salmonella spp in eggs and verify the origin of antimicrobial resistance in isolated microorganisms from inspected eggs marketed in the Federal District .

As bactérias do gênero Enterococcus spp. estão amplamente distribuídas na natureza, atuando como patógenos oportunistas e freqüentemente causam infecções em pacientes imunocomprometidos. Uma característica destes microrganismos é a resistência intrínseca a muitos dos antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infecções por cocos Gram positivos. Por outro lado, os Enterococos têm adquirido diferentes determinantes genéticos que conferem resistência a vários antimicrobianos. Este trabalho tem como objetivo determinar a freqüência da resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos (gentamicina), tetraciclina, bem como avaliar a diversidade genética das amostras, pesquisando os genes envolvidos na resistência, além de detectar o fator de virulência gelatinase em isolados clínicos e alimentares de Enterococcus spp. Os testes de suscetibilidade antimicrobiana dos 52 isolados de alimentos revelaram que 7,7% (n=4) apresentaram resistência somente à tetraciclina, 5,8% (n=3) foram resistentes somente a gentamicina e 28,9% (n=15) apresentaram resistência a ambos antimicrobianos. Nos 40 isolados clínicos, 42,5% (n=17) foram resistentes a tetraciclina, 20% (n=8) resistentes a gentamicina e 17,5% (n=7) foram resistentes a ambos antimicrobianos. A pesquisa de genes de resistência em isolados alimentares revelou que 90% (n=17) dos microrganismos resistentes a tetraciclina apresentaram o gen tet(M), e 100% das amostras resistentes a gentamicina apresentaram o gene aac(6’)-le-aph(2”)-Ia. Entretanto, 30% dos microrganismos sensíveis apresentaram algum dos genes de resistência. Nos isolados clínicos 95,8% (n=23) das amostras resistentes a tetraciclina apresentaram o gene tet(M) e 100% dos Enterococos resistentes a gentamicina apresentaram o gen aac(6’)-le-aph(2”)-Ia. No entanto, dos isolados que se mostraram sensíveis, 37,5% apresentaram algum dos genes de resistência analisados. Ainda, foi verificado que 78% (n=49) dos microrganismos isolados de alimentos hidrolisaram a gelatina, e somente 50% (n=20) dos isolados clínicos apresentaram a mesma atividade. / Bacteria of the Enterococcus spp. genus are widely distributed in the natural environment, Enterococci are opportunistic pathogens, and often are the causal agents of infections in immunosuppressed patients. One of the remarkable characteristics of these microorganisms is the intrinsic resistance they offer against several of the antimicrobial agents routinely prescribed in the treatment of Gram-positive cocci. On the other hand, enterococci have been proved to acquire different genetic markers that lend resistance to a variety of other antimicrobial ,searching the involved genes in the resistance, besides detecting the virulence factor gelatinase in isolated of Enterococcus spp. from foods and humans samples. This study aimed to determine the frequency of antimicrobial resistance against high concentrations of aminoglycosides (gentamicin), tetracycline, as well as assess the genetic diversity of microbial strains isolated from foods and humans. Antibiotic susceptibility tests of Enterococcus spp. isolated from food showed that of the 52 isolates, 7,7% (n=4) were tetracycline resistant, 5,8% (n=3) were resistant only the gentamicin and 28,9% (n=15) was resistant to both antibiotics. Already in 40 clinical samples 42,5% (n=17) of the samples were tetracycline resistant, 20% (n=8) were gentamicin resistant and 17,5% (n=7) were resistant to both antimicrobials. The research of genes of resistance in isolates from food disclosed that in 90% (n=17) of tetraciclyn resistant Enterococcus had the tet(M) gen, and 100% gentamicin resistant samples had aac(6')-le-aph(2")-Ia gene and 30% of the sensible microorganism had presented some of the resistance genes. Already in clinical isolates 95,8% (n=23) tetraciclyn resistant samples contained the tet(M) gene and 100% of the gentamicin resistant enterococcus had presented gen aac(6')-le-aph(2")-Ia; however 37,5% enterococcus sensible had presented some of the genes of resistance in research. In this work, also it was verified that 78% (n=49) of the foods isolates produced gelatinase, and 50% (n=20) of the clinical isolates demonstrated the capacity of degradation of the gelatin substrate.

Made available in DSpace on 2018-08-23T21:50:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12423_Dissertação Ingrid VERSÃO FINAL.pdf: 2910032 bytes, checksum: f74a79e0492f8dbd74374a927a556dd4 (MD5) Previous issue date: 2018-05-24 / Infecções causadas por Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase KPC (Kp-KPC) constituem uma grande ameaça para a prática clínica, visto que são associadas a elevadas taxas de mortalidade e possuem escassas opções terapêuticas disponíveis. Atualmente estão sendo detectadas cepas dessa bactéria com resistência a todos os agentes antimicrobianos conhecidos, corroborando a urgente necessidade por novos tratamentos eficazes. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos de fendiona e seus derivados, Cu-fendiona e Ag-fendiona, sozinhos e combinados aos carbapenêmicos meropenem (MPM) e imipenem (IMP) em diferentes amostras de Kp-KPC, in vitro e em modelo de Galleria mellonella. Para tal foram investigados: (i) os valores de concentração inibitória mínima (CIM) e de concentração bactericida mínima (CBM) dos compostos; (ii) o efeito da combinação dos compostos com MPM e IMP por meio de checkerboard e curva tempo-morte; e (iii) o efeito de combinações sinérgicas em modelo in vivo de G. mellonella. Os resultados obtidos pela determinação da CIM e da CBM demonstraram boa atividade antimicrobiana pelos três compostos contra todas as 46 amostras. Os valores médios da CIM de fendiona, Cu-fendiona e Ag-fendiona foram 42,06, 9,88, e 10,10 μg/ml, respectivamente. Por meio do checkerboard foram testadas combinações dos compostos com MPM e IMP sobre 9 amostras clonalmente não-relacionadas, e não foi observada a presença de efeitos indiferentes ou antagônicos em qualquer uma das seis combinações testadas. Maiores taxas de sinergismo foram observadas nas três combinações contendo MPM, sendo esse efeito detectado em 66,67%, 77,78%, e 33,33% das amostras quando em associação a fendiona, Cu-fendiona e Ag-fendiona, respectivamente. Pelo método de curva tempo-morte foram testadas as combinações de MPM com Cu-fendiona e Ag-fendiona sobre duas amostras clonalmente não-relacionadas. Foi demonstrado que as combinações contendo concentrações de ½ xCIM de cada agente produziram efeito sinérgico, sendo verificado entre nove e 12 horas de teste. Observou-se que a combinação de MPM com o composto Ag-fendiona foi capaz de erradicar o inóculo (106 UFC/mL) aplicado no teste. Os níveis de toxicidade aguda de fendiona e seus derivados foram avaliados em modelo de G. mellonella, sendo os resultados considerados satisfatórios no que se refere à utilização desses compostos sozinhos ou combinados. A eficácia das combinações foi também avaliada in vivo em modelo de infecção de G. mellonella sobre as mesmas duas amostras empregadas na curva tempo-morte. Foi verificada uma superioridade estaticamente significativa do tratamento com as combinações em relação à administração dos agentes sozinhos. Assim, os resultados obtidos no nosso estudo demonstram o potencial de fendiona, Cu-fendiona e Ag-fendiona como candidatos a fármacos sozinhos ou combinados a antimicrobianos carbapenêmicos.

A bacia do Rio dos Sinos banha total ou parcialmente 32 municípios e integra uma área territorial de 3.600 km2. Ao longo do seu curso, recebe vários tipos de dejetos oriundos de esgoto pluvial, doméstico e industrial. Sendo assim,o Rio recebe uma população microbiana bastante diversificada, possibilitando a presença de micro-organismos com fenótipo de resistência a diferentes antimicrobianos e a metais pesados. O objetivo principal desse estudo foi avaliar o perfil de resistência a antimicrobianos e metais pesados de bactérias isoladas no Rio dos Sinos. Foram testados 410 micro-organismos isolados das águas do Rio nos municípios de Três Coroas, Novo Hamburgo e Esteio, nas quatro estações do ano. O ensaio de susceptibilidade foi realizado com 13 antimicrobianos. Todos os isolados foram submetidos aos ensaios de concentração inibitória mínima (CIM) de metais pesados, os metais utilizados foram cromo, cobre e níquel. Foram também realizados testes de colimetria e contagem total de heterotróficos. Os resultados apontaram para um perfil de 77,32% dos isolados resistentes a pelo menos um antimicrobiano. O antimicrobiano com maior índice de resistência foi a vancomicina com 64,15% dos isolados e o mais eficiente foi o imipenem, com apenas cinco isolados resistentes. Quanto aos ensaios com metais pesados 44,39% dos isolados foram resistentes a um MIC acima de 802,27 mg/L de níquel, 40,97% foram resistentes a MIC acima de 509,24 mg/L para cobre e 12,92% dos microorganismos foram resistentes MIC acima de 707,04 mg/L de cromo. Conforme a maioria dos resultados, as águas do Rio dos Sinos seriam classificadas como classe 3 pelas normas do CONAMA. / The Rio dos Sinos basin, covers wholly or partly 32 municipalities and a land area of 3,600 km2. Along its course, receives various types of waste arising from pluvial, domestic and industrial sewage. Hence, Rio dos Sinos receives a quite diverse microbial population, allowing for the presence of micro-organisms with resistance phenotype to different antibiotics and heavy metals. The main objective of this study was to evaluate the antimicrobial and heavy metals resistance profile of the bacteria isolated in Rio dos Sinos. 410 isolated microorganisms were tested from the municipalities of Rio Três Coroas, Esteio and Novo Hamburgo, in four seasons. The assay was performed with 13 antimicrobials. All isolates were subjected to the tests of minimum inhibitory concentration (MIC) of heavy metals, using chromium, copper and nickel. Were also held colimetries and heterotrophic bacterial count. Results showed a profile of 77.32% of the isolates were resistant to at least one antimicrobial. The antimicrobial with the highest rate of resistance was vancomycin (64.15%) and the most efficient was imipenem, with only five resistant isolates. The bacteria isolated in this study shows that 44.39% were resistant to MIC above 802.27 mg/L of nickel, 40.97% were resistant to MIC above 509.24 mg/L of copper and 12.92% microorganisms were resistant to MIC above 707.04 mg/Ll of chromium. According to most of the results, the waters of the Rio dos Sinos would be classified as Class 3 standards by CONAMA.

Resumo: Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) emergiram logo após a introdução desse fármaco para tratamento de infecções hospitalares. A emergência da resistência a meticilina em cepas de Staphylococcus aureus na comunidade (CAMRSA) instiga a pesquisa de novos tratamentos e dos mecanismos de virulência relacionados a essas cepas. Indivíduos que não apresentavam fatores de risco tradicionais para aquisição de MRSA eram gravemente afetados por cepas de CAMRSA que geralmente apresentam-se mais virulentas. O objetivo desse trabalho foi determinar a ocorrência de Staphylococcus spp. e os fatores de risco para aquisição de MRSA como causa de infecções de pele e/ou de tecidos moles. Durante o período de estudo foram atendidos 127 pacientes com diagnóstico de infecções agudas de pele, sendo que 19 (14,9%) pacientes apresentaram cultura bacteriológica negativa e 108 (85,1%) apresentaram cultura positiva para Staphylococcus spp., isolando-se 116 amostras. Dessas 116 amostras, 66 (56,9%) foram identificadas como S. aureus e 50 (43,1%) como Estafilococos coagulase-negativa (ECN). O gene de resistência a meticilina foi detectado em 26 (21%) amostras, sendo sete (26,9%) em S. aureus e 19 (73,1%) em ECN. A resistência fenotípica para os discos de cefoxitina e oxacilina foi detectada em seis (85,7%) das amostras de S. aureus positivas para o gene mecA e, com relação aos ECN, 10 (52,6%) mostraram-se resistentes à oxacilina e somente cinco (26,3%) amostras mostraram-se resistentes para o disco de cefoxitina. Das 7 amostras de S. aureus positivas para o gene mecA 1 (14,2%) foi do tipo Ia, 3 (42,9%) do tipo II e 3 (42,9%) do tipo IV. Para os ECN foram encontrados 2 (10,5%) do tipo I e II cada, 3 (15,8%) do tipo III, 5 (26,4%) do tipo IV e 7 (36,8%) não foram tipáveis. O gene da PVL foi detectado em 15,1% das amostras de S. aureus. Os fatores de risco encontrados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The emergency of methicillin resistant Staphylococcus aureus strains in the community (CA-MRSA), lead to the search of new options of treatment and the virulence factors regarded to them. Individuals without the traditional risk factors for acquisition of MRSA were severely affected CA-MRSA strains, usually more virulent than health-care associated strains (HA-MRSA). The aim of this work was determinate the Staphylococcus spp. occurrence and the risk factors for MRSA acquisition as the main cause of skin and soft tissue infections. During the study period 127 patients were attended and diagnosed as acute skin infections, and 19 (14.9%) of the patients had negative bacterial culture and 108 (85.1%) had positive culture for Staphylococcus spp. and from that 116 samples were recovered. From these 116 samples, 66 (56.9%) were S. aureus and 50 (43.1%) were CoNS (coagulase-negative Staphylococcus). The methicillin resistance gene mecA was detected in 26 (21%) from the strains where 7 (26.9%) were S. aureus and 19 (73.1%) were CoNS. The phenotypic resistance for the cefoxitin and oxacillin discs was detected in 6 (85.7%) of S. aureus samples and, regarded to the CoNS samples 10 (52.6%) were resistant to the oxacillin disc and just 5 (26.3%) samples were resistant for the cefoxitin disk. From 7 S. aureus samples mecA positive 1 (14.2%) was type Ia, 3 (42.9%) type II and 3 (42.9%) type IV. For the CoNS isolated, 2 (10.5%) were tipe I and II for each one, 3 (15.8%) type III, 5 (26.4%) type IV and 7 (36.8%) were not able to type. The PVL gene was detected in 10 (15.1%) on S. aureus samples. The risk factors attributed to the MRSA acquisition on this study were the previous ciprofloxacin intake [OR: 8.75 (1.59 - 48.29) p= 0.01] and work in the health care settings [OR: 17.5 (1.22 - 250.36) p= 0.04] / Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Coorientador: Silvio Alencar Marques / Banca: Carlos Magno Branco Fortaleza / Banca: Antonio Carlos Campos Pignatari / Mestre

Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Resumo: As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as doenças infecciosas mais comuns na prática clínica, e Staphylococcus saprophyticus se destaca como o segundo agente etiológico mais isolado nessas infecções. Esse estudo objetiva caracterizar o perfil clonal, os fatores de virulência e o perfil de resistência aos antimicrobianos em isolados planctônicos e em biofilme de S. saprophyticus isolado de amostras de urina de pacientes com infecção do trato urinário, além de comparar a identificação de espécies de ECN obtida no Vitek 2 e no Maldi-TOF MS com a identificação genotípica. Foram utilizadas no estudo amostras de S. saprophyticus isoladas da urina de diferentes pacientes. As amostras utilizadas no estudo foram obtidas em estudo prospectivo conforme isolamento no Laboratório de Microbiologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu (HC-FMB) nos anos de 2013 e 2014, e comparadas com um banco de amostras previamente coletadas em 2008. As amostras foram coletadas de paciente procedentes de enfermarias, ambulatórios, pronto-socorro e unidades básicas de saúde de Botucatu e região. Foram estudadas 217 amostras de ECN de pacientes com ITU. A concordância do sistema automatizado Vitek 2 com o ITSPCR foi de 84,8%, com sensibilidade e especificidade de 98% e 100%, respectivamente. Maldi-TOF MS identificou corretamente todas as amostras de ECN. Os resultados obtidos através da análise de PFGE permitiram identificar 41 perfis distintos, entre os quais foram encont... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor