ALK1 est un récepteur de la famille du TGF-β, principalement exprimé dans les cellules endothéliales. Le ligand physiologique et circulant d'ALK1, BMP9, a été découvert par notre laboratoire en 2007, ce qui a ouvert des possibilités d'étude de la fonction d'ALK1. La première partie de ma thèse a été consacrée à l'analyse fonctionnelle de mutants d'ALK1, retrouvés sur des patients atteints de la maladie de Rendu-Osler de type 2, en réponse à BMP9. Cette étude a permis de : 1) proposer l'haploinsuffisance fonctionnelle comme modèle de la maladie ; 2) développer un test diagnostique pour discriminer les mutations pathogènes des polymorphismes rares, basé sur leur réponse à BMP9 ; 3) d'avoir une meilleure connaissance des acides aminés d'ALK1 importants dans la réponse à BMP9. Un second travail a consisté en la production de la forme mature de BMP9 et du domaine extracellulaire d'ALK1 en vue de l'étude de la structure cristallographique du complexe. L'expression des protéines et leur purification sont en phase d'optimisation. Enfin, un troisième projet consistait en l'analyse du rôle de BMP9 dans l'angiogenèse in vivo. La neutralisation de BMP9 par deux stratégies distinctes induit une augmentation de la densité vasculaire dans la rétine de la souris. Le mécanisme est en cours d'investigation. / ALK1 is a TGF-β family receptor, mainly expressed on endothelial cells. The physiologic and circulating ligand of ALK1, BMP9, was discovered by our laboratory in 2007, which opened opportunities for studying the function of ALK1. The first part of my thesis was on the functional analysis of ALK1 mutants from HHT-2 patients in response to BMP9. This study allowed us to: 1) propose functional haploinsufficiency as a model for HHT-2; 2) develop a diagnostic tool to discriminate pathogenic mutations from rare polymorphisms, based on their BMP9 response; 3) increase our knowledge of important amino acids in ALK1 for the BMP9 response. A second work was on the production of the mature form of BMP9 and of the extracellular domain of ALK1 in order to study the crystallographic structure of the complex. The expression of these proteins and their purification are in optimization phase. Lastly, a third project was on the analysis of the role of BMP9 in angiogenesis in vivo. Neutralization of BMP9 using two strategies induces an increase of the vascular density of the retina in mouse. Mechanism of action is under investigation.

Contrairement aux mammifères adultes, la rétine des amphibiens possède la particularité de croître durant toute la vie de l'animal grâce à l'activité continue d'une population de cellules souches localisée au sein d'une niche bien délimitée, la zone marginale ciliaire (ZMC). Ce modèle offre ainsi la possibilité d'étudier in vivo les mécanismes moléculaires à l'origine du maintien et de la prolifération des cellules souches neurales à des stades post-embryonnaires. Dans ce but, l'identification et la caractérisation des différentes voies de signalisation présentes au sein de la niche biologique des cellules souches rétiniennes est une première étape indispensable. Mon projet de thèse a été divisé en deux objectifs principaux: l'étude des interactions entre les voies Wnt et Hedgehog au sein de la ZMC chez le xénope et la réalisation de l'étude fonctionnelle de Yap, l'effecteur principal de la voie de signalisation Hippo dans ce modèle. Par des approches génétiques et pharmacologiques, la première partie de ce projet a permis de mettre en évidence un antagonisme inattendu entre les signaux Wnt et Hedgehog au sein de la ZMC qui régule l'activité proliférative des cellules souches et des progéniteurs rétiniens. Ce travail nous a conduit à proposer un modèle dans lequel ces deux voies réguleraient la balance prolifération/différenciation dans la rétine post-embryonnaire. Dans un deuxième temps, les expériences de gain et de perte de fonction du gène Yap ont montré que ce dernier joue un rôle essentiel dans la régulation du programme temporel de la phase de réplication de l'ADN des cellules souches rétiniennes. En effet, l'inhibition de Yap entraîne une importante réduction de la durée de la phase S du cycle cellulaire associée à une instabilité génomique. Une surexpression de c-Myc et de la voie p53-p21 semble impliquée dans ce phénotype. Nos travaux nous ont également permis d'identifier un nouveau partenaire de YAP, le facteur de transcription PKNOX1. L'ensemble de ces données nous a ainsi conduit à proposer un modèle selon lequel le complexe YAP/PKNOX1 pourrait être nécessaire au bon déroulement de la phase de réplication des cellules souches, indispensable à la maintenance de l'intégrité du génome de ces cellules et de leur descendance. / In contrast to the adult mammals, the retina of amphibians shows continuous growth during adulthood through active neural stem cells localized in the defined niche called ciliary marginal zone (CMZ). This model offers an exceptional tool to study in vivo the molecular mechanisms involved in the maintenance and proliferation of neural stem cells during post-embryonic stages. In this order, the identification and the characterization of the signaling pathways acting in biological retinal stem cell niche is an essential step.My PhD research was divided in two main parts: the study of the interaction between the Wnt and Hedgehog pathways within the CMZ and the functional study of Yap, the downstream effector of the Hippo pathway in this model. By using genetic and pharmacological tools, the first part of this project demonstrated an unexpected antagonism between the Wnt and the Hedgehog signaling in the CMZ that regulates proliferative activity of retinal stem and progenitor cells. In this article, we propose a model in which an antagonistic interplay of Wnt and Hedgehog pathways may regulate the balance proliferation/differentiation in the post-embryonic retina. Second, gain and loss of function experiments of Yap have shown that this factor plays a key role in the regulation of temporal replication of DNA retinal stem cells. Indeed, inhibition of Yap leads to strong reduction of the S-phase length during the cell cycle associated with genomic instability. c-Myc and p53-p21 overactivation seems to be involved in this phenotype. This work also allowed us to identify a novel YAP partner, the transcriptional factor PKNOX1. We indeed propose a model in which the YAP/PKNOX1 complex may be required for the successful convening of the replication phase on stem cells, essential for the maintenance of genome integrity on the cells and their progeny.

Quelque soit le type de dégénérescences rétiniennes, les cellules photoréceptrices à l'origine de la genèse du signal lumineux, meurent par un mécanisme commun : l'apoptose. Au laboratoire, nous avons mis en évidence que l'inhibition de la caspase-3, une caspase effectrice de l'apoptose, permet de réduire l'apoptose des cellules photoréceptrices (Perche et al. 2007). Dans la continuité de ces résultats, le but de nos travaux de thèse est d'identifier les molécules impliquées en amont de la caspase-3. Pour mener à bien notre projet, nous avons utilisées un modèle expérimentale de dégénérescence rétinienne induite par une exposition à la lumière (modèle de photodégénérescence rétinienne). Les atteintes rétiniennes sont quantifiées par : l'électrorétinographie in-vivo permettant d'évaluer la fonction rétinienne, l'histologie pour l'analyse morphométrique de la rétine aux quelles sont associés des dosages enzymatiques. Ainsi, nous avons montré que l'injection d'un inhibiteur de la caspase-12 à 0,4 ou à 0,8 mM, de la caspase-9 à 0,2 ou à 0,4 mM, ou de la caspase-8 à 0,2 mM, injecté dans le vitré n'a aucun effet toxique sur la rétine et n'a aucun effet protecteur contre l'apoptose des cellules photoréceptrices induites par la lumière. Ces résultats suggèrent que les caspases-8, 9 et 12 ne sont pas impliquées dans l'activation de la caspase-3 et donc dans l'initiation de l'apoptose des photorécepteurs induite par la lumière. Toutefois, après injection dans le vitré, les inhibiteurs inhibent leur cible respective uniquement transitoirement. Par conséquent, pour pouvoir conclure sur le rôle de ces caspases dans le processus dégénératif, il faudrait pouvoir inhiber les caspases de façon plus persistante. Il serait donc intéressant de reproduire des expérimentations similaires en augmentant la concentration de l'inhibiteur injecté ou en réduisant le délai entre l'injection de l'inhibiteur et l'induction du stress. De plus, la caspase-3 peut être activée indépendamment des caspases initiatrices, comme par exemple : les céramides, les cathepsines et les calpaïnes. / No abstract available

Il est aujourd'hui établi que la vision des couleurs chez l'homme est permise par la présence de trois types de photorécepteurs, sensibles respectivement aux courtes, moyennes et grandes longueurs d'onde de la lumière. La présence de ces trois classes d'échantillonneurs induit un espace perceptif des couleurs tridimensionnel. Par ailleurs, les expériences psycho-physiques montrent que le système visuel humain construit trois voies perceptives à partir de l'image échantillonnée au niveau des cônes. L'une contient l'information achromatique, appelée lumi- nance, et les deux autres véhiculent les informations d'oppositions de couleurs rouge moins vert et bleu moins jaune. Cependant, le système visuel est confronté à un problème de taille puisqu'à chaque position spatiale de la rétine, un seul cône est présent. Chaque cône mesure, par conséquent, à la fois l'information de luminance et l'information de couleur. Le mécanisme permettant le passage de cette information rétinienne ambiguë à trois voies perceptives distinctes est encore mal compris, en particulier dans le cas d'un arrangement irrégulier des cônes, tel que c'est le cas dans la rétine. Nous proposons un modèle d'estimation de la luminance et des oppositions de couleurs s'appliquant quel que soit l'arrangement spatial des photorécepteurs, et discutons de ses impli- cations pour le traitement rétinien de la couleur. Ce modèle s'applique également au domaine des caméras numériques dites "mono-capteur", ces dernières étant confrontées à la même pro- blématique d'échantillonnage spatio-chromatique que la rétine.

Mesure de la fonction de transfert de modulation du système optique de l'oeil. Problème de la réflexion rétinienne. Définition de la jonction.

ALK1 est un récepteur de la famille du TGF-β, principalement exprimé dans les cellules endothéliales. Le ligand physiologique et circulant d'ALK1, BMP9, a été découvert par notre laboratoire en 2007, ce qui a ouvert des possibilités d'étude de la fonction d'ALK1. La première partie de ma thèse a été consacrée à l'analyse fonctionnelle de mutants d'ALK1, retrouvés sur des patients atteints de la maladie de Rendu-Osler de type 2, en réponse à BMP9. Cette étude a permis de : 1) proposer l'haploinsuffisance fonctionnelle comme modèle de la maladie ; 2) développer un test diagnostique pour discriminer les mutations pathogènes des polymorphismes rares, basé sur leur réponse à BMP9 ; 3) d'avoir une meilleure connaissance des acides aminés d'ALK1 importants dans la réponse à BMP9. Un second travail a consisté en la production de la forme mature de BMP9 et du domaine extracellulaire d'ALK1 en vue de l'étude de la structure cristallographique du complexe. L'expression des protéines et leur purification sont en phase d'optimisation. Enfin, un troisième projet consistait en l'analyse du rôle de BMP9 dans l'angiogenèse in vivo. La neutralisation de BMP9 par deux stratégies distinctes induit une augmentation de la densité vasculaire dans la rétine de la souris. Le mécanisme est en cours d'investigation.