ALK1 est un récepteur de la famille du TGF-β, principalement exprimé dans les cellules endothéliales. Le ligand physiologique et circulant d'ALK1, BMP9, a été découvert par notre laboratoire en 2007, ce qui a ouvert des possibilités d'étude de la fonction d'ALK1. La première partie de ma thèse a été consacrée à l'analyse fonctionnelle de mutants d'ALK1, retrouvés sur des patients atteints de la maladie de Rendu-Osler de type 2, en réponse à BMP9. Cette étude a permis de : 1) proposer l'haploinsuffisance fonctionnelle comme modèle de la maladie ; 2) développer un test diagnostique pour discriminer les mutations pathogènes des polymorphismes rares, basé sur leur réponse à BMP9 ; 3) d'avoir une meilleure connaissance des acides aminés d'ALK1 importants dans la réponse à BMP9. Un second travail a consisté en la production de la forme mature de BMP9 et du domaine extracellulaire d'ALK1 en vue de l'étude de la structure cristallographique du complexe. L'expression des protéines et leur purification sont en phase d'optimisation. Enfin, un troisième projet consistait en l'analyse du rôle de BMP9 dans l'angiogenèse in vivo. La neutralisation de BMP9 par deux stratégies distinctes induit une augmentation de la densité vasculaire dans la rétine de la souris. Le mécanisme est en cours d'investigation. / ALK1 is a TGF-β family receptor, mainly expressed on endothelial cells. The physiologic and circulating ligand of ALK1, BMP9, was discovered by our laboratory in 2007, which opened opportunities for studying the function of ALK1. The first part of my thesis was on the functional analysis of ALK1 mutants from HHT-2 patients in response to BMP9. This study allowed us to: 1) propose functional haploinsufficiency as a model for HHT-2; 2) develop a diagnostic tool to discriminate pathogenic mutations from rare polymorphisms, based on their BMP9 response; 3) increase our knowledge of important amino acids in ALK1 for the BMP9 response. A second work was on the production of the mature form of BMP9 and of the extracellular domain of ALK1 in order to study the crystallographic structure of the complex. The expression of these proteins and their purification are in optimization phase. Lastly, a third project was on the analysis of the role of BMP9 in angiogenesis in vivo. Neutralization of BMP9 using two strategies induces an increase of the vascular density of the retina in mouse. Mechanism of action is under investigation.

Les Bone Morphogenetic Proteins (BMP) jouent un rôle important dans de nombreux processus physiopathologiques, en particulier dans les processus d'angiogenèse. La mise au point de méthodes de détection sensibles et spécifiques pourrait être utiles pour des applications cliniques potentielles. Ce travail s'intéresse à BMP9, molécule récemment identifiée par notre équipe comme le ligand physiologique et spécifique du récepteur orphelin Activin Receptor-Like Kinase 1 (ALK1). BMP9 est présent dans le sang et joue un rôle de facteur de quiescence de l'endothélium vasculaire. Ces observations nous ont permis de proposer que la concentration sanguine de BMP9 pourrait être un marqueur de l'état d'activation de l'endothélium vasculaire. Afin de valider cette hypothèse, trois objectifs ont été définis : 1/ mettre au point une méthode de dosage sensible et spécifique de BMP9 circulant, 2/ caractériser les sites d'expression et les formes circulantes de BMP9 et 3/ évaluer la pertinence de BMP9 comme biomarqueur de l'angiogenèse physiologique et pathologique, en particulier tumorale. La première partie de mon travail de thèse a consisté à développer deux méthodes de dosage. La première consiste en une méthode biologique, basé sur l'utilisation d'un gène rapporteur sous le contrôle du promoteur BRE (BMP Responsive Element) qui répond à l'activation de la voie des BMPs. La seconde méthode est basée sur un système « sandwich » de type immunoenzymatique. Les caractéristiques de ces méthodes ont été établies. Dans un second temps, grâce à ces outils, nous avons montré que BMP9 est une protéine produite principalement par les hépatocytes et qu'elle circule majoritairement sous une forme active, complexée à son pro-domaine. Une forme inactive homo-dimérique non clivée est aussi synthétisée. Ce travail confirme également le rôle de BMP9 dans la quiescence de l'endothélium vasculaire. Dans la dernière partie de ce travail, le taux de BMP9 a été mesuré dans des fluides biologiques de patient(e)s présentant diverses situations physiopathologiques. Une augmentation de la concentration sanguine de BMP9 est observée peu de temps avant l'accouchement ; chez les patientes pré-éclamptiques des taux plus élevés de BMP9 sont aussi observés, ouvrant des perspectives dans le domaine obstétrical. Dans les pathologies tumorales, nos observations montrent que BMP9 n'a pas d'intérêt en tant que marqueur diagnostique ou pronostique. Toutefois, les données recueillies dans le cancer médullaire de la thyroïde traité par vandétanib suggèrent que la mesure du taux de BMP9 circulant pourrait avoir une valeur prédictive sur l'efficacité du traitement. Ainsi, l'utilisation du dosage de BMP9 comme marqueur prédictif ou pharmacodynamique des thérapies anti-angiogéniques doit être envisagé. En effet, à l'heure actuelle, l'index thérapeutique des traitements anti-angiogéniques pourrait être amélioré s'il était possible d'identifier et de valider des biomarqueurs susceptibles de prédire précocement l'efficacité clinique ou le développement de résistances au traitement. Cette perspective apparait d'autant plus intéressante que deux molécules, ciblant la voie de signalisation Alk1 ont récemment été développées et présentent des résultats prometteurs, en particulier chez les patients présentant une résistance aux anti-VEGF. / The Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) play an important role in many pathophysiological processes, particularly in angiogenesis. The development of sensitive and specific detection methods could be useful for potential clinical applications. This work focuses on BMP9, a molecule recently identified by our team as the physiological and specific ligand of the orphan receptor Activin Receptor-Like Kinase 1 (ALK1). BMP9 is a circulating vascular quiescence factor. These observations have allowed us to propose that BMP9 blood concentration could be a biomarker of the activation state of the vascular endothelium. To validate this hypothesis, three objectives were defined: 1 / Develop a sensitive and specific assay of circulating BMP9, 2 / characterize expression sites and circulating forms of BMP9 and 3 / evaluate the relevance of BMP9 as a biomarker for physiological and pathological angiogenesis, in particular tumor. The first part of my thesis was to develop two assays. The first is a biological method, based on the use of a reporter gene under the control of the promoter BMP Responsive Element (BRE) which responds to the activation of the BMPs. The second method is based on a "sandwich"-type immunoassay. The characteristics of these methods have been established. In a second step, using these tools, we have shown that BMP9 is a protein produced mainly by hepatocytes and circulates predominantly in an active form complexed to its pro-domain. An inactive form homo-dimeric uncleaved is also synthesized. This work also confirms the role of BMP9 in the quiescence of vascular endothelium. In the last part of this work, the rate of BMP9 was measured in biological fluids of the patient (s) with various pathophysiological situations. An increase in the blood concentration of BMP9 is observed shortly before delivery and in preeclamptic patients higher rates of BMP9 were also observed, opening perspectives in obstetrics. In tumoral pathology, our observations show that BMP9 has no value as diagnostic or prognostic marker. However, the data collected in medullary carcinoma of the thyroid treated by vandetanib suggest that the measurement of circulating BMP9 rates could have a predictive value for the efficacy of treatment. So, the use of the BMP9 assay as a predictive marker or pharmacodynamic marker of anti-angiogenic therapies should be considered. Indeed, at present, the therapeutic index of anti-angiogenic treatments could be improved if it were possible to identify and validate biomarkers that may predict early clinical efficacy or the development of resistance to treatment. This perspective appears particularly interesting since two molecules targeting the signaling pathway Alk1 have recently been developed and show promising results, especially in patients with resistance to anti-VEGF

BMP9 (Bone Morphogenetic Protein 9) et BMP10 sont deux facteurs de croissance de la famille du TGFβ qui partagent le fait d'être les ligands du récepteur Alk1 (Activin receptor-like kinase 1). Les mutations de ce récepteur sont la cause de 2 pathologies vasculaires, la maladie de Rendu Osler et l'Hypertension Artérielle pulmonaire. L'invalidation de BMP10 a été décrite, elle entraine une létalité embryonnaire du fait de graves défauts cardiaques. L'invalidation de BMP9, un facteur de quiescence de l'endothélium vasculaire, n'avait pas encore été réalisée. Dans ce contexte l'objectif de cette thèse a été d'étudier les rôles respectifs de BMP9 et de BMP10 dans les remodelages vasculaires. Nous avons pour cela utilisé les souris invalidées pour BMP9, obtenues dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de S-J Lee (Baltimore, USA). Bien que les souris Bmp9-KO soient viables et fertiles, notre travail montre qu'elles présentent un réseau lymphatique anormal, avec un élargissement des vaisseaux et une réduction du nombre de valves dans leurs collecteurs. Les défauts observés ont un retentissement fonctionnel sur l'efficacité du drainage lymphatique. En accord avec ces observations, nous avons pu montrer que BMP9 régule un certain nombre de gènes impliqués dans le développement du réseau lymphatique. En contraste avec les résultats précédents, la vascularisation de la rétine est normale chez les souriceaux Bmp9-KO. Cette absence de phénotype est causée par une redondance entre BMP9 et BMP10. En effet, la neutralisation de BMP10 chez les souriceaux Bmp9-KO entraine une absence de maturation de la vascularisation de leur rétine. De plus, ces souriceaux présentent un défaut de fermeture de leur canal artériel. Ce vaisseau permet de dévier le sang hors des poumons fœtaux non fonctionnels et sa fermeture au moment de la naissance est nécessaire à la survie postnatale. Au total, ce travail met en exergue les rôles de BMP9 et de BMP10 dans les remodelages vasculaires périnataux lymphatiques et sanguins. / BMP9 (Bone Morphogenetic Protein 9) and BMP10 are two growth factors of the TGFβ family. They are both high affinity ligands for the receptor Alk1 (Activin receptor-like kinase 1), whose mutations are responsible of two vascular pathologies: Rendu-Osler disease and Pulmonary arterial hypertension. BMP10 invalidation has been described as embryonically lethal due to serious cardiac defects. BMP9 has been revealed as circulating vascular quiescence factor, but its inactivation has not been described before. In this context, the aim of my thesis was to evaluate the respective roles of BMP9 and BMP10 in vascular remodeling. We used Bmp9-KO mice for this purpose, which were provide by S-J Lee's team from Baltimore (USA). Although these mice are viable and fertile, we showed that they displayed abnormal lymphatic vessels characterized by vessel enlargement and reduction in number of valves, leading to a decreased lymphatic draining efficiency. Consistent with these data, we showed that BMP9 regulates expression of several genes known to be involved in lymphatic development. In contrast, BMP9 loss-of-function didn't affect blood vessels. We demonstrated that this was due to BMP9 and BMP10 redundancy, as BM10 neutralization in Bmp9-KO pups led to a dramatic decrease in retinal vascular expansion. These pups also display an abnormal closure of their ductus arteriosus. This vessel diverts blood away from the non-functional lungs during fetal life and its closure is essential for postnatal survival. Taken together, our results underlie the implication of BMP9 and BMP10 in lymphatic and blood postnatal vascular remodeling.

Genetic factors involved in late-onset Alzheimer’s disease (AD), affecting the majority of AD patients, are largely unknown. Genome-wide association studies implicated genes associated with increased risk of AD, including BIN1 (Bridging Integrator 1), and MSRB3 (methionine sulfoxide reductase-B3), also associated with low hippocampal volume. In an effort to find effective therapies, animal studies using intracerebralventricular administration of neurotrophic factor bone morphogenetic protein-9 (BMP9) decreased pathological burden and preserved cholinergic phenotype in AD mouse model hippocampus. To examine the potential role of BIN1, MSRB3, and ALK1, the BMP9 receptor, in human hippocampal AD-associated pathology, we examined their protein expression in postmortem human hippocampi using automated immunohistochemistry, and correlated the data with neuropathological reports and clinical dementia ratings. In elderly control subjects, BIN1 protein was expressed in white matter, glia, and neuropil along axons. CA1 quantitative analysis of BIN1 signal during AD progression revealed expression decreased in neuropil and increased in the cytoplasm of pyramidal neurons. The number of CA1 BIN1-immunoreactive pyramidal neurons correlated with the hippocampal CERAD neuritic plaque score while BIN1 neuropil signal was absent at neuritic plaque sites. MSRB3 was differentially expressed in hippocampal pyramidal layers. Controls exhibited MSRB3 signal as distinct but rare (≤2) puncta in CA1 pyramidal neuron somata. MSRB3 immunoreactivity in CA3 was found in the pyramidal layer neuropil. MSRB3 signal was also observed in rodent hippocampi where ultrastructural and immunohistofluorescent analysis revealed MSRB3 associates with synaptic vesicles (SV) and colocalizes with SV and mossy fiber markers respectively. In AD patients the population of CA1 pyramidal neurons with frequent (≥5), rather than rare, MSRB3-immunoreactive somatic puncta increased in comparison to controls and correlated positively with AD pathological hallmarks. Finally, cholinergic neurons of human and rodent basal forebrain were ALK1-immunoreactive. In healthy CA1, ALK1 was expressed prominently in neuropil and in GABAergic interneurons, while CA2, CA3, and CA4 showed ALK1-immunoreactive neuropil and pyramidal somata. The intensity of ALK1-immunoreactivity in CA3 decreased in moderate and late AD patients compared to non-AD subjects. These data show that neuronal, glial, and hippocampal subfield-specific changes in protein expression of potential AD modulators are associated with AD progression and its diagnostic hallmarks. / 2020-06-12T00:00:00Z

BMP9 (Bone Morphogenetic Protein 9) et BMP10 sont deux facteurs de croissance de la famille du TGFβ qui partagent le fait d'être les ligands du récepteur Alk1 (Activin receptor-like kinase 1). Les mutations de ce récepteur sont la cause de 2 pathologies vasculaires, la maladie de Rendu Osler et l'Hypertension Artérielle pulmonaire. L'invalidation de BMP10 a été décrite, elle entraine une létalité embryonnaire du fait de graves défauts cardiaques. L'invalidation de BMP9, un facteur de quiescence de l'endothélium vasculaire, n'avait pas encore été réalisée. Dans ce contexte l'objectif de cette thèse a été d'étudier les rôles respectifs de BMP9 et de BMP10 dans les remodelages vasculaires. Nous avons pour cela utilisé les souris invalidées pour BMP9, obtenues dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de S-J Lee (Baltimore, USA). Bien que les souris Bmp9-KO soient viables et fertiles, notre travail montre qu'elles présentent un réseau lymphatique anormal, avec un élargissement des vaisseaux et une réduction du nombre de valves dans leurs collecteurs. Les défauts observés ont un retentissement fonctionnel sur l'efficacité du drainage lymphatique. En accord avec ces observations, nous avons pu montrer que BMP9 régule un certain nombre de gènes impliqués dans le développement du réseau lymphatique. En contraste avec les résultats précédents, la vascularisation de la rétine est normale chez les souriceaux Bmp9-KO. Cette absence de phénotype est causée par une redondance entre BMP9 et BMP10. En effet, la neutralisation de BMP10 chez les souriceaux Bmp9-KO entraine une absence de maturation de la vascularisation de leur rétine. De plus, ces souriceaux présentent un défaut de fermeture de leur canal artériel. Ce vaisseau permet de dévier le sang hors des poumons fœtaux non fonctionnels et sa fermeture au moment de la naissance est nécessaire à la survie postnatale. Au total, ce travail met en exergue les rôles de BMP9 et de BMP10 dans les remodelages vasculaires périnataux lymphatiques et sanguins.

L’angiogenèse est définie comme la formation de nouveaux capillaires à partir des vaisseaux sanguins pré-existants. Elle contribue à l’extension du réseau vasculaire et assure ainsi l’efficacité des échanges gazeux et du transport des cellules, nutriments, métabolites et molécules de signalisation vers les tissus. L’angiogenèse par bourgeonnement passe par la spécification d’une cellule endothéliale en cellule meneuse et la formation d’un réseau de cellules suiveuses à la base du bourgeon vasculaire. Toute perturbation de ce mode de néovascularisation génère des vaisseaux fortement tortueux, immatures et non-étanches qui soit affectent les fonctions physiologiques des organes en causant ainsi des pathologies potentiellement fatales, ou accélèrent la progression des conditions telles que le cancer. Dans l’oeil, l’angiogenèse pathologique des vaisseaux choroïdiens et rétiniens cause une perte de la vue. Particulièrement, la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) de type néovasculaire, une maladie oculaire caractérisée par le bourgeonnement anormal de la choroïde dans l’espace sous-rétinien, représente la cause majeure de cécité au sein des populations des pays industrialisés. Les thérapies conventionnelles contre la DMLA humide reposent sur l’usage des médicaments qui ciblent la signalisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF). Bien que démontrant des résultats cliniques, ces traitements anti-VEGFs sont invasifs et présentent multiples effets secondaires. Par ailleurs, ils n’induisent aucun effet chez une portion des patients traités. De ces faits, il existe présentement un grand besoin de thérapies alternatives aux anti-VEGFs. De façon intéressante, la protéine de morphogénèse osseuse 9 (BMP9), qui active son récepteur “activin receptor-like kinase 1” (ALK1), régule l’angiogenèse développementale des vaisseaux rétiniens de l’oeil de la souris. Par ailleurs, les mutations au sein du BMP9, de son récepteur ALK1 ou de ses intermédiaires de signalisation sont associées à la morphogénèse anormale des vaisseaux qui contribue ultimement à la pathogénèse de diverses maladies néovasculaires. De façon additionnelle, le récepteur ALK1 au BMP9 est restreint à la cellule endothéliale; contrairement à ceux des ligands angiogéniques tels que le VEGF, exprimés par une diversité de cellules. Par ailleurs, au sein de cette cellule, le BMP9 contribue à la régulation des phénotypes meneur et suiveur qui sont induits par le VEGF et requis pour le déroulement de l’angiogenèse par bourgeonnement. De ces faits qui précèdent, nous avons émis l’hypothèse du rôle du BMP9 dans la régulation de la néovascularisation pathologique relative à la DMLA humide. Ainsi, les travaux de la présente thèse déterminent spécifiquement l’effet du BMP9 sur l’angiogenèse pathologique à l’aide des modèles oculaires pertinents à la DMLA humide et examine aussi sa base mécanistique. Les travaux de cette thèse démontrent l’effet anti-angiogénique du BMP9 sous les conditions expérimentales de néovascularisation choroïdienne induite au laser (CNV) et de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). Ils montrent aussi les effets régulateurs de la signalisation du BMP9 sur les voies de signalisation endothéliales du VEGF et de Notch, respectivement de façon dépendante de VEGFR1 et de JAG1. En somme, les présentes études démontrent les effets anti-angiogéniques du BMP9 sur la néovascularisation pathologique relative à la DMLA humide et identifient les facteurs moléculaires qui contribuent à son action inhibitrice du bourgeonnement vasculaire induit par le VEGF. / Angiogenesis is defined as the formation of new capillaries from existing blood vessels. It extends the vasculature and thereby sustains the efficient exchange of gases and transport of cells, nutrients, metabolites and signalling molecules to tissues. Sprouting angiogenesis proceeds through the selective specification of an endothelial cell into a leading tip cell and the formation of stalk cells at the base of the sprout. A disturbance in this modality of neovascularisation leads to highly tortuous, immature and leaky vessels that either impair the physiological functions of organs, thereby causing life-threatening diseases, or accelerate the progression of conditions such as cancer. In the eye, the pathological angiogenesis of choroidal and retinal vessels specifically results in vision loss. Particularly, the neovascular form of the age-related macular degeneration (AMD), an ocular disease characterized by the abnormal sprouting of the choroidal network into the subretinal space, represents the leading cause of blindness in populations of industrialized countries. Conventional therapies against wet AMD are based on drugs that target the signaling of the vascular endothelium growth factor (VEGF). Despite their clinical achievements, the anti-VEGFs treatments are invasive and show multiple adverse effects. Moreover, they are not effective in a portion of treated patients. Thus, there currently is a substantial need of therapy alternatives to anti-VEGFs. Interestingly, the bone morphogenetic protein 9 (BMP9), that activates its activin receptor-like kinase 1 (ALK1) transducer, regulates the developmental angiogenesis of the mouse eye retina vasculature. Moreover, mutations in BMP9, its receptor ALK1 or its signaling mediators correlate with the abnormal vessel morphogenesis that ultimately drives the pathogenesis of various neovascular diseases. Additionally, the BMP9-specific receptor ALK1 is restricted to endothelial cells; in contrast to those of neovascularisation-inducing ligands such as VEGF, expressed by a range of cells. Particularly within these cells, BMP9 contributes to regulate the VEGF-induced tip/stalk phenotypes required for sprouting angiogenesis. Given the aforementioned, we hypothesized the role of BMP9 in regulating the pathological angiogenesis associated with wet AMD. Thus, the studies from the current thesis specifically determine the effect of BMP9 on pathological NV using ocular models relevant to AMD and further investigate its mechanical basis. The current work demonstrates the antiangiogenic effects of BMP9 under experimentally induced oxygen-induced retinopathy (OIR) and laser-induced choroid neovascularisation (CNV) conditions. Moreover, this thesis shows the regulatory effects of BMP9 signaling on the VEGF and Notch endothelial pathways, respectively in VEGFR1 and JAG1 -dependent manners. Collectively, the current studies demonstrate the anti-angiogenic effects of BMP9 on pathological NV associated with wet AMD and identify the molecular players that mediate its inhibitory action on VEGF-mediated sprouting.

ALK1 est un récepteur de la famille du TGF-β, principalement exprimé dans les cellules endothéliales. Le ligand physiologique et circulant d'ALK1, BMP9, a été découvert par notre laboratoire en 2007, ce qui a ouvert des possibilités d'étude de la fonction d'ALK1. La première partie de ma thèse a été consacrée à l'analyse fonctionnelle de mutants d'ALK1, retrouvés sur des patients atteints de la maladie de Rendu-Osler de type 2, en réponse à BMP9. Cette étude a permis de : 1) proposer l'haploinsuffisance fonctionnelle comme modèle de la maladie ; 2) développer un test diagnostique pour discriminer les mutations pathogènes des polymorphismes rares, basé sur leur réponse à BMP9 ; 3) d'avoir une meilleure connaissance des acides aminés d'ALK1 importants dans la réponse à BMP9. Un second travail a consisté en la production de la forme mature de BMP9 et du domaine extracellulaire d'ALK1 en vue de l'étude de la structure cristallographique du complexe. L'expression des protéines et leur purification sont en phase d'optimisation. Enfin, un troisième projet consistait en l'analyse du rôle de BMP9 dans l'angiogenèse in vivo. La neutralisation de BMP9 par deux stratégies distinctes induit une augmentation de la densité vasculaire dans la rétine de la souris. Le mécanisme est en cours d'investigation.

Le recrutement des leucocytes dans les tissus est un processus courant dans toutes les maladies inflammatoires de l'adulte. Celui-ci est médié par des interactions de haute affinité entre les molécules d'adhésion endothéliales à la surface des vaisseaux sanguins et leurs ligands sur les cellules immunitaires circulantes. Ce processus implique une multitude de molécules telles que ICAM1, VCAM1 et les sélectines pour soutenir la « capture » des cellules immunitaires et leur extravasation à travers les cellules endothéliales vasculaires. Nos résultats préliminaires suggèrent que le récepteur ALK1, exprimé spécifiquement sur les cellules endothéliales, pourrait réguler l'expression de ces molécules d'adhésion. Pour examiner l'impact de la signalisation ALK1 sur le recrutement des cellules immunitaires, nous avons utilisé des lignées de cellules endothéliales siALK1 (HUVECs) traitées avec du lipopolysaccharide (LPS) pour induire un processus inflammatoire. Tout d'abord, l'expression des gènes, examinée par Ampliseq, a montré une diminution significative de l'expression de ICAM1, VCAM1 et E-sélectine dans les HUVECs siALK1 par rapport au contrôle. De plus, l'analyse par cytométrie en flux a démontré que l'expression des protéines d'adhésion augmentent dans les cellules traitées avec du LPS, mais que cet effet est atténué dans les cellules endothéliales dépourvues d'ALK1. De plus, nous avons observé que le p38 phosphorylé, un facteur qui joue un rôle clé dans le processus inflammatoire, est diminué dans les cellules siALK1. Enfin, pour étudier les conséquences fonctionnelles de la délétion d'ALK1 sur les interactions leucocytes/cellules endothéliales, un test d'adhésion en flux est réalisé, dans lequel les leucocytes circulent sur les cellules endothéliales et l'extravasation des cellules immunitaires est observée au microscope. Les résultats ont montré une diminution de l'infiltration des leucocytes dans les HUVECs siALK1 par rapport aux témoins. En conclusion, nos données démontrent qu'ALK1 a un impact majeur sur le recrutement des leucocytes vers l'endothélium par l'expression de protéines d'adhésion ainsi que par la normalisation vasculaire. Ce projet contribue à une meilleure compréhension de l'interaction entre les leucocytes et l'endothélium vasculaire. / Leukocyte recruitment into tissues is a common process in all adult inflammatory diseases. This is mediated by high affinity interactions between endothelial adhesion molecules and their counter receptor ligands on circulating immune cells. This process involves a multitude of molecules such as ICAM1, VCAM1 and selectins to support the "capture’’ of immune cells and their extravasation through vascular endothelial cells. Our preliminary results suggest that ALK1 receptor, expressed specifically on endothelial cells, could regulate the expression of these adhesion molecules. To examine the impact of ALK1 signaling on immune cells recruitment, we used siALK1 endothelial cell lines (HUVECs) treated with LPS (Lipopolysaccharide) to induce an inflammatory process. First, gene expression, examined by Ampliseq, showed a significant decrease in ICAM1, VCAM1 and E-selectin expression in siALK1 HUVECs compared to control. Furthermore, flow cytometry analysis demonstrated that adhesion protein expression increases in control cells treated with LPS, but that this effect is lessened in endothelial cells lacking ALK1. Moreover, we observed that phosphorylated p38, a factor that plays a key role in inflammatory process, is decreased in siAlk1 cells. Finally, to study the functional consequences of ALK1 deletion on leukocyte/endothelial cells interactions, a flow adhesion assay is performed, in which leukocytes circulate on endothelial cells and extravasation of immune cells is observed under a microscope. The results showed decreased leukocyte infiltration in siALK1 HUVECs compared to controls. In conclusion, our data demonstrate that ALK1 has a major impact on leukocyte recruitment to the endothelium through the expression of adhesion proteins and the vascular normalization. This project contributes to a better understanding of the interaction of leukocytes and the vascular endothelium.

Résumé: Le muscle squelettique possède une excellente capacité à se regénérer notamment grâce à ses cellules progénitrices stromales (mrSC) et myogéniques (CPM). À la suite de certains traumas et pour des raisons encore méconnues, la qualité de sa régénération est compromise ce qui mène à l’apparition de structures aberrantes tel l’os mature, aussi appelée ossification hétérotopique (OH) post-traumatique. Notre laboratoire a montré dans un modèle murin que les mrSC sont pleinement impliquées dans cette pathologie. De plus, un facteur fortement ostéoinducteur, BMP9, ne cause l’OH que si, et seulement si, le muscle est endommagé. Ce modèle d’étude est unique puisqu’il présente les particularités physiopathologiques de l’OH post-traumatique, un dommage du muscle étant essentiel à la formation d’os. De plus, ce modèle a permis de mettre en évidence le rôle prédominant du microenvironnement des cellules progénitrices dans le développement de cette pathologie. Nous avons donc émis l’HYPOTHÈSE selon laquelle le microenvironnement du muscle endommagé contient des facteurs qui peuvent influencer le phénotype de ses cellules progénitrices stromales et myogéniques favorisant ainsi le développement de l’OH. Nos résultats montrent que l’état hypoxique d’un muscle sévèrement endommagé augmente la prolifération et la différenciation ostéogénique des mrSC. De plus, l’hypoxie induit spécifiquement l’expression de BMP9 par les mrSC. L’impact de BMP9 a également été évalué sur la différenciation des CPM. Les résultats montrent qu’à des concentrations physiologiques, BMP9 inhibe le potentiel myogénique des CPM en faveur d’une différenciation ostéogénique, et cela tant dans la lignée myoblastique murine C2C12 que chez les CPM primaires humaines. En résumé, le muscle endommagé développant l’OH possède un microenvironement spécifique responsable du débalancement de la capacité régénérative de ses progéniteurs. Nos travaux montrent que ce microenvironnement cause un retard de la myogenèse et une ostéogenèse où participeront non seulement les mrSC mais également les CPM. L’identification et la compréhension des mécanismes régulant ces facteurs s’avèrent clé pour offrir aux cliniciens des outils de diagnostic mais également des alternatives ou des approches complémentaires aux traitements prophylaxiques actuels. / Abstract: Skeletal muscle has an extraordinary ability to regenerate due to its resident stromal cells (mrSCs) and myogenic progenitor cells (MPCs). Following certain traumas, the quality of the regeneration of skeletal muscle can be compromised for unknown reasons, leading to the appearance of aberrant structures such as mature bone, a process called posttraumatic heterotopic ossification (HO). Our laboratory developed a mouse model to show that mrSCs are fully involved in this pathology. We also showed that BMP9, a highly osteoinductive factor, causes HO if and only if the muscle is damaged. This model is unique in that it recapitulates the pathophysiological features of post-traumatic HO in which muscle damage is essential for bone formation. The model was also used to show that the progenitor cell microenvironment plays a predominant role in the development of this pathology. Based on these results, we HYPOTHESIZED that the microenvironment of the damaged muscle contains factors that can influence the phenotype of its progenitor cell populations, thus promoting the development of HO. Our results showed that the hypoxic state of a severely damaged muscle increases the proliferation and osteogenic differentiation of mrSCs and also specifically induces the expression of BMP9 by mrSCs. The impact of BMP9 on the differentiation of MPCs was also evaluated. At physiological concentrations, BMP9 inhibited the myogenic differentiation potential of murine myoblast C2C12 cells and primary human MPCs, and triggered their differentiation into an osteogenic lineage. In summary, we showed that damaged muscle that develops HO has a specific microenvironment that is responsible for the loss of the regenerative capacity of progenitor cells, leading to a delay in myogenesis, and that mrSCs and MPCs are both involved in osteogenesis. The identification and understanding of the mechanisms regulating these key factors could provide clinicians with valuable diagnostic tools as well as alternative and/or complementary approaches to current prophylactic treatments.

Un endothélium vasculaire rétinien quiescent est essentiel dans l’approvisionnement et le maintien de l’homéostasie tissulaire afin d’assurer la fonction visuelle. L’hyperglycémie chronique dans le diabète peut mener à des complications reliées à plusieurs changements structuraux et fonctionnels de l’endothélium. Ces changements se manifestent souvent par des vaisseaux instables et hyperperméables, résultant en un tissu rétinien inadéquatement perfusé. Ces altérations sont rencontrées dans la pathophysiologie de l’œdème maculaire diabétique (OMD) qui affecte plus du quart des diabétiques. L’inhibition du facteur de perméabilité vasculaire VEGF-A a révolutionné le traitement de l’OMD, mais est aussi associée à des effets secondaires non négligeables reliés à leur non-spécificité et à une compréhension incomplète des mécanismes régulant la perméabilité vasculaire. Un ciblage spécifique de l’endothélium permettant la récupération de la quiescence et la stabilité physiologique réduisant l’hyperperméabilité pourrait fournir un nouvel outil thérapeutique. La BMP9 (Bone morphogenetic protein 9), qui est mise en circulation par le foie, est connue comme facteur de quiescence et de stabilité vasculaire ainsi que pour son effet sur l’homéostasie du glucose. Ces aspects étant peu documentés dans un contexte diabétique, nous avons évalué les capacités de la BMP9 sur la stabilisation de l’endothélium rétinien et ses effets paracrines/autocrines sur la gluconéogenèse hépatique. Nous avons démontré que la signalisation canonique de la BMP9/Smad1,5,9 via son récepteur spécifique à l’endothélium Alk1, était déficiente dans un modèle murin de diabète, ce qui exacerbe l’hyperperméabilité endothéliale rétinienne. À l’inverse, la surexpression de la BMP9 par un modèle murin de livraison adénovirale récupère la perméabilité physiologique, associée principalement à un renforcement des jonctions interendothéliales en limitant l’action du VEGF. De plus, nous avons trouvé que la BMP9 améliore le contrôle glycémique chez les souris diabétiques par l’inhibition de la gluconéogenèse hépatique, via la voie non-canonique Alk3/FOXO1. Fondamentalement, ce travail met en évidence les mécanismes régissant la perméabilité endothéliale dans un contexte diabétique, fournissant une alternative thérapeutique contre l’OMD. La régulation de la perméabilité rétinienne par la BMP9 s’effectue à plusieurs niveaux, indirectement par le contrôle glycémique, et directement par la solidification jonctionnelle de la barrière endothéliale rétinienne, réhabilitant ainsi la quiescence et la stabilité de l'endothélium physiologique. / A quiescent retinal vascular endothelium is essential for the supply and maintenance of tissue homeostasis to ensure proper visual function. Chronic hyperglycemia in diabetes can lead to multiple complications related to several structural and functional changes in the endothelium, characterized by unstable and hyperpermeable vessels resulting in an inadequately perfused retinal tissue. These alterations are encountered in the pathophysiology of diabetic macular edema (DME), which affects more than a quarter of diabetics. Inhibition of the vascular permeability factor VEGF-A has revolutionized the treatments of DME but is associated with non-negligible side effects related to their non-specific action combined with an incomplete understanding of the mechanisms regulating vascular permeability. Specific endothelial targeting aiming to recover quiescence and reducing hyperpermeability could provide new therapeutic tools for the treatment or prevention of DME. BMP9 (Bone morphogenetic protein 9), which is produced by the liver, is known as a vascular quiescence and stability factor as well as for its effects on glucose homeostasis. Since these aspects are poorly documented in a diabetic context, we investigated BMP9’s capabilities on endothelium stabilization and its paracrine/autocrine effects on hepatic gluconeogenesis. In our studies, we found that the canonical BMP9/Smad1,5,9 signaling, via its physiological Alk1 endothelium-specific receptor, was deficient in a murine model of diabetes, which exacerbates retinal endothelial hyperpermeability. In contrast, adenoviral overexpression of BMP9 recovers physiological permeability, which was primarily associated with the enhancement of interendothelial junctions by limiting the action of VEGF. In addition, we found that BMP9 improves glycemic control in diabetic mice by inhibition of hepatic gluconeogenesis via the non-canonical ALK3/FOXO1 pathway. Fundamentally, this work highlights new insights of the mechanisms governing endothelial permeability in a diabetic context, providing a therapeutic alternative against DME. Regulation of retinal permeability by BMP9 occurs on several levels, indirectly, through glycemic control, and directly through the junctional solidification of the hyperglycemic retinal endothelial barrier, thus rehabilitating the quiescence and stability of the physiological endothelium.