ENGLISH : The use of different characteristics (the polyphasic approach) to describe bacterial taxa is a prerequisite for a stable classification. The taxonomy of root- and stem-nodulating rhizobia is in a state of transition. As more legumes are studied, new species and genera of rhizobia are described. It is important to study the indigenous South African rhizobia, as without them a complete rhizobial taxonomy is not possible. Furthermore, strains with superior nitrogen fixation abilities may be discovered. Indigenous strains better adapted to the harsh South African environment are possible candidates for commercial inoculants for cropped legumes.Only two local studies have been done on the diversity of the indigenous rhizobia. These studies revealed the diversity of rhizobia existing in the South African context. As part of a polyphasic approach used to identify and determine the diversity of the indigenous rhizobia, 16S rDNA sequencing analysis was performed on some selected rhizobial and putative rhizobial isolates. The aim of the study was to characterise and identify the indigenous isolates by 16S rDNA sequencing analysis and compare our data with those available in the GenBank database. Results showed that most of the indigenous isolates were slow-growers belonging to the genus Bradyrhizobium. Two isolates from supposedly non-nodulating legume genera (Cassia and Senna) were found to belong to the genus Bradyrhizobium. Some of the isolates were shown to belong to the genera Mesorhizobium, Rhizobium and Sinorhizobium. The identity of five isolates was not clear and further studies need to be performed to unequivocally determine their taxonomic position. Partial sequence analysis of 16S rDNA proved a valuable tool to characterise and identify the indigenous isolates. However, the method was unable to clearly distinguish between closely related species and strains. AFRIKAANS : 'n Stabiele klassifikasiesisteem vir die beskrywing van bakteriese taksa is slegs moontlik deur verskillende eienskappe (die poli-fasiese benadering) te gebruik. Die taksonomie van die wortel- en stamnodulerende rhizobiums verander gedurig. 'n Volledige rhizobiumtaksonomie is slegs moontlik indien die inheemse Suid-Afrikaanse rhizobiums bestudeer word. Geharde inheemse rasse met voortreflike stikstofbindende vermoens kan ontdek word. Hierdie rasse is kandidate vir kommersiele inokulums vir verboude peulplante. Net twee plaaslike studies is gedoen om die diversiteit van die inheemse rhizobiums te bepaal. Die studies het bewys dat die inheemse rhizobiums baie divers is. As deel van die polifasiese benadering om die diversiteit van die inheemse rhizobiums te identifiseer en te bepaal, is 16S rDNS volgordebepaling gedoen op uitgesoekte rhizobia en sogenaamde rhizobia isolate. Die doel van die studie was die karakterisering en identifisering van die inheemse isolate deur 16S rDNS volgordebepaling en die vergelyking van die data met die beskikbaar in die GenBank databasis. Die resultate wys dat die meeste inheemse isolate stadige groeiers is en dus behoort aan die genus Bradyrhizobium. Twee isolate vanaf sogenaamde nie-nodulerende peulplantgenusse (Cassia en Senna) behoort ook tot die genus Bradyrhizobium. Sommige isolate behoort tot die genusse Mesorhizobium, Rhizobium en Sinorhizobium. Die identiteit van vyf isolate was nie duidelik nie en verdere studies is nodig om hul taksonomiese posisie ondubbelsinnig te bepaal. Die gedeeltelike volgordebepaling van die 16S rDNS was 'n waardevolle hulpmiddel om die inheemse isolate mee te karakteriseer en te identifiseer, alhoewel die metode nie tussen nabyverwante spesies en rasse kon onderskei nie. Copyright / Dissertation (MSc (Microbiology))--University of Pretoria, 1999. / Microbiology and Plant Pathology / unrestricted

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Legumes are unique plants because they form special structures “nodules”, via symbiotic relationships with rhizobial bacteria present in the soil. Once rhizobia mature inside nodules, they fix atmospheric nitrogen providing a source of bioavailable nitrogen to the plant. To discover novel genetic components involved in the legume-rhizobia symbiosis by using forward genetic screening, we have isolated Medicago truncatula Tnt1 insertion mutants in the R108 ecotype, which are defective in nodule development and symbiotic nitrogen fixation in response to Sinorhizobium meliloti. Out of three mutants NF11044, NF11217 and NF8324, one of the mutants showed brown nodules and Fix- phenotype that is defective in symbiotic nitrogen fixation. The other two mutants showed white nodules and Fix- phenotype, also indicator of defects in symbiotic nitrogen fixation. To identify the underlying mutation causing the phenotype, we have developed molecular genetic markers by obtaining genomic sequences flanking the Tnt1 insertions by TAIL-PCR and Illumina sequencing. To carry out co-segregation analysis, back-crossed BC1F2 segregating populations were obtained. These are being phenotyped, genotyped and analyzed for co-segregation of the phenotype with the Tnt1 genetic markers. Back-crossing also has the effect of reducing the Tnt1 insertions, which are not linked to the nodulation defective phenotypes. Out of the three mutants, NF8324 harbors exactly the same insertion as in the rsd-1 Tnt1 mutant NF11265. The defect in NF11217 is caused by a Tnt1 insertion in the previously described PLC gene; the site of this insertion is close to that found in a different mutant, NF0217. For mutant NF11044, we developed linkage markers that place the defective locus on chromosome 7. To further characterize co-segregation in NF11044, a mapping population has been created by crossing the mutant with other ecotypes: A17 and A20. We tested mutants and wild type plants with linkage marker A20 X NF11044 BC1F2 that segregates 3:1(wild type: mutant). The recombination frequency ratio is similar as compared to back-crosses to ecotype R108. However, we did not observe mutant phenotypes in the A17 X NF11044 BC1F2 population. Future identification of the defective gene and functional characterization of it once it is identified will be carried out to better understand the mechanism of nodule organogenesis and symbiotic nitrogen fixation.

Iron is the 4th most abundant metal on the earth's crust and is required by most organisms as a cofactor for many enzymes; however, at physiological pH and aerobic conditions iron forms insoluble ferric oxyhydroxide polymers. Siderophores are low molecular weight compounds that scavenge ferric ions, bind with high affinity, and transport it into the cell via multicomponent transport systems. Rhizobia are soil dwelling organisms that form symbiotic relationships with host plants and fix atmospheric nitrogen, while the bacteria receive nutrients. R. leguminosarum IARI 917 produces a siderophore characterized as 'schizokinen'. In the present study, we have characterized the binding and transport kinetics of 'schizokinen' and have also attempted to identify the genes involved in its biosynthesis using mini Tn5 random mutagenesis. DNA sequence analysis of a non siderophore producing transconjugant revealed a gene involved in PAC/PAS signal transduction systems that respond to many extracellular cues.

La déficience en phosphore est l’un des facteurs limitant la production de légumineuses à graines, dont le haricot (Phaseolus vulgaris). La diversité génétique de cette espèce en Amérique latine a permis d'identifier avec le CIAT, des lignées recombinantes du croisement de DOR364 et BAT477 à fort pouvoir fixateur d'azote (FSN) et à forte efficacité d'utilisation de phosphore (EUP). Les résultats obtenus au cours de ce travail nous ont permis de répondre à notre objectif principal de thèse qui consistait à vérifier la pertinence des critères d'adaptation de la fixation symbiotique de l'azote chez le haricot à la disponibilité de P que nous avons déterminé. Nous avons démontré, d'une part, en milieu hydroaéroponique, que les racines nodulées du haricot, excrètent dans leur rhizosphère une quantité de H+ qui est corrélée à la perméabilité nodulaire. Ce qui laisse penser qu'une part d'H+ excrétée par les racines nodulées est liée à la fixation symbiotique de N2. D'autre part, nous avons démontré que sous déficience en P les lignées tolérantes acidifient plus leur rhizosphère que les sensibles. En multisites les facteurs les plus déterminants de la hiérarchisation des sites sont N-total et P-total. Deux groupes de lignées se distinguent, les tolérantes versus les sensibles à la faible fertilité des sols en P. La lignée locale se distingue des groupes précédents. Elle est capable de croître dans différents sols, notamment les contraignants avec une grande capacité à noduler, par conséquent, à compenser la déficience en N. Nous avons également pu démontrer que les biomasses nodulaire et aérienne sont corrélées au P Olsen du sol / Phosphorus deficiency is one of the limiting factor for grain legume production like bean (Phaseolus vulgaris). The results obtained during this work enabled us to confirm our main aim of this work which is checking the relevance of the criteria of adaptation of the symbiotic nitrogen fixation of bean to P availability. We showed, in controlled conditions that the nodulated roots of bean, release in their rhizosphere a quantity of H+ which is correlated with the nodul permeability. What lets think that a share of H+ released is related to the symbiotic N2 fixing. In addition, we showed that under P deficiency the tolerant lines acidify more their rhizosphere that the sensitive ones. Into multisite trial the most determining factors of the hierarchisation of the sites are total-N and total-P. Two groups of lines are distinguished: tolerant versus sensitive to P deficiency. The local farmer line is distinguished from the studied lines. It is able to grow in various soil fertility, in particular the constraining soils. ones with a great capacity with noduler, consequently, to compensate for deficiency in NR. We also could show that shoot and nodule biomass are correlated with the Olsen-P Olsen of the soil

Bradyrhizobium japonicum ist ein Bodenbakterium, welches in der Lage ist mit der bedeutenden Agrarpflanze Sojabohne zu interagieren und deren Wachstum zu fördern. In der vorliegenden Arbeit wurde das Genistein-Stimulon und verschiedenen Stressantworten von B. japonicum mittels Mikroarrayanalyse bestimmt. 101 Gene werden nach Genisteinzugabe induziert. NodW ist der Hauptaktivator der Genistein-induzierbaren Gene, welche zum Großteil kein nod-Box-Motiv in der Promotorregion aufweisen. Einzig acht Gene, wovon sieben für Transportersysteme kodieren, zeigen in der NodW-Mutante 613 nach Genisteinzugabe weiterhin ein erhöhtes Expressionsniveau. In weiterführenden Arbeiten konnte für zumindest ein Transportersystem (Bll4319/Bll4320/Bll4321) neben der Genistein-Abhängigkeit auch eine Regulation durch den Genistein-abhängigen TetR-Regulator FrrA nachgewiesen werden [Günther 2007; Bhandari 2008]. Dies zeigt, dass NodW in weiterführende Regulationskaskaden eingebunden sein muss, wobei diese in der vorliegenden Arbeit nicht näher charakterisiert wurden. Die Mikroarraydaten geben lediglich Hinweise auf mögliche Regulationskaskaden. Anhand der Mikroarraydaten liegt die Vermutung nahe, dass die Transkriptionsaktivierung des lateralen Flagellenclusters ebenfalls einer indirekten NodW-abhängigen Regulation unterliegt. Durch Pflanzentests war bekannt, dass es B. japonicum 901 möglich ist, den NodW-Defekt bei der Nodulation der Wirtspflanzen zu überwinden [Grob et al. 1993]. Dies beruht auf die Überexpression des 2-Komponentenregulators NwsB. So können Symbiose-relevante Gene wie die nod-Box-assoziierten Gene ähnlich dem Wildtyp nach Genistein-Zugabe induziert werden. NwsB ist aber nicht in der Lage, das Flagellarcluster der lateralen Flagellen (bis auf blr6846) nach Genistein-Zugabe zu induzieren. Dies bedeutet, dass trotz der hohen Ähnlichkeit zwischen den 2-Komponentenregulatoren NodW und NwsB, die Bindestellen in der Promotorregion der Genistein-induzierbaren Genen nicht identisch sind. Die NodD1-Mutante 1267 ist in der Lage, weiterhin Knöllchen mit allen Wirtspflanzen von B. japonicum zu bilden [Göttfert et al. 1992], was wahrscheinlich auf ein funktionelles NodW als Hauptaktivator der nodYABC-Operons zurückzuführen ist. Anhand der Mikroarraydaten ist festzustellen, dass kein weiteres nod-Box-assoziiertes Operon in der NodD1-Mutante 1267 verstärkt exprimiert vorliegt. Dies könnte bedeuten, dass NodW die Transkription von nodD1 und des nodYABC-Operons startet und später durch NodD1 in der Aktivierung der nod-Box-assoziierten Gene unterstützt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die transkriptionelle Stressantwort von B. japonicum hinsichtlich pH 4, pH 8, 80 mM NaCl, Hitzeschock und Temperaturstress analysiert. Dabei konnten sowohl Aussagen über Gene, welche in die allgemeine als auch in die spezifische Stressantwort eingebunden sind, getroffen werden. Die transkriptionelle Antwort auf pH 8 war mit 1636 differenziell exprimierten Genen die umfangreichste Stressantwort der vorliegenden Arbeit. Hierbei konnte gezeigt werden, dass B. japonicum bei pH-Stress besonders Gene der pHi-Homöostase aktiviert. Dies umfasst sowohl Transportergene als auch enzymatische Gene. Interessant waren die differenziell exprimierten Gene, welche bei pH 8 verstärkt und bei pH 4 verringert exprimiert vorlagen. Diese Gene besitzen im Promotorbereich eine RegR-Box und sind in der transkriptionellen Aktivierung von RegR abhängig [Lindemann et al. 2007]. Aufgrund der Homologie des RegSR-Systems von B. japonicum mit dem pH-abhängigen ActSR-System von S. meliloti besteht die Möglichkeit, dass RegSR ebenfalls in die pH-abhängige Regulation dieser Gene eingebunden ist. Neben solch spezifischen Stressantworten konnte auch eine allgemeine Stressantwort ermittelt werden. So weisen fünf Gene ein gleiches Expressionsmuster in den untersuchten Stressanalysen dieser Arbeit auf. blr5264 kodiert hierbei für einen 2-Komponenten-Hybridsensor und -Regulator und könnte als Regulator in die allgemeine Stressantwort von B. japonicum eingebunden sein. Aus diesem Grund wurde Blr5264 in GscR (general stress control regulator) umbenannt. Mittels Mutagenese von gscR wurde B. japonicum D826 erzeugt, dessen Transkriptom bezüglich Salzstress und Hitzeschock verifiziert wurde. Es wurden 87 Gene identifiziert, welche bei Stresseinfluss von GscR abhängig sind. Hierunter sind sieben verringert exprimierte Gene, welche bei Stress im Wildtyp verstärkt exprimiert vorliegen. Diese scheinen demzufolge bei Stress durch GscR transkriptionell aktiviert zu werden. Das interessanteste Gen war hierbei blr7881, welches für einen ArsR-Typ-Regulator kodiert und einen weiteren Schritt in der allgemeinen Stressantwort von B. japonicum sein könnte.

A fundamental goal in ecology and evolutionary biology has been to understand how microevolutionary forces affect the origin and maintenance of mutualisms over ecological and evolutionary time scales. Mutualistic partners vary in the reciprocal benefits they provide, yet the role of partner variation on microevolutionary forces that impact the maintenance of mutualisms is unclear. Using the mutualism between legumes and nitrogen fixing symbionts, my dissertation investigated the ecological and evolutionary consequences of variation in partner quality. In the first experiment, I demonstrate how insect herbivory can change the costs and benefits of associating with exploiters, and that some degree of exploitation from non-beneficial rhizobia can reduce insect herbivory, thus removing the fitness advantage of associating purely with beneficial rhizobia. In the second study, I examine how rhizobia genotype modifies competition between hosts grown in kin and non-kin groups. I show that lower fitness in plant kin groups can simply be a by-product of genetic variance in plant size and non-linear relationships between plant size and fitness. I further show that the symbiotic community can change difference in fitness between kin and non-kin groups independent of these by-product effects. In my last chapter, I provide the first empirical evidence that an important mechanism for mutualism stability-- the ability for hosts to preferentially associate with beneficial rhizobia-- is genetically variable and can evolve in response to exploitation. I also show that host preference for beneficial rhizobia can be maintained in legume populations, even in the absence of exploitation. My dissertation provides insight into the potential evolutionary dynamics of stabilizing mechanisms by suggesting that the agents of selection that affect the level of host exploitation can come from biotic factors other than the exploiters themselves. My dissertation has also shown that inclusion of other ecological interactions, such as herbivory, can provide valuable perspective on fitness effects of symbionts on their hosts, and can even change our fundamental assumptions about the effects of exploitation on host fitness, which has formed the backbone of mutualism theory.

A fundamental goal in ecology and evolutionary biology has been to understand how microevolutionary forces affect the origin and maintenance of mutualisms over ecological and evolutionary time scales. Mutualistic partners vary in the reciprocal benefits they provide, yet the role of partner variation on microevolutionary forces that impact the maintenance of mutualisms is unclear. Using the mutualism between legumes and nitrogen fixing symbionts, my dissertation investigated the ecological and evolutionary consequences of variation in partner quality. In the first experiment, I demonstrate how insect herbivory can change the costs and benefits of associating with exploiters, and that some degree of exploitation from non-beneficial rhizobia can reduce insect herbivory, thus removing the fitness advantage of associating purely with beneficial rhizobia. In the second study, I examine how rhizobia genotype modifies competition between hosts grown in kin and non-kin groups. I show that lower fitness in plant kin groups can simply be a by-product of genetic variance in plant size and non-linear relationships between plant size and fitness. I further show that the symbiotic community can change difference in fitness between kin and non-kin groups independent of these by-product effects. In my last chapter, I provide the first empirical evidence that an important mechanism for mutualism stability-- the ability for hosts to preferentially associate with beneficial rhizobia-- is genetically variable and can evolve in response to exploitation. I also show that host preference for beneficial rhizobia can be maintained in legume populations, even in the absence of exploitation. My dissertation provides insight into the potential evolutionary dynamics of stabilizing mechanisms by suggesting that the agents of selection that affect the level of host exploitation can come from biotic factors other than the exploiters themselves. My dissertation has also shown that inclusion of other ecological interactions, such as herbivory, can provide valuable perspective on fitness effects of symbionts on their hosts, and can even change our fundamental assumptions about the effects of exploitation on host fitness, which has formed the backbone of mutualism theory.

The symbiosis between plants of the legume family and nitrogen-fixing rhizobia underpins global food security. Legume crops are a major source of protein in human diets, either directly or indirectly as feed for livestock. Application of inoculant rhizobial strains is common practice in many areas, as plant growth is often nitrogen limited and the symbiosis can significantly enhance yields. However, rhizobial strains and outcomes of the symbiosis vary widely. This variation has also been studied by evolutionary biologists interested in the stability of mutualisms. They proposed that plants may prevent establishing symbioses with ineffective strains (partner choice), or provide them with fewer resources (sanctioning). I studied both mechanisms, combining modelling and experimental approaches. Mathematical modelling was used to predict how plants should allocate resources to maximise growth rates, depending on rhizobial nitrogen provision and carbon requirements and on soil nitrogen conditions. The use of marked mutant strains – easily distinguishable and differing in a single rhizobial characteristic – overcame previous experimental difficulties. It was found that pea (Pisum sativum L.) plants are not able to exert partner choice, but do sanction in a more complex way than was previously established. In line with model predictions, resources were preferentially allocated to the single – best available – strain, so that resources allocated to an intermediate-fixing strain depended on whether or not a strain providing more nitrogen was available. Contrary to model predictions, there was no indication of discrimination based on rhizobial carbon requirements. The results cannot be explained by resource allocation in proportion to nitrogen received, and indicate systemic integration of information from different nodules. I formulate a hypothesis about the underlying plant regulatory mechanisms, and discuss implications of the results for selecting inoculant strains and enhancing yields in the field. Future work will rely on further integration of theoretical and applied methods and perspectives.

Bradyrhizobium japonicum ist ein Bodenbakterium, welches in der Lage ist mit der bedeutenden Agrarpflanze Sojabohne zu interagieren und deren Wachstum zu fördern. In der vorliegenden Arbeit wurde das Genistein-Stimulon und verschiedenen Stressantworten von B. japonicum mittels Mikroarrayanalyse bestimmt. 101 Gene werden nach Genisteinzugabe induziert. NodW ist der Hauptaktivator der Genistein-induzierbaren Gene, welche zum Großteil kein nod-Box-Motiv in der Promotorregion aufweisen. Einzig acht Gene, wovon sieben für Transportersysteme kodieren, zeigen in der NodW-Mutante 613 nach Genisteinzugabe weiterhin ein erhöhtes Expressionsniveau. In weiterführenden Arbeiten konnte für zumindest ein Transportersystem (Bll4319/Bll4320/Bll4321) neben der Genistein-Abhängigkeit auch eine Regulation durch den Genistein-abhängigen TetR-Regulator FrrA nachgewiesen werden [Günther 2007; Bhandari 2008]. Dies zeigt, dass NodW in weiterführende Regulationskaskaden eingebunden sein muss, wobei diese in der vorliegenden Arbeit nicht näher charakterisiert wurden. Die Mikroarraydaten geben lediglich Hinweise auf mögliche Regulationskaskaden. Anhand der Mikroarraydaten liegt die Vermutung nahe, dass die Transkriptionsaktivierung des lateralen Flagellenclusters ebenfalls einer indirekten NodW-abhängigen Regulation unterliegt. Durch Pflanzentests war bekannt, dass es B. japonicum 901 möglich ist, den NodW-Defekt bei der Nodulation der Wirtspflanzen zu überwinden [Grob et al. 1993]. Dies beruht auf die Überexpression des 2-Komponentenregulators NwsB. So können Symbiose-relevante Gene wie die nod-Box-assoziierten Gene ähnlich dem Wildtyp nach Genistein-Zugabe induziert werden. NwsB ist aber nicht in der Lage, das Flagellarcluster der lateralen Flagellen (bis auf blr6846) nach Genistein-Zugabe zu induzieren. Dies bedeutet, dass trotz der hohen Ähnlichkeit zwischen den 2-Komponentenregulatoren NodW und NwsB, die Bindestellen in der Promotorregion der Genistein-induzierbaren Genen nicht identisch sind. Die NodD1-Mutante 1267 ist in der Lage, weiterhin Knöllchen mit allen Wirtspflanzen von B. japonicum zu bilden [Göttfert et al. 1992], was wahrscheinlich auf ein funktionelles NodW als Hauptaktivator der nodYABC-Operons zurückzuführen ist. Anhand der Mikroarraydaten ist festzustellen, dass kein weiteres nod-Box-assoziiertes Operon in der NodD1-Mutante 1267 verstärkt exprimiert vorliegt. Dies könnte bedeuten, dass NodW die Transkription von nodD1 und des nodYABC-Operons startet und später durch NodD1 in der Aktivierung der nod-Box-assoziierten Gene unterstützt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die transkriptionelle Stressantwort von B. japonicum hinsichtlich pH 4, pH 8, 80 mM NaCl, Hitzeschock und Temperaturstress analysiert. Dabei konnten sowohl Aussagen über Gene, welche in die allgemeine als auch in die spezifische Stressantwort eingebunden sind, getroffen werden. Die transkriptionelle Antwort auf pH 8 war mit 1636 differenziell exprimierten Genen die umfangreichste Stressantwort der vorliegenden Arbeit. Hierbei konnte gezeigt werden, dass B. japonicum bei pH-Stress besonders Gene der pHi-Homöostase aktiviert. Dies umfasst sowohl Transportergene als auch enzymatische Gene. Interessant waren die differenziell exprimierten Gene, welche bei pH 8 verstärkt und bei pH 4 verringert exprimiert vorlagen. Diese Gene besitzen im Promotorbereich eine RegR-Box und sind in der transkriptionellen Aktivierung von RegR abhängig [Lindemann et al. 2007]. Aufgrund der Homologie des RegSR-Systems von B. japonicum mit dem pH-abhängigen ActSR-System von S. meliloti besteht die Möglichkeit, dass RegSR ebenfalls in die pH-abhängige Regulation dieser Gene eingebunden ist. Neben solch spezifischen Stressantworten konnte auch eine allgemeine Stressantwort ermittelt werden. So weisen fünf Gene ein gleiches Expressionsmuster in den untersuchten Stressanalysen dieser Arbeit auf. blr5264 kodiert hierbei für einen 2-Komponenten-Hybridsensor und -Regulator und könnte als Regulator in die allgemeine Stressantwort von B. japonicum eingebunden sein. Aus diesem Grund wurde Blr5264 in GscR (general stress control regulator) umbenannt. Mittels Mutagenese von gscR wurde B. japonicum D826 erzeugt, dessen Transkriptom bezüglich Salzstress und Hitzeschock verifiziert wurde. Es wurden 87 Gene identifiziert, welche bei Stresseinfluss von GscR abhängig sind. Hierunter sind sieben verringert exprimierte Gene, welche bei Stress im Wildtyp verstärkt exprimiert vorliegen. Diese scheinen demzufolge bei Stress durch GscR transkriptionell aktiviert zu werden. Das interessanteste Gen war hierbei blr7881, welches für einen ArsR-Typ-Regulator kodiert und einen weiteren Schritt in der allgemeinen Stressantwort von B. japonicum sein könnte.