Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2008). In ProQuest dissertations and theses. Publié aussi en version papier.

Un développement racinaire optimal est essentiel pour favoriser la croissance des plantes et leur permettre d’accéder à de meilleurs rendements. La plupart de nos connaissances concernant le contrôle moléculaire du développement racinaire a été acquise grâce à l’étude de la plante modèle dicotylédone Arabidopsis thaliana. Les racines de riz, plante modèle des monocotylédones, présentent une anatomie semblable à celle d’A.thaliana. Ces deux systèmes racinaires sont caractérisés par une organisation concentrique des tissus autour de la stèle. Entre l’endoderme et l’épiderme, le riz présente deux couches plus externes, appelées le sclérenchyme et l’exoderme, ainsi que plusieurs couches de cortex dans la zone centrale. Chacun de ces tissus possèdent des spécificités anatomiques et moléculaires qui leur confèrent des rôles divers dans le développement et la croissance de la racine. Le nombre de couches variable de cortex dépend du type de racines, du stade de développement de la plante et des conditions environnementales. Le tissu cortical a un rôle structurel, fonctionnel et adaptatif essentiel pour les racines de riz. La différenciation du cortex et de l’endoderme a été longuement étudiée chez A.thaliana durant la dernière décennie. Le gène SHORT-ROOT (SHR) a été identifié comme un gène clé dans leur formation. Un modèle moléculaire a été développé, où SHR est transcrit dans la stèle, et la protéine migre jusque l’endoderme où elle active la transcription du gène SCARECROW (SCR). Ensemble SHR et SCR induisent la division périclinale asymétrique d’une cellule initiale, permettant la formation des deux couches de tissus internes que sont l’endoderme et le cortex. Chez le riz, il existe des orthologues de SHR et SCR, qui sont apparus suite à des duplications, appelés OsSHR1 & OsSHR2 et OsSCR1 & OsSCR2. Au sein de cette thèse nous avons tenté d’identifier le rôle des gènes OsSHR1&2 dans la mise en place des différentes couches de cortex chez le riz. / Optimal root development is central for plants to reach maximum growth and yield. Most of our knowledge regarding genes involved in root development has been accumulated in the dicotyledon model plant Arabidopsis thaliana. Roots of rice, the monocotyledon model, present several extra ground tissue layers compared to A. thaliana. Between epidermis and endodermis, rice possesses two outer cell layers, exodermis and schlerenchyma, and a multilayered cortex. All these tissues have specific cell identity, anatomical and molecular adaptations related to their diverse roles in root growth and function. Variation in the number of cortex cell layers depends on the rice root type and cortex is one of the key tissues for rice adaptation to submergence and tolerance to other environmental stresses. Cortex and endodermis differentiation in A. thaliana has been extensively studied during the last 10 years. Thereby, SHORTROOT (SHR) gene in Arabidopsis thaliana has been identified as a key gene required for their formations. An elegant model was developed, where SHR is transcribed in stele tissue and its protein moves to the endodermis where it activates SCARECROW (SCR) transcription. Together, SHR and SCR induce periclinal division of the ground tissue initial separating cortex and endodermis cell layers. Cortex formation in rice represents an intriguing contrast to A. thaliana. Variations in the number of cortex cell layers can be observed between the root types and during rice development. There should be a control mechanism for the number of cortical cell layers, and SCR and SHR rice orthologs represent good candidates. Two duplications in rice led to apparition ortholog genes of AtSHR (OsSHR1 and OsSHR2) and we have addressed the question of their respective function in cortex formation in rice root.

Manipulation de la recombinaison chez une plante cultivée, le riz.L’accroissement prévisible de la population mondiale ainsi que les conséquences du changement climatique obligent les sélectionneurs à créer de nouvelles variétés plus productives et plus résilientes. Les nouvelles combinaisons d’allèles favorables sont issues de la recombinaison génétique entre chromosomes homologues dont le siège est la prophase de première division de méiose. De récentes avancées chez la plante modèle Arabidopsis ont montré que l'inactivation de certains gènes permet de manipuler la méiose pour abolir ou au contraire augmenter très significativement la recombinaison. Les mécanismes de la méiose étant relativement bien conservés chez les eucaryotes, l’objectif de cette thèse était de transposer ces avancées chez une plante cultivée importante, le riz. Abolir la recombinaison méiotique permettrait de propager de façon clonale par grain des formules variétales hybrides F1 dont le rendement est de 20% supérieur à celui des lignées pures chez le riz mais dont les semences restent peu utilisées par les riziculteurs de subsistance. Les travaux réalisés dans une première partie de la thèse ont montré que le cumul de trois mutations Ososd1, pair1 et Osrec8, permettait d’obtenir des gamètes clonaux diploïdes mâles et femelles. Le phénotype apoméiotique obtenu, appelé MiMe (Mitosis instead of meiosis) chez Arabidopsis, peut être utilisé pour tester différentes stratégies d’induction de la parthénogenèse afin de produire des grains formant des plantes diploïdes clonales apomictiques. Une optimisation du mécanisme permettrait d'envisager l'utilisation de l'apomixie pour fixer l'hétérosis dans les semences hybrides F1. Par ailleurs, une augmentation globale ou locale de la recombinaison méiotique est recherchée car elle permettrait de diminuer la taille des populations de sélection et de réduire la taille des segments chromosomiques introduits dans les variétés élite de riz. Nous avons montré dans une seconde partie, que la mutation du gène OsRECQl4 codant pour une hélicase permet d'augmenter le taux de recombinaison d'un facteur de 3,3 fois faisant passer la taille de la carte génétique de 1670 cM à 5538 cM sans affecter la fertilité de la plante ni le déroulement de la méiose. Chez les plantes affectées dans la fonction d’une autre hélicase, OsFANCM, le taux de recombinaison a été également augmenté mais dans une moindre mesure (x 2,2). L’augmentation de la recombinaison s’opère sur l'ensemble des bras chromosomiques sauf au niveau des centromères. Ces résultats confirment ceux obtenus chez A. thaliana qui ont montré le rôle de régulateur négatif des crossing-overs (CO) des protéines RECQ4 et FANCM. La combinaison en cours de ces mutations entre elles ou avec celle affectant l’AAA-ATPase FIGL1 permet d’espérer une augmentation de la recombinaison encore supérieure. Ces résultats ouvrent la voie à l'utilisation des gènes anti-COs pour augmenter de façon globale le nombre de recombinants dans les croisements chez le riz et sans doute chez les autres céréales. Pour offrir une possibilité concrète aux sélectionneurs d'utiliser les gènes anti-CO, nous avons montré que la technologie CRISPR/cas9 permet d'éteindre l'expression de OsFANCM OsRECQl4 et OsFIGL1. / Manipulation of recombination in a crop, rice.The forecasted increase of world population as well as the consequences of global climate change oblige plant breeders to develop new varieties that are both more productive and resilient. Novel combinations of favourable alleles are generated through genetic recombination between homologous chromosomes, which occurs during the prophase of the first division of meiosis. Recent advances in the model plant Arabidopsis have demonstrated that the inactivation of some genes allows meiosis manipulation resulting in either an abolishment or in contrast, a significant enhancement of meiotic recombination. The meiosis mechanisms being relatively conserved across eucaryotes, the overall objective of this thesis was to transfer these advances to a crop of crucial importance, rice. To abolish meiotic recombination would allow the clonal propagation by seeds of F hybrids, which exhibit a 20% yield enhancement compared to that of pure lines in rice but remain rarely used in subsistence farming. In a first part, we showed that rice plants cumulating 3 mutations inactivating Ososd1, pair1 and Osrec8, formed clonal diploid male and female gametes. This apomeiotic phenotype, called MiMe (Mitosis instead of meiosis) in Arabidopsis, can serve as material to assay several strategies of parthenogenetic induction that would result in seed forming diploid clonal plants. Further optimization of the mechanisms would allow the use of apomixis to fix heterosis in hybrid seeds. Global and local enhancement of recombination is another desirable goal since it would allow a reduction in breeding population size and a downsizing of the introgressed chromosomal segments in elite plant materials. In a second part, we showed that mutation in the DNA helicase gene OsRECQl4 conducted to a 3.3 fold increase of recombination and inflated the genetic map size from de 1670 cM to 5538 cM, without altering plant fertility nor meiosis progression. Plants altered in a second DNA helicase, OsFANCM, exhibited a more modest 2.2 fold recombination enhancement. Recombination increase operated along the whole chromosome arms except at the centromere level. These results confirms the negative regulator role of RECQ4 and FANCM on crossing overs (CO), previously reported in Arabidopsis. On going combination of these mutations together with that altering the l’AAA-ATPase FIGL1 should conduct to an even higher recombination enhancement. These results pave the way to the use of anti-CO genes to enhance recombinant recovery in crosses of rice and possibly of other cereals. To provide breeders with a workable anti-CO system, we eventually showed that the CRISPR/Cas9 technology can be used to abolish OsFANCM, OsRECQl4 and OsFIGL1 expression.

Magnaporthe oryzae est un champignon filamenteux responsable de la principale maladie du riz, la pyriculariose. Ce pathosystème est très étudié, notamment dans le but de contribuer à l’identification de facteurs pouvant permettre le développement de résistances efficaces. Si certaines hormones végétales, comme l’acide salycilique, sont requises pour la mise en place des défenses de la plante, d’autres sont impliquées dans des processus développementaux. Parmi elles, les cytokinines (CKs) sont des dérivés d’adénine décrites pour participer à la croissance et la différenciation de l’appareil aérien et racinaire. Elles contribuent à la répartition des nutriments et impactent également la viabilité des cellules, en retardant la senescence ou en induisant la mort cellulaire. Des études précédentes ont montré que les CKs pouvaient perturber la résistance de la plante hôte dans différents pathosystèmes. Chez le riz, les CKs agissent en synergie avec l’acide salicylique pour induire l’expression des gènes marqueurs des défenses. Cependant aucun phénotype de résistance associé aux CKs n’a été observé in planta. Mes travaux montrent qu’un apport exogène de CKs (kinétine, BAP) affecte la résistance du riz à Magnaporthe avant infection, de manière dose dépendante. Le phénotype de résistance observé est corrélé avec une plus forte expression des défenses pendant infection, limitant la pénétration et l’invasion du champignon. Des plantes de riz mutées pour une probable cytokinine UDP-glucosyl transferase (CK-UGT) ont été obtenues. Ces mutants ck-ugt sont affectés dans le métabolisme des CKs et sont également plus résistants à M. oryzae. Hors infection, une plus forte expression des gènes de défense a été mesurée chez les plantes mutantes, confirmant que les CKs endogènes affectent directement ou indirectement les défenses de l’hôte. En parallèle de ces analyses sur la plante, mes travaux ont aussi porté sur le rôle des CKs produites par M.oryzae. En effet, leur rôle dans l’interaction ainsi que la voie de leur biosynthèse chez le champignon n’était pas caractérisé. Conservées au sein des différents organismes, les tRNA-IPT (isopentenyl transferase) sont décrites pour participer à la biosynthèse de CKs. Un seul gène homologue a été identifié chez M. oryzae et nommé CKS1 car sa délétion abolit la production de CKs. Le mutant de Magnaporthe cks1 est moins virulent (pénétration et invasion in planta réduites) que la souche témoin complémentée. Il induit une plus forte accumulation des espèces actives de l’oxygène et une plus forte expression des défenses chez la plante. Les dosages des acides aminés et des sucres pendant infection ont montré que les concentrations de ces nutriments étaient différemment perturbées par la souche déficiente en CKs. Ces résultats suggèrent que les CKs fongiques pourraient être requises pour affecter la répartition des acides aminés et contribuer une accumulation progressive de sucres au cours de l’infection. Ainsi, chez un champignon qui n’induit pas de tumeurs, les CKs pourraient agir comme des effecteurs qui auraient une double fonction d’inhibition des défenses et de drainage des nutriments. Chez les champignons, ces hormones induisent également des réponses physiologiques comme la résistance à certains stress, les processus de nutrition et la reproduction sexuée. Ces effets ont été étudiés chez Magnaporthe dans différentes conditions de croissance in vitro plus ou moins stressantes. Les résultats indiquent que les CKs augmentent la tolérance au stress osmotique et oxydatif et suggèrent qu’elles affecteraient aussi l’absorption des nutriments ainsi que la reproduction sexuée. Comme le gène CKS1 est conservé, cette mutation peut être caractérisée chez d’autres organismes fongiques présentant des modes de vie différents de manière à mieux comprendre le rôle de ces hormones dans les interactions plante-microorganisme mais également au sein des interactions microbiennes. / The blast disease caused by Magnaporthe oryzae is one of the most devastating diseases on rice leading to important yield loss. Plant hormones, like salicylic acid, play a central role in plant resistance establishment. Among these hormones, cytokinins (CKs) are adenine derivatives well described to modulate root/shoot growth and differentiation, cell viability and nutrient distribution. Previous studies have shown that these hormonal compounds can also affect plant host resistance in different pathosystems involving monocot or dicot host plants and microbes (bacteria, oomycetes or fungi). In rice, CKs were described to act synergistically with the salicylic acid pathway to induce defense marker genes expression. However, no resistance phenotype associated with CKs was observed and the way that CKs could act in planta during infection is still unknown. In this work, a resistance phenotype induced by exogenous application of the CK kinetin was characterized and the role of endogenous CKs in rice resistance was investigated by phenotyping plant CK mutants. An exogenous supply of kinetin before infection led to a higher induction of defense marker genes that was associated with limited fungal penetration and invasion, suggesting. However the way CKs affected resistance or susceptibility (or virulence see below) depended on the timing at which they were applied (before or after inoculation). Rice lines mutated for a putative cytokinin- UDP-glycosyl transferase (CK-UGT) were produced. The ck-ugt mutants were more resistant, suggesting that endogenous CKs can also contribute to resistance. Defense marker genes were expressed higher in the absence of infection in the ck-ugt rice mutants, compared to the WT plants. In parallel of these analyses of CK on the plant side, we studied the possible role of CK produced by Magnaporthe. Indeed M.oryzae produces and secretes CKs. However, the way fungal CKs are involved in the rice blast disease development as well as the biosynthesis pathway in M.oryzae were not established. A putative tRNA-IPT (isopentenyl transferase) conserved across organisms was identified in M.oryzae. Mutant analysis of this gene confirmed that this enzyme, thus named CKS1, is required for CK production. Knock-out cks1 fungal mutants were less virulent on rice, affected in penetration and invasion compared to the control complemented strain. They triggered a stronger accumulation of reactive oxygen species and a higher expression of defense marker genes. Aspartate and glutamate, two amino acids important for M.oryzae growth, were differently affected at and around the infected zone by cks1 strain suggesting that fungal CKs could contribute to drain/consume nutrients during infection. Similarly, sugar accumulation was also differently disturbed, indicating that fungal-derived CKs may be required for maintaining a progressive sugar production during host invasion, probably by affecting photosynthesis process. Our results show that fungal CKs, in a non-gall forming fungal pathogen, could act as dual effectors by inhibiting defense and modifying nutrient fluxes. Furthermore, CKs are known to affect some physiological processes in fungi, like stress resistance, nutrition or sexual reproduction. In order to test whether CKs modulate Magnaporthe stress tolerance, the effect of CKs on the mycelial growth in different stressful conditions in vitro was tested. The results indicate that CKs increased osmotic and oxidative stress tolerance and suggest that they also affected nutrient acquisition as well as sexual reproduction. Since the CKS1 gene is highly conserved, the effect of the cks1 mutation could be studied in other fungi showing different lifestyles for improving our knowledge on the role these hormonal compounds play among microbes or in plant-microbe interactions.

Chez le riz, la céréale modèle, le système racinaire est principalement constitué de racines issues de la tige, nommées racines coronaires (RC). Peu de gènes contrôlant le développement des RC sont connus, parmi eux CROWN ROOTLESS1 (CRL1) code une protéine à domaine AS2/LOB (ASL/LBD), qui est probablement un facteur de transcription. Le gène CRL1 est nécessaire à l'initiation des primordia de RC, il est directement activé par l'auxine et est situé en amont du réseau de gènes contrôlant le programme de différentiation des RC. Afin de mieux connaître les processus génétiques impliqués dans l'initiation des RC, l!objectif principal de cette thèse est de comprendre la fonction moléculaire de la protéine CRL1 en validant sa fonction de facteur de transcription et en identifiant ses gènes cibles. L'interaction de la protéine CRL1 avec l!ADN a été montrée in vitro et une expérience de SELEX a permis d'identifier sa séquence de fixation à l!ADN : CACA(A/C)C (CRL1-box). Des expériences en levure ont permis de montrer que CRL1 est un activateur de la transcription. Une comparaison entre le sauvage et le mutant crl1, ainsi que l'élaboration d!un système inductible à la dexaméthasone permettant d'activer l'expression de CRL1 dans le fond génétique mutant crl1, ont été utilisés pour identifier des gènes cibles précoces de CRL1 grâce à des analyse de transcriptome. 277 gènes sont activés dès quatre heures après induction de CRL1, les deux tiers contiennent au moins une CRL1-box dans leur promoteur et peuvent donc être des cibles directes de CRL1. CRL1 induit l'expression d!un ensemble de gènes permettant la mise en place des processus de régulation de l'information génétique, de division, de croissance et de différenciation cellulaires nécessaires à la création d'un méristème de racine coronaire organisé et fonctionnel. Parmi eux, QHB code un facteur de transcription clé nécessaire au maintien des cellules souches des méristèmes racinaires. Ce résultat établit pour la première fois un lien moléculaire entre la signalisation de l!auxine et des gènes impliqués dans la mise en place ou le maintien des cellules souches lors de la formation d!un nouveau méristème racinaire au cours du développement post-embryonnaire. Par ailleurs, une étude histologique a permis de révéler que les RC sont issues d!une couche de péricycle dans la tige, un tissu équivalent en termes de localisation et de potentiel rhizogène au péricycle de la racine à partir duquel sont initiées les racines latérales. Les données acquises suggèrent de fortes similarités dans les processus cellulaires et génétiques de la différentiation des méristèmes racinaires au cours du développement post-embryonnaire chez les monocotylédones et les dicotylédones. La découverte de gènes spécifiques au développement de racines issues de la tige ouvre une voie importante vers la compréhension du déterminisme génétique de l!architecture du système racinaire chez les céréales et offre un nouveau potentiel de ressources génétiques pour l!amélioration variétale. / In rice, the model cereal, the root system is mainly composed of stem-derived roots, named crown roots (CR). Very few genes that control the root system development are known, among them CROWN ROOTLESS1 (CRL1) encodes an AS2/LOB-domain protein that is a putative transcription factor (TF). CRL1 is necessary for CR primordium initiation, it is directly activated by auxin and is situated upstream of the gene regulatory network that control the CR differentiation programme. To better known the genetic processes involved in CR initiation, the main objective of this thesis is to understand the molecular function of the CRL1 protein by validating its function of TF and by identifying its target genes. The interaction of CRL1 with DNA was shown in vitro and a consensus CRL1 DNA-binding motif was identified with a SELEX method : CACA(A/C)C named CRL1-box. A yeast assay showed that CRL1 is a transcriptional activator. A comparison between wild type and c rl1 mutant, and the development of a dexamethasone inducible system to ectopically express CRL1 in the crl1 background, were used to identify CRL1 early target genes by transcript profiling. 277 genes were induced from four hours following CRL1 activation, the two-thirds possess at least one CRL1-box and may be CRL1 direct target genes. CRL1 activates the expression of a broad range of genes that allow to orientate genome expression and to initiate cell division, growth and differentiation mechanisms required for the building of an organized and functional CR meristem. Among these genes, QHB encodes a key TF required for the maintenance of root meristem stem cells. This result evidences for the first time a molecular link between auxin signalling and major genes involved in stem cell patterning and maintenance in the formation of a new root meristem during post-embryonic development. Otherwise, an histological study showed that CR are derived from a shoot pericycle, a tissue equivalent to the root pericycle, from which lateral roots develop, in terms of location and rhizogenic potential. All these data suggest strong similarities between monocots and dicots in cellular and genetic mechanisms that control root meristem differentiation during post-embryonic development. The identification of genes specifically involved in stem-derived root development pave the way towards the understanding of the genetic control of root system architecture in cereals and offer a new potential of genetic resources for plant breeding.

Le modèle de culture STICS a été adapté pour la culture du riz inondé et la capacité de prédiction du modèle a été évaluée pour la simulation de la biomasse à la récolte et du rendement en grains. La base de données utilisée pour ce travail résulte de la collecte de données au champ sur des parcelles en Camargue (sud-Est de la France) gérées par les agriculteurs. Pour la modélisation, ne disposant que très peu de données d’expérimentation, une procédure originale d’utilisation des données obtenues à la ferme a été développée. Ce travail est composé de trois phases: (i) une analyse de la base de données initiale constituée d’informations sur 472 parcelles, 33 variétés et 11 sols aux propriétés physiques différentes et collectées entre 1984 et 2009 dans toute la Camargue; (ii) la sélection des options et des formalismes pertinents pour la culture du riz, (iii) la préparation du jeu de données pour la modélisation par élimination des parcelles dont les rendements sont limités par des facteurs non pris en compte dans le modèle; (iv) la paramétrisation et la simulation des variables choisies.Les résultats de l’application de STICS au riz sont satisfaisants pour près de 80% des parcelles utilisées pour la base de données de calibration. L’accord entre les simulations et les observations est meilleur lorsque les informations d’entrée du modèle sont complètes. Les simulations de la biomasse et du rendement en grains sont d’une qualité légèrement plus faible pour la base de données de validation que pour la base da calibration. / The crop model STICS was adapted for the flooded rice and model’s prediction ability was evaluated by the simulation of the plant biomass at harvest as well as the grain yield. The dataset used for this purpose was collected from the fields situated in whole Camargue (Southern France) and managed by the farmers. We introduced an original procedure to use the farm data instead of experimentation for modeling. This work was carried out in three phases, (i) analysis of the initial database of 472 fields, 33 different varieties and 11 physically different soils grown in the whole Camargue between 1984 and 2009, (ii) selection of the options of formalisms relevant to the rice crop, (iii) preparation of dataset for modeling by eliminating the fields in which the yields were limited by the factors not taken into account by the model and (iv) parameterization and the simulation of the selected target variables. The results of the application of STICS to rice crop were satisfactory for almost 80% of the fields of calibration data. Particularly, there was a good agreement between simulations and measurements of the situations with complete information regarding to the inputs. The simulation patterns for both the plant biomass and the grain yield of dataset of validation are similar as that of dataset of calibration exhibiting slightly reduced simulation quality. More discrepancies were observed in the simulations made by the model calculated dates of different phenological stages compared to the simulations run by using the observed dates of same stages.

Les effecteurs TAL (« Transcription Activator-Like ») sont des protéines présentes majoritairement chez les bactéries phytopathogènes du genre Xanthomonas. Ces protéines bactériennes sont dirigées vers le noyau des cellules de la plante hôte où elles induisent l’expression de gènes. L’induction de gènes de « susceptibilité » de la plante est responsable de la maladie. Les effecteurs TAL sont capables de se lier à l’ADN grâce à un motif particulier consistant en une série de répétitions quasi-identiques s’enroulant autour de l’ADN et formant une super-hélice. Au sein des répétitions deux acides aminés localisés à l’intérieur de chaque boucle de la super-hélice interagissent directement et spécifiquement avec les nucléotides. Des combinaisons différentes de ces deux acides aminés se lient spécifiquement à certains nucléotides, selon un code unique.Une conséquence de cette interaction étroite est que les plantes et les bactéries co-évoluent selon une course aux armements où le génome de la plante se diversifie pour éviter d’être la cible des effecteurs TAL, tandis que les gènes tal se diversifient pour s’adapter à de nouvelles cibles. Les aspects évolutifs des effecteurs TAL sont encore largement inconnus, notamment comment la spécificité évolue vers de nouvelles cibles végétales. Cette thèse présente les premiers travaux sur la compréhension des mécanismes évolutifs des gènes tal, principalement abordés par la bioinformatique. Nous avons développé la suite de programmes « QueTAL » qui permet d’une part la construction d’arbres phylogénétiques basés soit sur la séquence des répétitions, soit sur la séquence des sites cibles, d’autre part la recherche de motifs de répétitions pouvant constituer les unités évolutives des effecteurs TAL. Cette suite bioinformatique est publique, en ligne, et activement utilisée par la communauté des scientifiques travaillant sur les effecteurs TAL des Xanthomonas.Ces programmes ont été appliqués (ainsi que d’autres approches) à plus de 900 séquences d’effecteurs TAL de 22 groupes bactériens. Nous avons mis en évidence i) une perte de diversité dans les répétitions chez les Xanthomonas, qui aurait des conséquence sur l’évolution de la structure des effecteurs TAL; ii) l’existence de groupes fonctionnels de gènes tal spécifiques à certains pathovars ; iii) un probable mécanisme évolutif reposant sur la recombinaison (principalement par conversion génique), révélé par le gain ou la perte de répétitions en blocs entiers. Notre hypothèse est que le moteur de la spécialisation des effecteurs TAL est la recombinaison de ces blocs entre gènes conduisant à une diversification fonctionnelle rapide vers de nouvelles cibles végétales.Nous avons ensuite analysé plus en détail la diversité des séquences TAL de souches africaines de Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), agent de la bactériose vasculaire, maladie bactérienne la plus importante du riz. Nous avons montré qu’un gène tal résultant d’une conversion génique pouvait être fonctionnel, indiquant que ce mécanisme peut être un moteur évolutif chez les effecteurs TAL. Les données de transcriptomique et de gain de fonction ont permis de mettre en évidence un effecteurs TAL dont la virulence s’exerce par l’activation de deux gènes de susceptibilité, dont l’un n’avait jamais été décrit chez Xoo. Enfin nous présentons des résultats préliminaires sur les effets d’une déconstruction de TALome sur le transcriptome de riz ainsi que des travaux fonctionnels et évolutifs issus de collaborations sur d’autres Xanthomonas.Cette thèse offre un nouveau cadre conceptuel ainsi que de nouveaux outils pour l’analyse fonctionnelle et évolutive des effecteurs TAL qui devraient améliorer la mise au point de stratégies pour la résistance des plantes aux Xanthomonas. / Transcription activator-like (TAL) effectors are proteins found mainly in the genus of Xanthomonas phytopathogenic bacteria. These proteins enter the nucleus of cells in the host plant and can induce the expression of genes. The induction of “susceptibility” S genes in the plant will result in disease. TAL effectors are able to bind DNA thanks to a unique motif consisting of a series of nearly-identical repeats that wrap around the DNA forming a super-helix, in each repeat two amino-acids found in a loop on the inner side of the helix directly interact with nucleotides. Different combination of amino-acids in this loop bind specific nucleotides following a unique code.A consequence of this tight interaction is that plants and bacteria co-evolve following an arms race where the plant genome diversifies to avoid being targeted by the TAL effectors, while tal effector genes diversify to adapt to new targets.Various aspects of TAL effector evolution are still unknown, specially how does specificity arise towards certain targets in the host plant? As first steps towards answering this question, in these thesis we show the results of using primarily bioinformatic strategies to find evolutionary patterns in TAL effector sequences. We designed the suite “QueTAL” containing software for 1) the construction of phylogenetic trees based on repeat sequences, 2) comparison of predicted binding sites for TAL effectors, 3) identification of repeat motifs in TAL effector pairs. This suite was made publicly available and it is being actively used by the Xanthomonas research community.We used these programs along with other strategies to analyze variation in over 900 TAL effector sequences from 22 taxonomic groups finding 1) a loss of diversity of repeats through the Xanthomonas genus, which may impact the evolution of TAL effector architecture, 2) groups of TAL effector orthologs specific to certain taxonomic groups of pathovars that may share common functions, 3) evidence of repeat motifs shared and lost between TAL effectors hinting at extensive recombination (particularly gene conversion) events. We propose that the swapping of repeat blocks between TAL effectors is a motor for TAL effector specialization that allows for fast functional diversification through the acquisition of new targets in the host plants.We then analyzed in detail the diversity of TAL effector sequences in African strains of Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), causing agent of bacterial leaf blight of rice, the most destructive bacterial disease in rice. We found indications of virulence activity of a TAL effector being the product of a gene conversion event, supporting our hypothesis of gene conversion as a motor of TAL effector evolution. We also used transcriptomic data and systematic gain-of-function assays to uncover a TAL effector that exerts a virulence role through the induction of two susceptibility genes, one of which represents a novel class of susceptibility gene in bacterial blight. Finally, we present partial results of transcriptomic analyses aimed at de-constructing the effects of each TAL effector from one strain on the rice transcriptome, as well as results from collaborative functional and evolutionary analyses in other groups of Xanthomonas.Altogether, this thesis offers a new conceptual framework and new tools for the analysis of TAL effector function and evolution, and we hope this will help in the design of strategies aimed at improving resistance to bacteria in agronomically important plants.

La thèse a soulevé deux défis dans l’analyse des métaux dans le riz : (i) un dosage multiélémentaire dans le but de la classification du riz selon l’origine géographique, et (ii) la spéciation du sélénium, élément essentiel dans la nutrition, dans le but de l’identification des cibles moléculaires de son assimilation et stockage. Une méthode d’analyse multiélémentaire par l’ICP MS combinée avec des techniques chimiométriques a été proposée comme outil pour la discrimination des riz selon leurs origines géographiques. Les concentrations des 21 éléments ont été analysées par le diagramme en radar, l’analyse en composantes principales, et l’analyse discriminante linéaire. Le riz thaï (riz jasmin) a pu être discriminé des riz étrangers. De plus, l’analyse discriminante a permis de de différencier les riz produits dans les différentes régions de Thaïlande. L’approche de protéomique assistée par l’ICP MS a permis l’identification d’une douzaine de protéines accumulant préférentiellement le sélénium sous forme de sélénomethionine et de sélénocystéine (en proportion 2:1). / The PhD work is focused on two major analytical chemistry challenges concerning rice characterization: (i) the geographical origin classification of rice based on multi-element fingerprinting and (ii) speciation of selenium with the goal of the identification of molecular target of it assimilation and storage in rice. The methods based on the multi-element fingerprinting by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) in combination with multivariate statistical techniques were developed and validated as tools for authentication of rice. Twenty-one key variables were assessed by a radar plot technique and multivariate data analysis, including principal component analysis (PCA) and discriminant analysis (DA) enabling classification according to geographical origin. Thai jasmine rice could be clearly differentiated from foreign rice samples. In addition, the DA could be used to classify Thai jasmine rice obtained from different regions in Thailand. In the second part of the project, an analytical ICP-MS-assisted proteomic method was developed for the identification of Se-containing proteins in rice. Selenium was found to be present as both selenomethionine (SeMet) and selenocysteine (SeCys) in a dozen of rice proteins with the Se/S substitution ratio two times higher for SeMet than that for SeCys.

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) est l’agent causal de la bactériose vasculaire du riz (BLB), une maladie dévastatrice dans de nombreux pays rizicoles. Chez cette bactérie, les effecteurs de type TAL (Transcription Activator-Like) jouent un rôle majeur dans le pouvoir pathogène. En effet ces effecteurs qui sont secrétés à l’intérieur des cellules eucaryotes hôtes par le système de sécrétion de type III de Xanthomonas agissent comme de véritables facteurs de transcription capables de manipuler le transcriptome de l’hôte via l’induction de gènes spécifiques. L’interaction entre les TALs et le promoteur hôte ciblé est régi selon un code, tel que la région centrale des répétitions des TALs s’associe spécifiquement à sa séquence cible à raison d’une répétition pour un nucléotide. Un TAL peut agir comme une protéine de virulence via l’induction de gènes dits de sensibilité (S) dont l’activation est nécessaire au développement de la maladie, et comme protéine d’avirulence via l’induction d’un gène dit exécuteur (E), dont l’activation promeut les réponses de défense de la plante. L’objectif de cette thèse était d’identifier et de caractériser de nouvelles sources de résistance dépendants des effecteurs de type TAL pour contrôler la BLB. Chez le riz, les gènes de sensibilité à Xoo les mieux caractérisés sont ceux du clade III de la famille SWEET des transporteurs de sucres. L’un d’entre eux, OsSWEET14, est particulièrement important puisqu’il est ciblé par 4 effecteurs TALs différents et issus de souches de Xoo appartenant à des lignées génétiques distinctes et d’origines géographiques différentes. Partant du constat de la convergence pour l’induction de ce gène S majeur, un crible moléculaire du promoteur de OsSWEET14 a été réalisé dans le but d’identifier du polymorphisme pouvant affecter la liaison TAL-ADN et en conséquence entrainer une perte de sensibilité. Ces travaux ont permis l’identification du gène xa41(t) qui confère une forme de résistance récessive et à large spectre contre Xoo. Dans une seconde partie, le criblage phénotypique d’une centaine de variétés de riz résistantes à la souche africaine de Xoo MAI1 a permis d’identifier cinq TALs agissant comme des protéines d’avirulence. C’est le cas des effecteurs Tal2 et Tal9 qui provoquent spécifiquement une réaction de résistance sur la variété de riz IR64 dont le génome a été séquencé. Des analyses de type RNAseq ont été réalisées et ont permis d’identifier une dizaine de gènes exécuteurs E candidats expliquant potentiellement la résistance de IR64 à la souche de Xoo MAI1. Finalement, une troisième stratégie a été menée dans le cadre d’un projet collaboratif, visant à démontrer que PiCO39 conférant la résistance du riz au champignon pathogène Magnaporthe oryzae pouvait aussi contrôler les bactérioses vasculaire et à stries foliaires. Pour ce faire, des TAL artificiels (dTALE) ont été dessinés pour induire spécifiquement l’expression de la construction de M. oryzae AVR1-CO39 dans des riz transgéniques résistant (PiCO39) et sensible (pico39). Nos données montrent que l’induction de AVR1-CO39 par Xoo ou Xoc conduit de manière PiCO39-dépendante à une réduction spectaculaire des symptômes. Ceci démontre que les réactions de défense induites par un gène de résistance à M. oryzae sont également fonctionnelles contre X. oryzae, ouvrant de nouvelles perspectives originales quant aux stratégies de contrôle des bactérioses dues à Xanthomonas. / Bacterial blight caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is the most destructive bacterial disease of rice. Xoo pathogenicity critically depends on the TAL (Transcription Activator-Like) effectors. TALs are type three effectors secreted through a type three secretion system into the eukaryotic cell where they act as transcription factors able to manipulate the host transcriptome via the induction of specific genes. DNA-binding specificity involves a unique central repeated region in the TAL effector whereby each repeat directly binds to one single nucleotide. TALs can act as major virulence effector thtough the induction of so-called susceptibility (S) genes that are essential for disease development, or act as avirulence effector by inducing so-called executor (E) resistance genes that promote host defense responses. The goal of this PhD project was to identify and characterize novel TAL-dependent resistance sources to control BLB. In rice, the best characterized S genes are those of the clade III of the sugar transporters SWEET family. The most important is OsSWEET14 as this gene is targeted at unrelated DNA boxes by four TAL effectors, which belong to strains of different lineages and geographic origins. The evolutionary convergence for the induction of SWEET14 reflects its crucial role as major determinant of rice susceptibility to Xoo. A molecular screening of the OsSWEET14 promoter was performed using the natural diversity of wild African rice in order to identify polymorphism that could affect the TAL/DNA binding and thus lead to loss of susceptibility. This work allowed the identification of xa41(t) that confers broad spectrum recessive resistance to Xoo. In a second part of my PhD project, a phenotypic screen for resistance against the Xoo African strain MAI1 of a hundred of rice accessions enabled to identify five TALs. Among them, Tal2 and Tal9 were shown to trigger resistance on the rice variety IR64 the genome of which is fully sequenced. RNAseq analysis identified a small set of resistance E gene candidates underlying potentially IR64 resistance against Xoo strain MAI1. Finally, as a third strategy we aimed within a collaborative project to investigate if PiCO39 that confers resistance of rice towards Magnaporthe oryzae could also control BLB and BLS (Bacterial leaf streak). To that end, Artificial TAL effectors (dTALe) were designed to induce specifically the M. oryzae AVR1-CO39 construct in resistant (PiCO39) and susceptible (piCO39) transgenic backgrounds. We show that the induction of AVR1-CO39 by Xoo or Xoc drastically impairs bacterial colonization in a PiCO39-dependent manner, highlighting the potential of exploiting rice blast or other resistance genes as novel strategies to control rice pathogenic Xanthomonas bacteria.

Afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'initiation des racines coronaires chez le riz nous avons recherché des gènes régulés par le facteur de transcription CROWN ROOTLESS 1 (CRL1) qui contrôle leur initiation en réponse à l'auxine. Différentes approches de transcriptome ont été mises en œuvre. La première a consistée à rechercher les gènes différenciellement exprimés dans les bases de tige du mutant crl1 par rapport au sauvage. La seconde a consisté à rechercher des gènes régulés par l'auxine de manière CRL1-dépendant. La troisième a consisté à rechercher des gènes dont l'expression est induite dans les bases de tige du mutant crl1 après expression conditionnelle ectopique du gène CRL1. Parmi les gènes identifiés des expériences de qRT-PCR nous ont permis de valider 11 gènes comme étant induit par l'auxine de manière CRL1 dépendant et des expérience d'hybridation in situ, 10 gènes qui s'expriment de manière spécifique dans les primordium de racine coronaires. La majorité de ces gènes codent pour des facteurs de transcription et des éléments de transduction de signaux. Certains sont des modulateurs de la stucture de la chromatine d'autre des transporteurs d'auxine. Ces résultats éclairent sur les cibles régulées par le facteur de transcription CRL1 et apportent des éléments nouveaux sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de l'initiation des racines coronaires chez le riz. / In order to understand better the mechanisms involved in crown root initiation in rice we researched the genes regulated by the CROW ROOT LESS 1 (CRL1) transcription factor that controls their initiation in response to auxin. Several transcript profiling approaches have been used. The first was to look for the genes differentially expressed in crl1 stem bases relatively to the wild type. The second one was to research genes that are CRL1-dependant auxin responsive. The last one consisted to research genes that are up-regulated in crl1 stem bases just after the inducible ectopic expression of CRL1. Among identified genes RT-qPCR experiments allowed to validate 11 CRL1-dependant auxin responsive genes and in situ hybridization experiments ten genes that are specifically expressed in crown root primordia. Most of these genes encodes transcription factors or components of transduction signal patways. Some of them encode chromating modulling factors or auxin transporters. These results give new knowledge about the gene regulatory network acting down-stream CRL1 and about the molecular mechanisms involved in crown root initiation in rice.