As sementes do cacaueiro (Theobroma cacao L.) constituem a única fonte de manteiga de cacau, matéria prima fundamental para as indústrias de chocolates e confeitos, farmacêutica e cosmética. Cerca de 50 % do peso seco das sementes é composto por gordura, caracterizada pelo alto nível de estearato (30-37%), em combinação com palmitato (24-31%) e de oleato (33-39%), conferindo-lhe uma composição triglicerídica única, responsável pelas suas propriedades de fusão, com aplicações específicas e especiais. Apesar dos genes que codificam as enzimas da via metabólica de biossíntese de ácidos graxos e triglicerídeos em plantas serem conhecidos, os mecanismos moleculares pelos quais as plantas controlam a produção de estearato e que diferenciam as plantas acumuladoras de estearato de todas as demais não estão claramente definidos. O objetivo deste trabalho foi analisar a composição de ácidos graxos nos frutos de Theobroma cacao e a expressão temporal de genes relacionados à via metabólica de ácidos graxos e triglicerídeos durante o desenvolvimento de sementes de T. cacao, com ênfase na acumulação de estearato. Em paralelo, foram eleitos os genes referências mais estáveis para os estudos em embriões e diversos tecidos de Theobroma cacao. Empregando-se a técnica de reação quantitativa da amplificação em cadeia de transcritos reversos de RNA (RT-qPCR), foram analisadas a expressão dos genes codificadores da proteína carregadora de acil A, B e C, \'beta\'-cetoacil-ACP sintase II, \'delta\'9estearoil-ACP desaturase A e B, Acil-ACP tioesterase A, acil-ACP tioesterase B, acil-CoA sintetase A e B e da proteína oleosina. Quando se estudou de expressão gênica apenas nos embriões de T. cacao, os três genes mais estáveis foram proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Quando se considerou diversos tecidos de plantas de Theobroma cacao, os melhores genes para a normalização dos valores de expressão foram os codificadores da proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. A acumulação de transcritos da \'delta\'9estearoil-ACP desaturase foi relacionada ao aumento do ácido oleico. O aumento na quantidade deste ácido acontece pela ação conjunta da \'delta\'9estearoil-ACP desaturase, e acil-ACP tioesterase A, a qual mostra maiores níveis de transcritos entre 90 e 140 DAP com pico aos 100 DAP. O aumento de ácidos esteárico estaria relacionado com a ação conjunta e com transcrição temporalmente coordenada dos genes das enzimas \'beta\' -cetoacil-ACP sintase II, Acil-ACP tioesterase A e Acil-ACP tioesterase B. Transcritos da enzima \'beta\' -cetoacil-ACP sintase II apresenta pico aos 100 DAP, possivelmente com acúmulo máximo de substratos 18:0-ACP, que poderiam ser hidrolizado preferencialmente pela enzima acil-ACP tioesterase A, ou acil-ACP tioesterase B, O intervalo entre o pico de acúmulo de trasncritos entre \'beta\'-cetoacil-ACP sintase II (100 DAP) e Acil-ACP tioesterase A e \'delta\'9estearoil-ACP desaturase (110 DAP) sugere que poderia ocorrer um acúmulo de estearato resultante da ação dessas enzimas. Esses resultados corroboram o modelo de acumulação de estearato proposto por Silva (2005) / Cacao seeds (Theobroma cacao L.) are unique sources of cocoa butter, fundamental raw material for the chocolate, confectionary, cosmetic and pharmaceutical industries. Around 50% of the seed dry weight represents fat, characterized by the high levels of stearate (30-37%), in combination of palmitate (24-31%) and oleate (33-39%), giving a unique triacylglycerol compostion, responsible for the melting profile for special and specific applications. Despite the fact that genes encoding enzymes of the fatty acid and triglyceride biosynthetic pathway of plants are known, the mechanisms to control the accumulation of high levels of stearate, that differ from other species, are not clearly defined. The objective of this work was to analyse the composition of fatty acids and the expression of genes associated with fatty acid and triglyceride biosynthetic pathway during the development of cacao pods, with emphasis with stearate accumulation. In parallel, the establishment of stable reference genes to investigate gene expression in developing embryos and other cacao tissues were investigated. Using the quantitative amplification of reversed transcripts (RT-qPCR), the expresion of genes coding for the acyl-carrier protein A, B and C; \'beta\'-ketoacyl-ACP sinthase II; \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase A and B; Acyl-ACP thioesterase A; Acyl-ACP thioesterase B; Acyl-CoA sintethase A and B; and oleosin. When gene expression was conductd only in developing cacao embryos, the three most stable genes were the ribosomal protein L35, acyl-carrier protein A and glyceraldehide 3-phosphate dehydrogenase. When various tissues were considered, the best reference genes for gene expression normalization were those encoding for the ribosomal protein L35, acyl carrier protein B and glyceraldehide 3-phosphate dehydrogenase. The accumulation of \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase transcripts could be associated with the accumulation of oleate, together with the increase of acyl-ACP thioesterase A, with increased relative levels of transcripts between 90 and 140 DAP, peaking at 100 DAP. The increase in stearate might result from the joint activity of the \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase and acyl-ACP thioesterase A, which presented higher accumulation of transcripts between 90 and 140 DAP, with peak at 110 DAP. The increase in stearate would associated with the joint and temporal coordinated expression of genes encoding \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II, and Acyl-ACP thioesterase A and B. Transcripts of the enzyme \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II peaked at 100 DAP, possibly with the maximum accumulation of substrates 18:0-ACP, that would be preferentially hydrolzyed by the enzyme acyl-ACP thioesterase A, or acyl-ACP thioesterase B, The gap between the peak in transcript accumulation between \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II (100 DAP) and acyl-ACP thioesterase A and \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase (110 DAP) could lead to the accumulation of stearate. These results corroborated the model proposed by Silva (2005)

As plantas apresentam diversas adaptações fisiológicas à baixa disponibilidade de fósforo (Pi) do solo. Este trabalho discute os custos fisiológicos e energéticos associados com essas estratégias, focado nas respostas da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) à disponibilidade de Pi durante a simbiose com micorrizas arbusculares (Glomus clarum). Esses custos são importantes componentes para a adaptação a solos com baixo Pi, afetando a aquisição e conteúdo de fósforo; o crescimento e concentração de açúcares em tecidos vegetais. Plantas de cana-de-açúcar foram cultivadas em vasos com ou sem micorrizas (Glomus clarum), e sob a disponibilidade de baixo (20 mg kg-1) ou alto (202 mg kg-1) fósforo. Raízes e parte-aérea foram coletadas para as análises após 14, 30, 44 e 58 dias pós-inoculação (dpi) com Glomus clarum . A condição de BP causou a deficiência de Pi nas plantas, micorrízicas ou não. As plantas sob AP continham um teor foliar de Pi adequado, e partir dos 44 dpi acumularam pelo menos 6 vezes mais Pi parte-aérea, do que as cultivadas sob BP, efeito mais evidente nas micorrízicas. A eficiência de absorção, indicada pelo acúmulo de Pi na parte-aérea a uma dada biomassa da raiz, foi igual para todos os tratamentos, sugerindo que as eficiências radicular e micorrízica da absorção de Pi foram similares, independentemente da doses de Pi. A disponibilidade de fósforo não afetou a biomassa total das plantas, sendo as cultivadas sob BP mais eficientes na utilização deste nutriente. Por outro lado, as plantas micorrízicas suplementadas com BP apresentaram maior crescimento da raiz e redução na parte-aérea, resultando no aumento da proporção raiz:parte-aérea. Aos 58 dpi, a glicose, frutose e sacarose presente nas folhas de plantas micorrízicas foi 3,8, 2,3 e 2,4 vezes respectivamente mais concentrada do que nas não micorrízicas. Esses resultados sugerem que, nestas condições experimentais, o estabelecimento da simbiose não foi uma associação mutualística típica, afetando o perfil de crescimento e a alometria da cana cultivada com BP. As concentrações de fotoassimilados na folhas de planta micorrízicas indicam que houve aumentos nas taxas fotossintéticas, mas isso não resultou no maior crescimento do macrosimbionte. A tecnologia de amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-PCR) se tornou uma opção para a validação funcional de genes, com alta sensibilidade, acurada quantificação e eficácia. A quantificação relativa da expressão gênica é conseqüentemente fácil e determina a expressão de um gene em relação a outro expresso e relativamente constante. Neste trabalho foi analisada a variabilidade de expressão dos genes de cana-de-açúcar codificando a actina (Actina), gliceraldeido fosfato desidrogenase (GAPDH), tubulina (Tubulina), e ubiquitinas (UbiQ1 e UbiQ2) em diversos tecidos, e comparou-se a variabilidade obtida utilizando os programas Genorm e NormFinder. Em seguida, foram realizadas análises de expressão gênica utilizando o programa REST para a validação estatística da expressão de genes de cana-de-açúcar. O gene UbiQ1 foi mais estável nos tecidos ou órgãos testados: meristema, inflorescência, folha, colmo e raízes tratadas com alto e baixo fósforo. Tendo o gene UbiQ1 como referência, a expressão relativa dos genes transportadores de fosfato de alta afinidade de cana-de-açúcar PT7 e PT8 foi avaliada em amostras de raiz fertilizadas com alto ou baixo Pi, inoculadas ou não com fungo micorrízico e coletadas aos 58 dpi. Esses dois genes pertencem à família Pht1 de transportadores de fosfato e são similares aos ortólogos de arroz ORYsa;tPht1;7 e ORYsa;Pht1;8. Sob a deficiência de Pi, o transportador de fosfato PT7 foi induzido em raízes não colonizadas; já nas micorrízicas foi pouco expresso, sendo que altas taxas de colonização radicular suprimiram a expressão do PT7. O gene PT8 pouco variou sua expressão, sendo sutilmente mais expresso em plantas micorrízicas do que nas não micorrízicas sob o suprimento de BP. Estes resultados indicam que o PT7 é induzido em raízes sob estresse por fósforo e provavelmente associado à absorção radicular de Pi. Enquanto o gene PT8 possui uma modulação pouco variável provavelmente envolvido na manutenção do fluxo ou homeostase de Pi, possivelmente associado com a absorção radicular e micorrízica de fosfato. O PT7 e o PT8 foram expressos em tratamentos de médio/longo prazo, apresentando expressão ou indução em resposta a privação por Pi, o que é consistente com a função proposta de aquisição e mobilização de Pi para esta família de transportadores. A cana-de-açúcar micorrízica mostrou alta plasticidade de resposta ao BP / Plants display a wide array of physiological adaptations to low soil phosphorus (Pi) availability. This work discussed physiological and energetic costs associated with these strategies, focusing on sugarcane responses to Pi availability during the development of arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis. Such costs are important components of adaptation to low phosphorus soils affecting phosphorus acquisition and leve, growth and soluble sugars concentration in plant tissues. Sugarcane plants were grown in pots, with or without AM (Glomus clarum), and with low (20 mg kg-1) or high (200 mg kg-1) phosphorus supply. Roots and shoots were harvest for analysis after 14, 30, 44 and 58 days post-inoculation (dpi) with the fungus Glomus clarum,. The low Pi supply caused Pi deficiency in mycorrhizedl or non-mycorrhizedl plants. The efficiency of Pi absorption, indicated by shoot Pi accumulation in correlation to root biomass, suggested that root and mycorrhizal Pi absorption were similar, regardless of the Pi doses. Phosphorus availability did not affect the whole-plant biomass, and plants under low Pi supply, used more efficiently this nutrient. On the other hand, mycorrhized plants supplemented with low Pi presented the highest root growth and shoot reduction, resulting in high root:shoot ratio. At 58 dpi, glucose, fructose and sucrose concentrations in leaves of mycorrhized plants were 3.8, 2.3 and 2.4-fold higher respectively, than in non-mycorrhizedl plants. These results suggested that, under these experimental conditions, mycorrhizal symbiosis establishment was not a typical mutualistic association affecting sugarcane growth profile and allometry, when cultivated under low Pi. The photosynthate levels of leaves from mycorrhizd plants indicated an increase in photossynthetic rate but withut resulting in higher macrobiont growth. The quantitative amplification of reversed transcripts (RT-PCR) technology has become a method of choice for functional gene validation, with sensitiveness, accurate quantification and high-throughput. The relative quantification is easier determined by relative expression in comparison to a constitutively expressed refernce gene. Here, the expression variability of a sugarcane actin gene (Actin) glyceraldehydo phosphate dehydrogenase (GAPDH), tubulin (Tubulina), and ubiquitins (UbiQ1 and UbiQ2) from various tissues were analysed and compared based on the ranking list from the Genorm and NormFinder softwares. Expression analysis based on the REST software gave the proper statistic validation. UbiQ1 was the most stable gene among the candidate gen-references along the various tissues or organs tested: meristem, inflorescence, leaf, stem and roots treated with high and low phosphorus. Considering UbiQ1 as the reference gene, the relative expression of the sugarcane high-affinity phosphate transporters genes PT7 and PT8 were assessed from roots fertilized with low Pi or high Pi , inoculated or not with the mycorrhizal fungus, harvest 58 dpi. Both genes belong to the Pht1 Pi transporter and share similarity with the rice orthologs ORYsat;Pht1;7 and ORYsat;Pht1;8. Under Pi deficiency, the phosphate transporter PT7 was induced in non-colonized roots, but less expressed in mycorrhizedl ones, with high root colonization rate suppressing PT7 expression. PT8 showed low variability in expression, slightly more expressed in mycorrhized plants than in non-mycorhized plants under low Pi supply. These results indicated that PT7 was induced in Pi stressed roots, and possibly associated with the root Pi uptake, while PT8 had limited modulation in expression and probably involved on Pi fluxes or homeostasis, likely associated with both root and mycorrhizal phosphate uptake pathways. PT7 and PT8 were induced during medium/long-term treatments, showing induction or constant expression in both acquisition and mobilization of Pi in response to Pi deprivation, which is consistent with the proposed role of this tranporter family. Mycorrhizedl sugarcane showed a highly plastic response to low Pi

Les principaux virus entériques à l’origine de toxi-infections alimentaires collectives sont les norovirus génogroupes I et II (NoV GI, NoV GII) et le virus de l’hépatite A (VHA) responsables respectivement de gastro-entérites et d’hépatites. Ces virus sont transmissibles par la voie féco-orale directe ou via l’ingestion d’eaux ou d’aliments consommés crus ou peu cuits (coquillages, fruits et légumes). Le niveau de contamination virale des aliments souvent faible nécessite d’utiliser des méthodes de détection très sensibles. La plupart des virus entériques étant non cultivable, ces méthodes reposent sur la détection / quantification des génomes viraux par RT-qPCR ce qui ne permet pas de déterminer l’infectiosité des virus et limite l’appréciation du risque viral en santé publique. Les travaux de thèse visaient à proposer des méthodes moléculaires pour la détection, la quantification et le typage des virus entériques, à évaluer l’apport de nouvelles technologies moléculaires (comme la Digital RT-PCR (RT-dPCR) et la RT-PCR à haut débit) dans le cadre du diagnostic viral dans les aliments et enfin à développer des traitements précédant les réactions de RT-qPCR pour détecter des génomes issus de particules virales infectieuses. Une nouvelle technique d’extraction du VHA à partir de la laitue a été développée et évaluée équivalente à la technique de référence décrite dans les spécifications techniques publiées en 2013 (ISO/TS 15216-1 et 15216-2). Pour favoriser les études phylogénétiques dans le domaine alimentaire, 6 modèles moléculaires de RT-qPCR spécifiques des 6 sous-types humains du VHA (IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB) ont été développés et évalués pour le génotypage d’échantillons cliniques contaminés par le VHA. Ils peuvent être utiles pour tracer les sous-types du VHA dans des échantillons faiblement contaminés comme des matrices alimentaires, mais aussi permettre l'identification de co-infection de l'homme ou de souches de VHA recombinantes. La RT-dPCR en nanofluidique a été comparée à la RT-qPCR pour la quantification des génomes de NoV GI, NoV GII et VHA en présence de 2 contrôles de process (mengovirus et norovirus murin) dans des échantillons de laitues et d’eau embouteillée artificiellement contaminés. Un contrôle externe d’amplification a permis d’évaluer et de comparer l’inhibition des réactions de RT-qPCR et RT-dPCR. Les rendements d’extraction viraux se sont révélés significativement plus élevés après RT-dPCR qu’après RT-qPCR pour les NoV GI et mengovirus dans l'eau et pour les NoV GII et VHA dans les échantillons de laitue. De plus, les essais de RT-dPCR se sont avérés être plus tolérants à la présence de substances inhibitrices issues de laitues. La technologie qPCR en nanofluidique a également été utilisée afin de proposer une « puce » capable de détecter 20 virus entériques. Des limites de détection similaires ont été obtenues avec la qPCR et la dPCR. La qPCR nanofluidique a été trouvé moins sensible d’environ 1 à 3 log10 (du fait des faibles volumes (~nanolitre) d’échantillons analysés). Des prétraitements à base de monoazide +/- détergent à réaliser avant la RT-qPCR pour la détection de virus infectieux (VHA, rotavirus) ont été développés et évalués en réalisant des cinétiques d’inactivations thermiques. [...] Suite et fin du résumé dans la thèse. / The main enteric viruses that cause foodborne outbreaks are noroviruses genogroupe I and II (NoV GI and NoV GII) and hepatitis A virus (HAV), respectively responsible for gastroenteritis and hepatitis. They are mainly transmitted via the faecal-oral route either by person-to-person contact or by ingestion of contaminated water, raw and undercooked food, particularly shellfish, soft fruits and vegetables. Viral contamination level is often low and requires sensitive methods of detection. As most enteric viruses are not cultivable, these methods are based on viral genome detection and quantification by real time RT-PCR. Such an approach provides no information regarding virus infectivity and therefore limits viral risk assessment in public health. These thesis works aim to propose molecular methods for enteric viruses detection, quantification and typing, also to evaluate new molecular technologies contribution (as Digital PCR and PCR high throughput) for food viral diagnosis and finally to develop treatments combined with RT-qPCR to only detect genomes from infectious viral particles. A new HAV extraction from lettuce method was developed and assessed as similar to the reference method which is described in the technical specifications published in 2013 (ISO/TS 15216-1; ISO/TS 15216-2). In order to facilitate phylogenetic analysis in food microbiology, six subtype-specific RT-qPCR assays for human HAV (HAV IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB) were developed and evaluated by testing HAV contaminated clinical samples genotyping. These assays may be particularly useful for accurately tracing HAV in low-level contaminated samples such as food matrices and moreover, to allow co-infection identification in human samples and/or HAV recombinant strains. Nanofluidic digital RT-PCR (RT-dPCR) was compared to RT-qPCR for NoV GI, NoV GII, and HAV genomes quantification, in presence of two process controls (mengovirus and murine norovirus) in artificially contaminated bottled water and lettuce samples. External amplification control allowed evaluating and comparing RT-qPCR and RT-dPCR assays inhibitions. Viral recoveries calculated by RT-dPCR were found to be significantly higher than by RT-qPCR for NoV GI and Mengovirus in water, and for NoV GII and HAV in lettuce samples. The RT-dPCR assay proved to be more tolerant to inhibitory substances present in lettuce samples. Nanofluidic PCR Array (PCR Array) has also been used in order to propose an array able to simultaneously detect 20 enteric viruses. Similar detection limits were obtained with qPCR and dPCR but PCR Array was found less sensitive of 1 to 3 log10 (due to the weak volumes (nanolitre) of analyzed samples). Pretreatments based on the use of monoazides +/- surfactant and to do before RT-qPCR were developed for discriminating between infectious and non-infectious particles of HAV and rotavirus. They have been evaluated with thermal inactivation kinetic curves. Last and final summary in the thesis.

Control strategies against the parasitic nematode Teladorsagia circumcincta are problematic under current sheep management systems. Infection with the parasite, particularly in young lambs, results in significant production losses therefore sustainable worm control is being sought. It has been established that variation in resistance to T. circumcincta is under genetic control and the development of resistance is an acquired characteristic and has an immunological basis. This project investigated the immunological response to infection, of lambs with predicted resistance or susceptibility to T. circumcincta. Specifically, the study aimed to identify immune response-associated genes that were differentially-expressed in resistant and susceptible lambs and attempted to identify mutations in these genes. This study was part of a long term project that aims to identify genetic marker/s to aid in marker-assisted selection (MAS) for resistance to T. circumcincta. Real time reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (real time RTqPCR) was performed on abomasal mucosa and lymph nodes from 55 lambs used in a previous experiment. The lambs had been either trickle-infected with 2,300 infective larvae every two days over three months (infected resistant/susceptible, n=45) or sham-dosed (non-infected control, n=10). Lambs were ranked in relation to faecal egg count (FEC) and adult worm count (AWC) at post mortem; zero or low FEC (resistant) to high FEC (susceptible). Histopathology showed only mild pathological changes in the abomasal mucosa of resistant lambs but heavy lymphocytic inflammatory infiltration in the mucosa and submucosa of infected susceptible animals. Measurements of a range of cytokine transcripts and cell markers associated with the four major CD4+ T cell subsets identified IL6, IL21, and IL23A as significantly increased by at least two-fold in abomasal lymph nodes and abomasal mucosa of susceptible lambs in comparison to resistant animals. Highly significant (P<0.02) positive correlations were found between IL6 (ρ=0.35), IL21 (ρ=0.54) and IL23A (ρ=0.38) transcript levels and AWC. Similarly, there were highly significant (P<0.01) positive correlations between FEC and IL6 (ρ=0.41), IL21 (ρ=0.65) and IL23A (ρ=0.31). In contrast, significant negative correlation (P<0.04) between IL23A with IgA antibody levels (ρ=-0.31) was found. There was also a significant positive correlation (P<0.03) of TGFB1 levels with AWC (ρ=0.42) and FEC (ρ=0.32) in the abomasal mucosa. These data suggests that susceptibility to T. circumcincta is linked to the activation of the inflammatory TH17 T cell subset and that this chronic inflammatory response was inappropriate to clear worm infection. High resolution melt analysis failed to identify single nucleotide polymorphisms in the coding regions of IL21 and IL21R. This is the first report of the involvement of TH17 response in GI worm infection in sheep. Similar gene expression studies involving the known upstream and downstream players of the TH17 response could be done.

As part of a larger quantitative microbial risk assessment (QMRA) study, the raw water intakes of 8 different drinking water treatment plants in Ontario were sampled for rotavirus. Group A rotavirus was detected and semi-quantified via RT-qPCR. Rotavirus was detected in 6 of 8 drinking water treatment plant raw water intakes at various sampling times during a 2 year period at estimated quantities of 0 – 513 viral genome copies/L water. As hypothesized, the virus counts showed a seasonal tendency with significant detection most likely to occur during the spring months and a correlation with turbidity measurements. To our knowledge this is the first study exploring the presence of rotavirus in Ontario source waters. With new proposed changes to the Health Canada guidelines regarding the viruses in drinking water, data on the presence of rotavirus in source waters is required for assessment of risk to public health. / Kingsclear First Nation

Dentre as oito espécies do gênero Listeria, a única transmitida por alimentos, patogênica para humanos, é a Listeria monocytogenes. De grande preocupação para a indústria alimentícia, este microrganismo pode ser encontrado em diversas superfícies de plantas processadoras de alimentos, sendo capaz de se aderir e formar persistentes biofilmes. No presente trabalho, foi estudada a influência da concentração de glicose e do tempo de incubação na formação de biofilme por uma cepa de L. monocytogenes, sorotipo 1/2a, cultivada em três diferentes temperaturas, 7°C, 25°C e 37°C, através de planejamento experimental utilizando a Metodologia de Superfície de Resposta. As duas variáveis testadas, para os intervalos estudados, foram significativas (p<0,05) na formação de biofilme somente na temperatura de 37°C e, tanto concentrações de glicose tendendo a zero combinadas com tempos de incubação próximos a 26 h, como maiores concentrações de glicose combinadas com menores tempos de incubação, dentro da faixa de estudo aplicada, representaram boas condições para a formação de biofilme. Foi também realizada a análise transcricional de genes relacionados à formação de biofilme e virulência em duas cepas de L. monocytogenes, sorotipos 1/2a e 4b, cultivadas a 7°C e 37°C (condição controle), pela técnica de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). Para ambas as cepas, os genes sigB, prfA, luxS, sufS, sufU, ltrC e flaA apresentaram transcrição significativamente aumentada (p<0,05) a 7°C, em comparação aos resultados para a condição de cultivo a 37°C, enquanto que o gene hly não variou significativamente a sua transcrição entre as duas temperaturas. O gene actA foi mais transcrito a 7°C para a cepa denominada 55, do sorotipo 1/2a, enquanto que não variou significativamente a sua transcrição entre as duas condições de crescimento para a cepa denominada 47, do sorotipo 4b. No entanto, para a cepa 55, o gene degU não demonstrou diferença estatisticamente significativa entre seus níveis de transcrição nas duas temperaturas estudadas, mas para a cepa 47, apresentou transcrição significativamente aumentada a 7°C. Interessantemente, a presença do gene agrA não foi detectada na cepa 47, e os seus níveis de transcrição foram menores a 7°C para a cepa 55. Estes resultados demonstram que os dois sorotipos estudados, responsáveis por muitos dos casos humanos de listeriose, apresentam mecanismos moleculares diferentes, nas temperaturas de 7°C e 37°C. / Among the eight species of genus Listeria, the only transmitted by food, pathogenic for humans, is Listeria monocytogenes. Of great concern to the food industry, this microorganism can be found in various areas of food processing plants, being able to adhere and form persistent biofilms. In the present work, the influence of glucose concentration and incubation time on biofilm formation by a strain of L. monocytogenes, serotype 1/2a, grown in three different temperatures, 7°C, 25°C and 37°C, have been studied, through an experimental design using the Response Surface Methodology. The two variables tested, for the studied intervals, were significant (p<0,05) in the biofilm formation only at a temperature of 37°C and, both glucose concentrations tending to zero combined with incubation times near to 26 h, and higher glucose concentrations combined with lower incubation times, within the applied range study, represented good conditions for biofilm formation. Transcriptional analysis of genes related to biofilm formation and virulence in two strains of L. monocytogenes, serotypes 1/2a and 4b, grown at 7°C and 37°C (control condition), was also performed, by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). For both strains, sigB, prfA, luxS, sufS, sufU, ltrC and flaA genes showed significantly increased transcription (p<0,05) at 7°C, in comparison with results for the growth condition at 37°C, whereas hly gene did not varied significantly its transcription between the two temperatures. The actA gene was more transcribed at 7°C for the 55 strain, serotype 1/2a, while did not varied significantly its transcription between the two growth conditions for the 47 strain, serotype 4b. However, for 55 strain, the degU gene did not showed statistically significant difference for its transcription levels between the two studied temperatures, but for 47 strain, presented significantly increased transcription at 7°C. Interestingly, the presence of agrA gene was not detected in 47 strain, and its transcription levels were lower at 7°C for 55 strain. These results demonstrate that the two studied serotypes, responsible for many of the human listeriosis cases, have different molecular mechanisms, at temperatures of 7 and 37°C.

Dentre as oito espécies do gênero Listeria, a única transmitida por alimentos, patogênica para humanos, é a Listeria monocytogenes. De grande preocupação para a indústria alimentícia, este microrganismo pode ser encontrado em diversas superfícies de plantas processadoras de alimentos, sendo capaz de se aderir e formar persistentes biofilmes. No presente trabalho, foi estudada a influência da concentração de glicose e do tempo de incubação na formação de biofilme por uma cepa de L. monocytogenes, sorotipo 1/2a, cultivada em três diferentes temperaturas, 7°C, 25°C e 37°C, através de planejamento experimental utilizando a Metodologia de Superfície de Resposta. As duas variáveis testadas, para os intervalos estudados, foram significativas (p<0,05) na formação de biofilme somente na temperatura de 37°C e, tanto concentrações de glicose tendendo a zero combinadas com tempos de incubação próximos a 26 h, como maiores concentrações de glicose combinadas com menores tempos de incubação, dentro da faixa de estudo aplicada, representaram boas condições para a formação de biofilme. Foi também realizada a análise transcricional de genes relacionados à formação de biofilme e virulência em duas cepas de L. monocytogenes, sorotipos 1/2a e 4b, cultivadas a 7°C e 37°C (condição controle), pela técnica de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). Para ambas as cepas, os genes sigB, prfA, luxS, sufS, sufU, ltrC e flaA apresentaram transcrição significativamente aumentada (p<0,05) a 7°C, em comparação aos resultados para a condição de cultivo a 37°C, enquanto que o gene hly não variou significativamente a sua transcrição entre as duas temperaturas. O gene actA foi mais transcrito a 7°C para a cepa denominada 55, do sorotipo 1/2a, enquanto que não variou significativamente a sua transcrição entre as duas condições de crescimento para a cepa denominada 47, do sorotipo 4b. No entanto, para a cepa 55, o gene degU não demonstrou diferença estatisticamente significativa entre seus níveis de transcrição nas duas temperaturas estudadas, mas para a cepa 47, apresentou transcrição significativamente aumentada a 7°C. Interessantemente, a presença do gene agrA não foi detectada na cepa 47, e os seus níveis de transcrição foram menores a 7°C para a cepa 55. Estes resultados demonstram que os dois sorotipos estudados, responsáveis por muitos dos casos humanos de listeriose, apresentam mecanismos moleculares diferentes, nas temperaturas de 7°C e 37°C. / Among the eight species of genus Listeria, the only transmitted by food, pathogenic for humans, is Listeria monocytogenes. Of great concern to the food industry, this microorganism can be found in various areas of food processing plants, being able to adhere and form persistent biofilms. In the present work, the influence of glucose concentration and incubation time on biofilm formation by a strain of L. monocytogenes, serotype 1/2a, grown in three different temperatures, 7°C, 25°C and 37°C, have been studied, through an experimental design using the Response Surface Methodology. The two variables tested, for the studied intervals, were significant (p<0,05) in the biofilm formation only at a temperature of 37°C and, both glucose concentrations tending to zero combined with incubation times near to 26 h, and higher glucose concentrations combined with lower incubation times, within the applied range study, represented good conditions for biofilm formation. Transcriptional analysis of genes related to biofilm formation and virulence in two strains of L. monocytogenes, serotypes 1/2a and 4b, grown at 7°C and 37°C (control condition), was also performed, by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). For both strains, sigB, prfA, luxS, sufS, sufU, ltrC and flaA genes showed significantly increased transcription (p<0,05) at 7°C, in comparison with results for the growth condition at 37°C, whereas hly gene did not varied significantly its transcription between the two temperatures. The actA gene was more transcribed at 7°C for the 55 strain, serotype 1/2a, while did not varied significantly its transcription between the two growth conditions for the 47 strain, serotype 4b. However, for 55 strain, the degU gene did not showed statistically significant difference for its transcription levels between the two studied temperatures, but for 47 strain, presented significantly increased transcription at 7°C. Interestingly, the presence of agrA gene was not detected in 47 strain, and its transcription levels were lower at 7°C for 55 strain. These results demonstrate that the two studied serotypes, responsible for many of the human listeriosis cases, have different molecular mechanisms, at temperatures of 7 and 37°C.

Dentre as oito espécies do gênero Listeria, a única transmitida por alimentos, patogênica para humanos, é a Listeria monocytogenes. De grande preocupação para a indústria alimentícia, este microrganismo pode ser encontrado em diversas superfícies de plantas processadoras de alimentos, sendo capaz de se aderir e formar persistentes biofilmes. No presente trabalho, foi estudada a influência da concentração de glicose e do tempo de incubação na formação de biofilme por uma cepa de L. monocytogenes, sorotipo 1/2a, cultivada em três diferentes temperaturas, 7°C, 25°C e 37°C, através de planejamento experimental utilizando a Metodologia de Superfície de Resposta. As duas variáveis testadas, para os intervalos estudados, foram significativas (p<0,05) na formação de biofilme somente na temperatura de 37°C e, tanto concentrações de glicose tendendo a zero combinadas com tempos de incubação próximos a 26 h, como maiores concentrações de glicose combinadas com menores tempos de incubação, dentro da faixa de estudo aplicada, representaram boas condições para a formação de biofilme. Foi também realizada a análise transcricional de genes relacionados à formação de biofilme e virulência em duas cepas de L. monocytogenes, sorotipos 1/2a e 4b, cultivadas a 7°C e 37°C (condição controle), pela técnica de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). Para ambas as cepas, os genes sigB, prfA, luxS, sufS, sufU, ltrC e flaA apresentaram transcrição significativamente aumentada (p<0,05) a 7°C, em comparação aos resultados para a condição de cultivo a 37°C, enquanto que o gene hly não variou significativamente a sua transcrição entre as duas temperaturas. O gene actA foi mais transcrito a 7°C para a cepa denominada 55, do sorotipo 1/2a, enquanto que não variou significativamente a sua transcrição entre as duas condições de crescimento para a cepa denominada 47, do sorotipo 4b. No entanto, para a cepa 55, o gene degU não demonstrou diferença estatisticamente significativa entre seus níveis de transcrição nas duas temperaturas estudadas, mas para a cepa 47, apresentou transcrição significativamente aumentada a 7°C. Interessantemente, a presença do gene agrA não foi detectada na cepa 47, e os seus níveis de transcrição foram menores a 7°C para a cepa 55. Estes resultados demonstram que os dois sorotipos estudados, responsáveis por muitos dos casos humanos de listeriose, apresentam mecanismos moleculares diferentes, nas temperaturas de 7°C e 37°C. / Among the eight species of genus Listeria, the only transmitted by food, pathogenic for humans, is Listeria monocytogenes. Of great concern to the food industry, this microorganism can be found in various areas of food processing plants, being able to adhere and form persistent biofilms. In the present work, the influence of glucose concentration and incubation time on biofilm formation by a strain of L. monocytogenes, serotype 1/2a, grown in three different temperatures, 7°C, 25°C and 37°C, have been studied, through an experimental design using the Response Surface Methodology. The two variables tested, for the studied intervals, were significant (p<0,05) in the biofilm formation only at a temperature of 37°C and, both glucose concentrations tending to zero combined with incubation times near to 26 h, and higher glucose concentrations combined with lower incubation times, within the applied range study, represented good conditions for biofilm formation. Transcriptional analysis of genes related to biofilm formation and virulence in two strains of L. monocytogenes, serotypes 1/2a and 4b, grown at 7°C and 37°C (control condition), was also performed, by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). For both strains, sigB, prfA, luxS, sufS, sufU, ltrC and flaA genes showed significantly increased transcription (p<0,05) at 7°C, in comparison with results for the growth condition at 37°C, whereas hly gene did not varied significantly its transcription between the two temperatures. The actA gene was more transcribed at 7°C for the 55 strain, serotype 1/2a, while did not varied significantly its transcription between the two growth conditions for the 47 strain, serotype 4b. However, for 55 strain, the degU gene did not showed statistically significant difference for its transcription levels between the two studied temperatures, but for 47 strain, presented significantly increased transcription at 7°C. Interestingly, the presence of agrA gene was not detected in 47 strain, and its transcription levels were lower at 7°C for 55 strain. These results demonstrate that the two studied serotypes, responsible for many of the human listeriosis cases, have different molecular mechanisms, at temperatures of 7 and 37°C.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-18T14:24:33Z No. of bitstreams: 2 TESE Marina de Assis Souza.pdf: 5668024 bytes, checksum: 0e33397511d45e0f461e61a5893b8f99 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-18T14:24:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Marina de Assis Souza.pdf: 5668024 bytes, checksum: 0e33397511d45e0f461e61a5893b8f99 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / FACEPE e CNPq / O modelo clássico de susceptibilidade e resistência à leishmaniose sugere que a expansão de células Th1 ou Th2 direcione o resultado da infecção. Recentemente, o perfil Th17 foi relacionado à doença e parece ser antagônico às células T regulatórias (Treg). Assim, este estudo teve como objetivo quantificar, por ELISA de captura ou qPCR, alguns mediadores dos perfis Th1, Th2, Th17 e Treg (IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-4, TGF-β, IL-6, IL-17, IL-22, RORC, Foxp3 e iNOS) em pacientes com leishmaniose tegumentar americana (LTA) ativa (AD) e após a cura clínica, tratados (AT) ou não (cura espontânea; SH). Os pacientes foram capazes de apresentar resposta imunológica específica frente aos antígenos solúvel (AgSol) e insolúvel (AgIns) de L. (V.) braziliensis em relação ao grupo controle. O primeiro artigo demonstrou que, em resposta ao AgSol, houve a predominância de IFN-γ (P = 0,0061) e TNF-α (P = 0,008) durante a doença ativa, indicando a presença de uma resposta inflamatória; IL-17 também é evidenciada nesse estado clínico (P = 0,04). Um aumento na secreção de NO foi observado em SH (P = 0,023), enquanto que IL-17 foi observada em baixos níveis nesses pacientes, sugerindo que esta parece ser regulada pelo NO. A presença de IL-10 e IL-22 foi observada em todos os grupos (P > 0,05). No segundo artigo, o AgIns estimulou produção significativa de IFN- γ em todos os grupos (P < 0,05). AD (P = 0,007) e AT (P = 0,003) produziram TNF-α. Em contrapartida, o grupo SH apresentou baixos níveis da citocina. De forma interessante, a secreção de NO foi significativa nesses indivíduos (P = 0,04), enquanto que IL-17 foi observada em baixos níveis. Produção significativa de IL-17 foi observada no grupo AT (P = 0,04). Embora IL-22 tenha sido detectada em AD (P = 0,02), seu papel é questionável. A presença de IL-10 em todos os grupos de pacientes sugere que a citocina desempenhe diferentes papéis na doença (P > 0,05). No terceiro artigo, PBMC de pacientes com lesões ativas expressaram mRNA para IFN-γ (AgSol: P = 0,017; AgIns: P = 0,0004) e TNF-α (AgSol: 0,0306; AgIns: P = 0,027), reforçando a possível presença de uma resposta inflamatória. A ausência de mRNA para a iNOS nesses pacientes pode ser devido à presença de NO secretado, representando um mecanismo de compensação. Este evento pode ajudar a evitar a exacerbação da resposta imune. Além disso, a presença significativa de mRNA para IL-10 (AgSol: P = 0,0119; AgIns: P = 0,0114) sugere que mecanismos imunomodulatórios favoreçam uma resposta imune efetiva contra a Leishmania. A expressão de Foxp3 frente ao AgIns (P = 0,0208) indica que células T regulatórias estejam presentes na resposta de pacientes com lesões ativas. Embora IL-17 e IL-22 pareçam ser importantes na resposta imune efetiva na LTA, Os níveis de mRNA para estas citocinas não foram significativos (P > 0,05).Entretanto, os níveis de IL-6 expressos pelos pacientes (AgSol: P = 0,0189) com doença ativa parecem ter sido insuficientes para induzir um perfil Th17 juntamente com TGF-β (P > 0,05), dada a expressão não significativa de RORC (P > 0,05). A expressão de TGF- β pode ter contribuído para a regulação da resposta imune pelas células Treg, o que reforça o suposto antagonismo entre este e o perfil Th17. Assim, a secreção/expressão desses mediadores reforça a complexidade da resposta imune celular no combate à Leishmania, e traz informações para o desenvolvimento de vacinas e esquemas imunoterapêuticos.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6499_1.pdf: 2052434 bytes, checksum: 0d0ed4c819168b93a4f1be887b9da045 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Metarhizium anisopliae é um patógeno de insetos economicamente importante usado em todo o mundo no controle biológico de insetos-praga. Porém, sua utlização é limitada devido ao tempo de mortalidade ser relativamente alto quando comparado aos inseticidas químicos. A análise das expressões de genes envolvidos na virulência é um passo importante na identificação de métodos para aumentar a sua eficácia. Neste trabalho foi investigado pela técnica de RT-qPCR o nível de expressão relativa do gene cag8 (regulador da sinalização da proteína G) e do nrr1 (regulador da resposta ao nitrogênio) durante a germinação, conidiogenese e em diferentes fases de patogênese de M. anisopliae var. anisopliae e de M. anisopliae var. acridum. A expressão relativa do gene pr1A (codificador da protease subtilisina) foi analisado em M. anisopliae var. anisopliae e em M. anisopliae var. acrdum durante o crescimento em diferentes meios de cultura e durante a patogênese. Em ambas as variedades, o gene cag8 foi reprimido durante a germinação e induzido durante a conidiogenese e patogênese, o gene nrr1 apresentou-se constitutivamente expresso durante a germinação, conidiogenese e patogênese e o gene pr1A foi induzido nos diferentes meios de cultura e induzido e reprimido durante as fases de patogênese. Considerando as diferenças entre as duas variedades, M. anisopliae var. anisopliae apresentou maior expressão em todos os genes analisados durante a patogênese, isso pode justificar o fato dessa linhagem ter apresentado maior potencial para o controle de Diatraea saccharalis no teste de patogenicidade demonstrando que M. anisopliae pode apresentar variações na ativação de genes ligados à virulência para determinados ambientes e hospedeiros