Les homéoprotéines constituent une famille de facteurs de transcription dont le point commun est la présence en leur sein d’un domaine de liaison à l’ADN particulier, l’homéodomaine. Des travaux menés au laboratoire ont permis de mettre en avant la capacité de nombreux membres de cette famille protéique à pouvoir transférer entre cellules, ouvrant la voie à un nouveau mode d’action de ces protéines, en plus de leur action sur la transcription. L’homéodomaine joue un rôle central dans ce transfert intercellulaire car il contient des séquences requises pour les deux étapes principales d’un tel transfert intercellulaire, sécrétion et internalisation. D’un point de vue mécaniste, ces deux étapes successives du transfert intercellulaire des homéoprotéines font appel à des mécanismes désignés comme non-conventionnels car propres à ce processus. Suite à de précédentes études menées dans le laboratoire mettant en évidence un rôle crucial de la localisation subcellulaire de l’homéoprotéine ENGRAILED-2 (EN-2) dans sa sécrétion, nous avons pu mettre en avant l’existence d’une interaction directe entre EN-2 et certains lipides appartenant à la classe des phosphoinositides [notamment les PI(4,5)P2]. Nous avons ensuite montré que cette interaction est à l’origine de l’association d’une fraction de EN-2 intracellulaire avec les compartiments membranaires. Ces travaux ont également permis de mieux comprendre le rôle de certains protéoglycanes dans l’accumulation de EN-2 à la surface des cellules suite à sa sécrétion et au cours de son internalisation. Enfin nous avons pu mettre en évidence l’implication du domaine d’interaction de EN-2 avec PBX dans le transfert intercellulaire de EN-2. / Homeoproteins belong to a family of transcription factors which all share a common DNA binding domain, the homeodomain. Beside their action as transcription factors, homeoproteins are also able to be transferred between cells by unconventional means. The two consecutive steps of this intercellular transfer (secretion then internalisation) require sequences located in the homeodomain. Thanks to studies previously lead by our laboratory, we know that subcellular localisation of ENGRAILED-2 (EN-2) homeoprotein is a crucial step in its subsequent secretion. On this basis, we showed that EN-2 interacts directly with a certain subtype of phospholipids, phosphoinositides [e.g. PI(4,5)P2]. Then, we demonstrated than these lipids are involved in the association of EN-2 protein with membraneous compartments within the cell. PI(4,5)P2 located in the inner leaflet of the plasma membrane are also involved in the direct translocation of EN-2 across plasma membrane. This work is also focused on the role of proteoglycans, and more precisely syndecans, in EN-2 cell surface accumulation after both secretion and internalisation. At last, we also established the implication of EN-2 interaction domain with PBX in EN-2 intercellular transfer.

Le rotavirus est le principal agent étiologique des gastro-entérites infantiles. Après l'assemblage dans le réticulum endoplasmique (RE), les virions sont relargués au niveau du pôle apical des entérocytes selon une voie de trafic atypique ne passant pas par l'appareil de Golgi. Ce travail a pour but d'étudier les mécanismes de sortie du RE et le trafic atypique du rotavirus. Des acteurs de la machinerie réticulaire de repliement et de contrôle qualité des protéines ont été retrouvés associés aux intermédiaires d'assemblage du rotavirus. En corrélation avec cela, l'infection provoque un stress du RE et active une réponse cellulaire spécifique, l'Unfolded Protein Response (UPR). Le rotavirus module de manière différentielle les trois voies de signalisation de l'UPR et seules les voies IRE1 et PERK sont requises pour la morphogénèse virale. L'autophagie, en dehors de son rôle dans la dégradation du matériel cellulaire, a été récemment impliquée dans des voies de sécrétion non conventionnelles. Dans les cellules épithéliales intestinales Caco-2, la différenciation cellulaire se manifeste par l'augmentation de l'expression des marqueurs autophagiques et la diminution du flux autophagique. Quelque soit l'état de différenciation des cellules, l'infection à rotavirus bloque à la fois la formation et la maturation des autophagosomes. Uniquement dans les cellules Caco-2 non différenciées, l'infection induit une lipidation de LC3 qui n'est pas associée à l'autophagie, mais qui corrèle avec un clivage de la protéine ATG3 impliquée dans le processus de lipidation. Ni l'autophagie, ni la lipidation de LC3 ne sont requises pour la morphogénèse du rotavirus dans les cellules Caco-2. / Rotavirus is the major causative agent of severe gastroenteritis in young children worldwide. After assembly steps in the Endoplasmic Reticulum (ER), virions are released without any cellular lysis at the apical side of enterocytes, following an atypical trafficking pathway that bypasses the Golgi apparatus. This work is aimed at understanding the mechanisms of ER exit of rotavirus particles as well as their unconventional trafficking. Components of the protein folding and quality control machinery in the ER were found associated with viral assembly complexes. Consistent with this observation, viral infection induced ER stress, which activates a specific cellular response named the Unfold Protein Response (UPR). Rotavirus infection modulated differently the three UPR signaling pathways and only the IRE1 and PERK pathways were required for viral morphogenesis. Autophagy, besides being a degradative process, has recently been shown to be potentially involved in unconventional secretion pathways. We showed that the differentiation process of human intestinal epithelial Caco-2 cells into enterocyte-like phenotype was marked by the increase in expression of autophagic markers and the reduction of autophagic flux. Rotavirus infection blocked both the initiation and late steps of autophagy, in both undifferentiated and differentiated Caco-2 cells. Surprisingly, only in undifferentiated Caco-2 cells, rotavirus infection induced a lipidation of LC3 that was not associated with autophagy but correlated with a cleavage of ATG3, a protein directly involved in the lipidation process. Neither autophagy nor the lipidation of LC3 were required for rotavirus morphogenesis in Caco-2 cells.

L’immunosuppression a permis d’améliorer l’incidence du rejet aigu sans toutefois améliorer significativement le rejet chronique. Celui-ci est caractérisé par une vasculopathie du greffon (VG) similaire à une forme accélérée d’athérosclérose native accompagnée de fibrose. La pathophysiologie de la VG découle de l’hypothèse de réponse à l’insulte proposée par Russell Ross en 1977. Selon son postulat, l’endothélium stressé par des facteurs immunologiques et non immunologiques initie l’apoptose endothéliale suivi d’une réponse de réparation vasculaire via un épaississement myo-intimal aux sites d’insultes. Toutefois, lorsque les stress endothéliaux initiaux demeurent soutenus, l’apoptose endothéliale et la réponse de réparation perpétuent. Compte tenu que l’inhibition de l’apoptose endothéliale bloque le développement de la VG in vivo, notre hypothèse de travail reposait sur les répercussions paracrines de l’apoptose endothéliale sur les types cellulaires participant au remodelage vasculaire. Nous avons généré un système expérimental in vitro afin d’induire l’apoptose endothéliale en absence significative de nécrose cellulaire. À l’aide d’une approche protéomique multidimensionnelle et comparative, nous avons démontré que les cellules endothéliales apoptotiques exportent spécifiquement 27 signaux post mortem (SPM). Nous avons démontré que certains de ces SPM ont des propriétés anti-apoptotiques (TCTP et EGF), d’autre fibrogénique (CTGF), récapitulant ainsi certains phénotypes cellulaires associés au développement de la VG. Parmi les médiateurs identifiés, 16 n’avaient pas de signal de sécrétion, incluant TCTP, suggérant que des mécanismes de sécrétion non conventionnels soient favorisés durant l’apoptose. Nous avons démontré que la caspase-3 effectrice régule la voie de sécrétion non classique exosomiale associée à l’export extracellulaire de nanovésicules TCTP+VE, anti-apoptotiques et biochimiquement distinctes des corps apoptotiques. Finalement, l’ensemble des données protéomiques ont permis d’émettre l’hypothèse qu’en réponse à un stress apoptotique, la cellule exporte différents médiateurs (solubles et vésiculaires) de manière non conventionnelle nécessitant la fusion d’organelles de la voie endocytaire et autophagique avec la membrane plasmique. Ce mécanisme serait régulé durant la phase effectrice de l’apoptose permettant ainsi d’initier une réponse de réparation extracellulaire seulement lorsque le destin cellulaire a atteint un point de non retour. Ainsi, le testament protéique et nanovésiculaire légué durant l’apoptose endothéliale pourrait servir simultanément de biomarqueur de la VG et de cible thérapeutique afin de diminuer le remodelage vasculaire pathologique. / Immunosuppression regiments improved steadily the incidence of acute rejection with minimal positive effects on chronic rejection. The latter is characterized by a transplant vasculopathy (TV) similar to native atherosclerosis, accompanied with fibrosis throughout the vascular wall of the allograft. The pathophysiology associated to TV arose from pionnering work of Russell Ross in 1977. He proposed the 'Response to Injury' hypothesis revealing that endothelium injury initiated by immunological and non immunological factors favors a vascular repair response through neo-intima thickening at the sites of cellular injury. However, when endothelial insult is maintained, apoptosis ensues and the vascular repair process perpetuates. Since inhibition of endothelial apoptosis prevents TV development in vivo, we hypothesized that endothelial apoptosis regulates the vascular repair process through a paracrine program active on the cellular components of the vessel wall. We have generated an in vitro experimental system to induce endothelial apoptosis in absence of necrosis. Using a multifunctional and comparative proteomic approach, we have identified 27 post mortem signals (PMS) specifically exported by apoptotic endothelial cells. Some of these PMS display anti-apoptotic function (TCTP and EGF), whereas CTGF was identified as a fibrogenic factor, recapitulating the cellular events associated to the development of TV. Interestingly, 16 of these SPM did not contain a peptide signal, suggesting that non conventional secretion mechanisms could be favored during the effector phase of apoptosis. We demonstrated that activated caspase-3 regulates the exosomal secretion pathway associated to the export of nanovesicles TCTP +ve, anti-apoptotic and biochemically different from apoptotic blebs. Finally, the overall proteomic data generated a new hypothesis suggesting that in response to apoptotic stress, the cell exports different mediators (soluble and vesicular) by non conventional mechanism through the fusion of endocytic organelles and autophagic vacuoles with the plasma membrane, releasing their content into the extracellular milieu. This mechanism should be regulated during the effector phase of apoptosis favoring a vascular repair response only when cell’s demise reaches a point of no return. Therefore, these PMS could be used both as biomarkers of apoptosis or as biopharmaceutical targets to decrease the incidence of chronic vascular repair.

L’immunosuppression a permis d’améliorer l’incidence du rejet aigu sans toutefois améliorer significativement le rejet chronique. Celui-ci est caractérisé par une vasculopathie du greffon (VG) similaire à une forme accélérée d’athérosclérose native accompagnée de fibrose. La pathophysiologie de la VG découle de l’hypothèse de réponse à l’insulte proposée par Russell Ross en 1977. Selon son postulat, l’endothélium stressé par des facteurs immunologiques et non immunologiques initie l’apoptose endothéliale suivi d’une réponse de réparation vasculaire via un épaississement myo-intimal aux sites d’insultes. Toutefois, lorsque les stress endothéliaux initiaux demeurent soutenus, l’apoptose endothéliale et la réponse de réparation perpétuent. Compte tenu que l’inhibition de l’apoptose endothéliale bloque le développement de la VG in vivo, notre hypothèse de travail reposait sur les répercussions paracrines de l’apoptose endothéliale sur les types cellulaires participant au remodelage vasculaire. Nous avons généré un système expérimental in vitro afin d’induire l’apoptose endothéliale en absence significative de nécrose cellulaire. À l’aide d’une approche protéomique multidimensionnelle et comparative, nous avons démontré que les cellules endothéliales apoptotiques exportent spécifiquement 27 signaux post mortem (SPM). Nous avons démontré que certains de ces SPM ont des propriétés anti-apoptotiques (TCTP et EGF), d’autre fibrogénique (CTGF), récapitulant ainsi certains phénotypes cellulaires associés au développement de la VG. Parmi les médiateurs identifiés, 16 n’avaient pas de signal de sécrétion, incluant TCTP, suggérant que des mécanismes de sécrétion non conventionnels soient favorisés durant l’apoptose. Nous avons démontré que la caspase-3 effectrice régule la voie de sécrétion non classique exosomiale associée à l’export extracellulaire de nanovésicules TCTP+VE, anti-apoptotiques et biochimiquement distinctes des corps apoptotiques. Finalement, l’ensemble des données protéomiques ont permis d’émettre l’hypothèse qu’en réponse à un stress apoptotique, la cellule exporte différents médiateurs (solubles et vésiculaires) de manière non conventionnelle nécessitant la fusion d’organelles de la voie endocytaire et autophagique avec la membrane plasmique. Ce mécanisme serait régulé durant la phase effectrice de l’apoptose permettant ainsi d’initier une réponse de réparation extracellulaire seulement lorsque le destin cellulaire a atteint un point de non retour. Ainsi, le testament protéique et nanovésiculaire légué durant l’apoptose endothéliale pourrait servir simultanément de biomarqueur de la VG et de cible thérapeutique afin de diminuer le remodelage vasculaire pathologique. / Immunosuppression regiments improved steadily the incidence of acute rejection with minimal positive effects on chronic rejection. The latter is characterized by a transplant vasculopathy (TV) similar to native atherosclerosis, accompanied with fibrosis throughout the vascular wall of the allograft. The pathophysiology associated to TV arose from pionnering work of Russell Ross in 1977. He proposed the 'Response to Injury' hypothesis revealing that endothelium injury initiated by immunological and non immunological factors favors a vascular repair response through neo-intima thickening at the sites of cellular injury. However, when endothelial insult is maintained, apoptosis ensues and the vascular repair process perpetuates. Since inhibition of endothelial apoptosis prevents TV development in vivo, we hypothesized that endothelial apoptosis regulates the vascular repair process through a paracrine program active on the cellular components of the vessel wall. We have generated an in vitro experimental system to induce endothelial apoptosis in absence of necrosis. Using a multifunctional and comparative proteomic approach, we have identified 27 post mortem signals (PMS) specifically exported by apoptotic endothelial cells. Some of these PMS display anti-apoptotic function (TCTP and EGF), whereas CTGF was identified as a fibrogenic factor, recapitulating the cellular events associated to the development of TV. Interestingly, 16 of these SPM did not contain a peptide signal, suggesting that non conventional secretion mechanisms could be favored during the effector phase of apoptosis. We demonstrated that activated caspase-3 regulates the exosomal secretion pathway associated to the export of nanovesicles TCTP +ve, anti-apoptotic and biochemically different from apoptotic blebs. Finally, the overall proteomic data generated a new hypothesis suggesting that in response to apoptotic stress, the cell exports different mediators (soluble and vesicular) by non conventional mechanism through the fusion of endocytic organelles and autophagic vacuoles with the plasma membrane, releasing their content into the extracellular milieu. This mechanism should be regulated during the effector phase of apoptosis favoring a vascular repair response only when cell’s demise reaches a point of no return. Therefore, these PMS could be used both as biomarkers of apoptosis or as biopharmaceutical targets to decrease the incidence of chronic vascular repair.