Mon travail de thèse a porté sur le ciblage de la vascularisation tumorale : des molécules ciblant l'endothélium tumoral ont été recherchées dans le but d'amener des molécules thérapeutiques spécifiquement vers l'endothélium tumoral afin de le détruire et d'atteindre la tumeur qui en dépendait. D'après les données de la littérature, deux cibles ont été choisies pour notre étude : la sélectine E et l'endogline. La sélectine E est une glycoprotéine surexprimée à la surface de l'endothélium activé des zones inflammatoires et tumorales. Classiquement, des antagonistes de son ligand naturel, le SleX, sont recherchés. En nous appuyant sur les groupements clés de l'interaction entre la sélectine E et le SleX, plusieurs familles de mimes du SleX ont été élaborées. La capacité de ces mimes à déplacer l'interaction du SleX exprimé à la surface des cellules HL-60 avec la sélectine E a été évaluée dans un test d'adhésion. Cependant, aucun des mimes testés n'a présenté une affinité suffisante pour envisager son utilisation comme tête de ciblage. Une deuxième stratégie a consisté à rechercher des ligands peptidiques de la sélectine E en criblant des HUVECs activées avec une banque de peptides sur phages. Plusieurs phages-peptides testés en ELISA ont montré une meilleure affinité pour la sélectine E et / ou avec la sélectine P par rapport au phage sans insert. Des tests de compétition avec des peptides synthétiques correspondants permettront d'évaluer leur spécificité pour la cible. En ce qui concerne l'endogline, des ligands peptidiques ont été recherchés avec une banque de peptides sur phages. Dans un premier temps, le gène codant l'endogline humaine a été cloné dans un vecteur d'expression eucaryote afin de réaliser la sélection sur la protéine cellulaire. Une sélection sur la protéine recombinante a été réalisée par la suite pour diminuer le bruit de fond lié aux cellules. Parmi les peptides obtenus, certains ont montré des homologies de séquence avec des ligands de l'endogline et le test de ces phages-peptides en ELISA sur la protéine recombinante a donné un fort signal par rapport au phage sans insert. Ces peptides seront caractérisés prochainement. En conclusion, des ligands peptidiques des sélectines E et P et de l'endogline ont peut-être été identifiés. Ce travail a par ailleurs permis de mettre en place les outils nécessaires à l'utilisation de la technologie de sélection avec des banques de peptides sur phages dans les meilleures conditions possibles.

Véritable immunothérapie adoptive, l’allogreffe de Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) est destinée à prévenir la rechute d’une hémopathie maligne grâce au combat immunologique du greffon contre la maladie (effet GVL, Graft Versus Leukemia), dans lequel les lymphocytes T apportés par le greffon sont déterminants. Ils peuvent aussi compromettre le résultat escompté, en induisant une réaction du greffon contre l'hôte (GVH, Graft Versus Host) qui reste une complication redoutée de l’allogreffe. Dans une précédente étude prospective portant sur 62 couples donneur/receveur nous avons pu étudier l'impact de la composition du greffon en cellules T de phénotypes naïfs et mémoires sur le devenir des receveurs d’allogreffes à partir d'un donneur HLA-identique apparenté ou non; et nous avons pu démontrer qu’une proportion élevée de lymphocytes T CD4+CCR7+ dans le greffon était un facteur de risque de la survenue, la précocité et la sévérité de la GVH aiguë, sans influence sur la GVH chronique ou la rechute. Dans le but de séparer l’effet GVL de la GVH, nous avons voulu à travers des travaux de cette thèse, étudier le concept d’une T déplétion partielle et sélective du greffon en lymphocytes T CD4+CCR7+. Nous travaux se sont scindés en trois parties :1) Au plan clinique, nous avons pu confirmer nos précédents résultats sur une cohorte additionnelle de 137 patients. Non seulement, nous avons confirmé qu’une proportion élevée de lymphocytes T CD4+CCR7+ dans le greffon était un facteur de risque de la survenue, de la GVH aiguë, mais également, nous avons observé un effet préférentielle de la sous-population naïve des lymphocytes T CD4+ sur l’incidence de la GVH aiguë. Bien entendu, aucun impact sur l’incidence de la rechute post-allogreffe n’a été enregistré.2) Dans un modèle expérimental utilisant des cultures lymphocytaires en présence des cellules dendritiques provenant des six couples (frère/sœur) HLA-identiques, nous avons pu démontrer que les lymphocytes T CD4+ naïfs déclenchaient la réponse allogénique la plus importante et avec un degré moindre les cellules mémoires centrales par rapport aux effecteurs mémoires T CD4+. Ces résultats non seulement, valident in vitro les constatations cliniques mais aussi mettent l’accent sur le rôle prépondérant des lymphocytes T naïfs dans l’alloréactivité, notamment en situation de compatibilité HLA.3) Nous avons dans la troisième partie pu démontrer qu’une déplétion partielle sélective des greffons en lymphocytes T CD4+CCR7+ n’altère pas la réponse immunologique secondaires vis-à-vis des virus.La suite de nos travaux se focalise sur l’effet de la déplétion partielle sélective des greffons en lymphocytes T CD4+CCR7+ sur la réaction anti-tumorale du greffon dans la situation HLA compatibilité chez l’homme.Nos résultats constituent une pierre angulaire dans le concept de déplétion partielle sélective des greffons en lymphocytes T CD4+CCR7+, ex vivo chez l’homme, en vue de réduire l’incidence de la GVHD sans altérer la réponse anti-infectieuse ou tumorale du greffon notamment chez les donneurs présentant un taux élevé de lymphocytes T CD4+ naïfs et/ou mémoire centrale . / A genuine adoptive immunotherapy, Haematopoietic Stem Cell (HSC) allotransplantation aims to prevent the recurrence of a malignant blood disease via an immunological action of the graft against disease (GVL or Graft Versus Leukaemia effect), in which the T lymphocytes supplied by the transplant play a key role. They may also compromise the targeted result, by triggering a GVH (Graft Versus Host) reaction, which remains a serious complication of allotransplantation. In a previous prospective study conducted in 62 donor/recipient pairings, we examined the impact of the transplant\\\'s naive and memory phenotype T cell composition on the fate of recipients of allotransplants from an HLA-identical donor, related to the recipient or otherwise. We demonstrated that a high proportion of CD4+CCR7+ T lymphocytes in the transplant was a risk factor for the development, early onset and severity of acute GVHD, with no influence on chronic GVHD or recurrence. With the objective of separating the GVL effect from the GVH effect, we wanted to investigate the concept of partial and selective CD4+CCR7+ T cell depletion of the graft in the studies conducted as part of this research. Our studies were split into three parts:1) Clinically, we confirmed our previous results in an additional cohort of 137 patients. In addition to confirming that a high proportion of CD4+CCR7+ T lymphocytes in the transplant was a risk factor for the development of acute GVH, we also observed a preferential effect of the naive CD4+T lymphocyte sub-population on the incidence of acute GVHD. Obviously, no impact on the incidence of post-allotransplantation recurrence was recorded.2) In an experimental model using lymphocyte cultures in the presence of dendritic cells taken from six HLA-identical pairings (brother/sister), we demonstrated that naive CD4+ T lymphocytes triggered the greatest allogenic response and, to a lesser degree, central memory cells compared to effector memory CD4+ T cells. Not only do these results validate the clinical observations made in vitro, they also highlight the dominant role of naive T lymphocytes in alloreactivity, particularly in situations of HLA incompatibility.3) In the third part, we demonstrated that selective partial CD4+CCR7+ T cell depletion of the transplants does not impair the secondary immunological response to viruses.The next phase of our research focuses on the effect of selective partial CD4+CCR7+ T cell depletion of grafts on the transplant's anti-tumoural reaction in situations of HLA compatibility in humans.Our results represent a cornerstone in the concept of partial selective T CD4+CCR7+ T cell depletion of transplants, ex vivo in humans, with a view to reducing the incidence of GVHD, without impairing the anti-infectious or anti-tumoural response of the graft, particularly in donors with high levels of naive and/or central memory CD4+ T lymphocytes.

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse. / Endothelial Progenitor Cells (EPCs) are believed to contribute to vascular biology and endothelial repair. EPCs have been isolated from umbilical cord, bone marrow, peripheral blood and in some regenerative tissues. Interactions of EPCs with vascular and blood cells can largely influence their functional properties and predict their destiny in the target tissues. More specifically, interactions of EPCs with circulating platelets provide the critical signal to ensure their migration and homing at the sites of vascular injury and their differentiation into endothelial cells. However, the functional consequences of such interactions on platelets remain unknown. Accordingly, this project was designed to investigate the impact of EPCs on platelet function and the specific objectives of this study were to: 1) generate EPCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); 2) characterize the adhesive interactions between EPCs and platelets; 3) determine their impact on platelet function and thrombus formation and 4) elucidate the mechanistic action of EPCs on platelets and thrombus. Cultured on fibronectin in conditioned media, PBMCs differentiated, within ten days of culture, into EPCs, which were positive for Ulex-lectin and Ac-LDL (Acetylated Low Density Lipoprotein), and expressed progenitor markers (CD34, VEGFR2, vWF, and VE-Cadherin). These EPCs bind activated platelets through P-selectin-dependent mechanism, inhibited platelet activation, aggregation and adhesion, mainly via prostacyclin (PGI2) secretion. Indeed, this was associated with up-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS). However, the effects on platelets were reversed by COX, but not by NO inhibition. Although EPCs bound platelets via platelet P-selectin, their predominant effects occurred via a paracrine secretion, implying PGI2. Nevertheless, a transitory link or brief contact between EPCs and platelets was required for this function to be fully realized. This was further depicted using a murine arterial thrombosis model in P-selectin deficient mice (P sel-/-) and their wild-type counterparts (WT). EPCs significantly impaired, in a concentration dependent-manner, collagen-induced whole blood platelet aggregation in WT mice; whereas in P-sel-/- mice, EPCs had no significant effect. Moreover, in murin model of arterial thrombosis, infusion of EPCs altered thrombus formation and significantly reduced the mass of thrombi generated in WT, but not in P-sel-/- mice. Furthermore, the number of EPCs recruited within the thrombi and along the vascular wall was visually reduced in P-sel-/- mice as compared to WT mice. In this project, we succeeded in adequately differentiating EPCs from PBMCs, we characterized the adhesive interaction between EPCs and platelets, and we addressed the impact of EPCs on platelet function and thrombus formation. Moreover, we identified PGI2 as the principal soluble factor secreted by cultured EPCs and responsible of their inhibitory effects on platelet function in vitro. In addition, using a murine model of arterial carotid injury in WT and P-sel-/- mice, we elucidate the mechanistic action of EPCs on platelet aggregation and thrombus formation, in vivo, and we highlighted the role of platelet P-selectin in this process. These findings add new insights into the biology of EPCs and reveal a potential role for EPCs in regulating platelet function, which in turn may limit thrombogenesis and maintain hemostasis at the sites of vascular injury.

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse. / Endothelial Progenitor Cells (EPCs) are believed to contribute to vascular biology and endothelial repair. EPCs have been isolated from umbilical cord, bone marrow, peripheral blood and in some regenerative tissues. Interactions of EPCs with vascular and blood cells can largely influence their functional properties and predict their destiny in the target tissues. More specifically, interactions of EPCs with circulating platelets provide the critical signal to ensure their migration and homing at the sites of vascular injury and their differentiation into endothelial cells. However, the functional consequences of such interactions on platelets remain unknown. Accordingly, this project was designed to investigate the impact of EPCs on platelet function and the specific objectives of this study were to: 1) generate EPCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); 2) characterize the adhesive interactions between EPCs and platelets; 3) determine their impact on platelet function and thrombus formation and 4) elucidate the mechanistic action of EPCs on platelets and thrombus. Cultured on fibronectin in conditioned media, PBMCs differentiated, within ten days of culture, into EPCs, which were positive for Ulex-lectin and Ac-LDL (Acetylated Low Density Lipoprotein), and expressed progenitor markers (CD34, VEGFR2, vWF, and VE-Cadherin). These EPCs bind activated platelets through P-selectin-dependent mechanism, inhibited platelet activation, aggregation and adhesion, mainly via prostacyclin (PGI2) secretion. Indeed, this was associated with up-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS). However, the effects on platelets were reversed by COX, but not by NO inhibition. Although EPCs bound platelets via platelet P-selectin, their predominant effects occurred via a paracrine secretion, implying PGI2. Nevertheless, a transitory link or brief contact between EPCs and platelets was required for this function to be fully realized. This was further depicted using a murine arterial thrombosis model in P-selectin deficient mice (P sel-/-) and their wild-type counterparts (WT). EPCs significantly impaired, in a concentration dependent-manner, collagen-induced whole blood platelet aggregation in WT mice; whereas in P-sel-/- mice, EPCs had no significant effect. Moreover, in murin model of arterial thrombosis, infusion of EPCs altered thrombus formation and significantly reduced the mass of thrombi generated in WT, but not in P-sel-/- mice. Furthermore, the number of EPCs recruited within the thrombi and along the vascular wall was visually reduced in P-sel-/- mice as compared to WT mice. In this project, we succeeded in adequately differentiating EPCs from PBMCs, we characterized the adhesive interaction between EPCs and platelets, and we addressed the impact of EPCs on platelet function and thrombus formation. Moreover, we identified PGI2 as the principal soluble factor secreted by cultured EPCs and responsible of their inhibitory effects on platelet function in vitro. In addition, using a murine model of arterial carotid injury in WT and P-sel-/- mice, we elucidate the mechanistic action of EPCs on platelet aggregation and thrombus formation, in vivo, and we highlighted the role of platelet P-selectin in this process. These findings add new insights into the biology of EPCs and reveal a potential role for EPCs in regulating platelet function, which in turn may limit thrombogenesis and maintain hemostasis at the sites of vascular injury.

Véritable immunothérapie adoptive, l'allogreffe de Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) est destinée à prévenir la rechute d'une hémopathie maligne grâce au combat immunologique du greffon contre la maladie (effet GVL, Graft Versus Leukemia), dans lequel les lymphocytes T apportés par le greffon sont déterminants. Ils peuvent aussi compromettre le résultat escompté, en induisant une réaction du greffon contre l'hôte (GVH, Graft Versus Host) qui reste une complication redoutée de l'allogreffe. Dans une précédente étude prospective portant sur 62 couples donneur/receveur nous avons pu étudier l'impact de la composition du greffon en cellules T de phénotypes naïfs et mémoires sur le devenir des receveurs d'allogreffes à partir d'un donneur HLA-identique apparenté ou non; et nous avons pu démontrer qu'une proportion élevée de lymphocytes T CD4+CCR7+ dans le greffon était un facteur de risque de la survenue, la précocité et la sévérité de la GVH aiguë, sans influence sur la GVH chronique ou la rechute. Dans le but de séparer l'effet GVL de la GVH, nous avons voulu à travers des travaux de cette thèse, étudier le concept d'une T déplétion partielle et sélective du greffon en lymphocytes T CD4+CCR7+. Nous travaux se sont scindés en trois parties :1) Au plan clinique, nous avons pu confirmer nos précédents résultats sur une cohorte additionnelle de 137 patients. Non seulement, nous avons confirmé qu'une proportion élevée de lymphocytes T CD4+CCR7+ dans le greffon était un facteur de risque de la survenue, de la GVH aiguë, mais également, nous avons observé un effet préférentielle de la sous-population naïve des lymphocytes T CD4+ sur l'incidence de la GVH aiguë. Bien entendu, aucun impact sur l'incidence de la rechute post-allogreffe n'a été enregistré.2) Dans un modèle expérimental utilisant des cultures lymphocytaires en présence des cellules dendritiques provenant des six couples (frère/sœur) HLA-identiques, nous avons pu démontrer que les lymphocytes T CD4+ naïfs déclenchaient la réponse allogénique la plus importante et avec un degré moindre les cellules mémoires centrales par rapport aux effecteurs mémoires T CD4+. Ces résultats non seulement, valident in vitro les constatations cliniques mais aussi mettent l'accent sur le rôle prépondérant des lymphocytes T naïfs dans l'alloréactivité, notamment en situation de compatibilité HLA.3) Nous avons dans la troisième partie pu démontrer qu'une déplétion partielle sélective des greffons en lymphocytes T CD4+CCR7+ n'altère pas la réponse immunologique secondaires vis-à-vis des virus.La suite de nos travaux se focalise sur l'effet de la déplétion partielle sélective des greffons en lymphocytes T CD4+CCR7+ sur la réaction anti-tumorale du greffon dans la situation HLA compatibilité chez l'homme.Nos résultats constituent une pierre angulaire dans le concept de déplétion partielle sélective des greffons en lymphocytes T CD4+CCR7+, ex vivo chez l'homme, en vue de réduire l'incidence de la GVHD sans altérer la réponse anti-infectieuse ou tumorale du greffon notamment chez les donneurs présentant un taux élevé de lymphocytes T CD4+ naïfs et/ou mémoire centrale .

Dans cet ouvrage sera décrite la synthèse de nouveaux analogues du sialyl Lewis X (sLex). A cet effet, nous avons préparé une librairie d’analogues synthétisée à partir d’une approche mettant en jeu un «espaceur» acyclique permettant d’avoir un biais conformationnel que nous avons défini comme la stratégie ATC-B. Nous avions déjà démontré que certains analogues portant un groupe benzoate en C-2 et en C-4 du galactose présentent une activité 50 fois supérieure à celle du sLex. Nous avions par ailleurs démontré qu’en l’absence du benzoate en C-2, l’activité devient alors trois fois plus faible. A présent, il paraissait interessant de synthétiser des analogues ayant seulement un groupe benzoate en C-4 pour evaluer l’impact de ce groupement sur la puissance de nos analogues. Par le passé, nous avions également mis en évidence le rôle des esters sur l’activité des analogues portant un «espaceur» acyclique dans le cadre de la stratégie ATC-B. Nous effectuerons donc des variations à ce niveau pour en évaluer l’impact. Enfin, nous avons préparé une nouvelle famille d’analogues de type dimère. Ceux-ci seront constitués de 2 unités des composés monomériques synthétisés précédemment. La synthèse de ces dimères fera l’emploi de la «Click Chemistry». Cette étude nous mènera a vous présenter la synthèse de ces composés et la méthodologie employée. / This work describes the synthesis of novel sialyl Lewis X (sLex) analogues. To this end, we have prepared a library of analogues by implementing a strategy that makes use of an Acyclic Tether which allows for defined Conformational Bias (ATCB strategy). We have previously shown that analogues bearing a benzoate group at both positions C-2 and C-4 of the galactose exert an activity 50-fold greater than that of sLex. Indeed, removing the benzoate at position C-4 while keeping the one at C-2 led to a three fold decrease in potency. We are currently preparing the corresponding analogues that have the benzoate only at position C-4 in order to fully evaluate its impact on the potency of the analogue. We have also previously elucidated the role of esters on the activity of analogues that have acyclic tether as part of the ATC-B strategy. Variations have been made at the level of the ester and their impact has been evaluated. Lastly, we have prepared a novel family of analogues consisting of two identical monomeric subunits linked together. Synthesis of these dimers was performed via «Click Chemistry». This study describes the synthesis of the compounds and the methodology employed.

Ce travail de thèse avait pour objectif d’élaborer un système vecteur ciblantl’endothélium pathologiquement activé dans les tissus enflammés, infectés ou tumoraux.Ce vecteur est sous forme de nanoparticules décorées de ligands glycosides capablesd’interagir avec l’E-sélectine, un récepteur exprimé sur les cellules endothélialesactivées.Nous avons mis au point une synthèse de copolymère amphiphile avec une architectureà bloc muni sur sa partie hydrophile d’un ligand glucidique. Ce copolymère a été par lasuite utilisé pour la préparation de nanoparticules de type coeur/couronne. La partiehydrophobe centrale est entourée d’une couronne hydrophile dont l'encombrementstérique et la mobilité limitent l'opsonisation de la particule. Le ciblage actif a été assurépar la présence d’un ligand du récepteur de l’E-sélectine aux extrémités des chaînes depolymères hydrophiles à la surface du vecteur.Avec ces nanoparticules dont les propriétés de surface sont prédéfinies, nous avonsmontré in vitro l’association efficace avec les cellules endothéliales activées, ce qui apermis de valider ce concept de ciblage moléculaire actif par l’intermédiaire du couplerécepteur/ ligand. Un tel système permettra d’améliorer l’indice thérapeutique et labiodistribution des principes actifs anti-inflammatoire et/ou anticancéreux. / The objective of this work was to develop a delivery system targeting pathologically activated endothelium within inflamed, infectious, and some tumoral tissues. This system is composed of nanoparticles bearing sugar residues that are able to recognize and interact with E-selectin, a receptor expressed on the activated endothelial cells.We synthesized an amphiphilic block copolymer with the hydrophilic part terminated by a carbohydrate ligand. The construction was achieved by a combination of click chemisty, ring-opening polymerization and atom transfer radical polymerization. This copolymer was used to prepare nanoparticles of the core/shell type where the central hydrophobic body is surrounded with the hydrophilic shell that can stabilize the particles in aqueous media and limit their opsonisation. Active targeting was achieved by coupling an analogue of sialyl Lewis X, the physiological ligand of E-selectin to the end of the hydrophilic polymer chains on the surface of the particles.We were able to demonstrate in vitro the efficient association of these nanoparticles with defined surface properties with activated endothelial cells. This allowed us to validate our concept of active molecular targeting using this couple receptor/ligand couple. Such a system could be used to improve the therapeutically index and the biodistribution of anti-inflammatory and anti-tumor drugs.

La tomographie par émission de positons (TEP) est une technique d’imagerie moléculaire avec de meilleures performances que la tomographie par émission monophotonique. Son utilisation contribue à l’amélioration des prises en charge des patients. Dans les centres dépourvus de cyclotrons, le 68Ga disponible à partir d’un générateur constitue une alternative pour le développement de traceurs TEP. Pour pouvoir développer des 68Ga-traceurs, un travail de caractérisation de la qualité des éluats a été effectué. Des méthodes de marquage adaptées ont été mises en place et validées. Nous nous sommes intéressés à trois cibles moléculaires particulièrement intéressantes dans les pathologies cardiovasculaires: les récepteurs de la somatostatine (SSTR) surexprimés dans les tumeurs neuroendocrines (TNE) mais constituant aussi une cible d’intérêt dans les pathologies cardiovasculaires à composante inflammatoire ; la phosphatidylsérine (PS), un marqueur de l’apoptose cellulaire et de l’activation plaquettaire ; la P-sélectine, un marqueur des activations plaquettaire et endothéliale. Les traceurs suivants ont été développés: 1) Analogues de la somatostatine ciblant les SSTR: a)68Ga-DOTANOC validé pour l’imagerie des TNE-Gastroentéropancréatiques dans le cadre d’un essai clinique multicentrique. b) 68Ga-NODAGANOC testé in vitro sur des cellules d’adénocarcinome pancréatique. Cette validation initiale dans l’application la plus fréquente(oncologie) a pour objectif de faciliter le passage vers des applications cardiovasculaires futures (athérosclérose, myocardite...) ; 2) Un peptide ciblant la PS : le 68Ga-P04087 ; 3) Un polysaccharide ciblant la P-sélectine: 68Ga-NODAGA-Asphy. Les deux derniers traceurs ont été testés sur un modèle d’endocardite infectieuse chez le rat. / The Positron emission tomography (PET) is a molecular imaging technique with usually better performances than Single-Photon Emission Computed Tomography. Consequently, the use of PET and appropriate tracers could enable clinicians to make a better therapeutic decision, thus improving the management of patients. In centers without cyclotrons, 68Ga available from a generator is an alternative for the development of PET tracers. In order to develop 68Ga labeled-molecules, a characterization of the quality of the eluates was performed. Radiolabeling techniques adapted to the quality of the starting material were developed and validated. In this thesis we focused on three particularly interesting molecular targets in cardiovascular pathologies: somatostatin receptors (SSTR), overexpressed in neuroendocrine tumors (NETs) but also constituting a target of interest in cardiovascular diseases with an inflammatory component; phosphatidylserine (PS), a marker of cell apoptosis and platelet activation; P-selectin, a marker of platelet and endothelial activation.The following tracers have been developed: 1) Somatostatin analogues which target SSTR: a) 68Ga-DOTANOC validated for Gastroenteropancreatic-NETs imaging and used in a multicenter clinical trial. b) 68Ga-NODAGANOC tested in vitro on pancreatic adenocarcinoma cells. This initial validation in the most common application (oncology) aims to facilitate the transition to future cardiovascular applications (atherosclerosis, myocarditis ...) 2) A peptide for PS targeting: 68Ga-P04087; 3) A polysaccharide for P-selectin targeting: 68Ga-NODAGA-Asphy. The last two radiolabeled molecules were tested in a rat model of infective endocarditis.

Dans cet ouvrage sera décrite la synthèse de nouveaux analogues du sialyl Lewis X (sLex). A cet effet, nous avons préparé une librairie d’analogues synthétisée à partir d’une approche mettant en jeu un «espaceur» acyclique permettant d’avoir un biais conformationnel que nous avons défini comme la stratégie ATC-B. Nous avions déjà démontré que certains analogues portant un groupe benzoate en C-2 et en C-4 du galactose présentent une activité 50 fois supérieure à celle du sLex. Nous avions par ailleurs démontré qu’en l’absence du benzoate en C-2, l’activité devient alors trois fois plus faible. A présent, il paraissait interessant de synthétiser des analogues ayant seulement un groupe benzoate en C-4 pour evaluer l’impact de ce groupement sur la puissance de nos analogues. Par le passé, nous avions également mis en évidence le rôle des esters sur l’activité des analogues portant un «espaceur» acyclique dans le cadre de la stratégie ATC-B. Nous effectuerons donc des variations à ce niveau pour en évaluer l’impact. Enfin, nous avons préparé une nouvelle famille d’analogues de type dimère. Ceux-ci seront constitués de 2 unités des composés monomériques synthétisés précédemment. La synthèse de ces dimères fera l’emploi de la «Click Chemistry». Cette étude nous mènera a vous présenter la synthèse de ces composés et la méthodologie employée. / This work describes the synthesis of novel sialyl Lewis X (sLex) analogues. To this end, we have prepared a library of analogues by implementing a strategy that makes use of an Acyclic Tether which allows for defined Conformational Bias (ATCB strategy). We have previously shown that analogues bearing a benzoate group at both positions C-2 and C-4 of the galactose exert an activity 50-fold greater than that of sLex. Indeed, removing the benzoate at position C-4 while keeping the one at C-2 led to a three fold decrease in potency. We are currently preparing the corresponding analogues that have the benzoate only at position C-4 in order to fully evaluate its impact on the potency of the analogue. We have also previously elucidated the role of esters on the activity of analogues that have acyclic tether as part of the ATC-B strategy. Variations have been made at the level of the ester and their impact has been evaluated. Lastly, we have prepared a novel family of analogues consisting of two identical monomeric subunits linked together. Synthesis of these dimers was performed via «Click Chemistry». This study describes the synthesis of the compounds and the methodology employed.

Ce travail de thèse avait pour objectif d'élaborer un système vecteur ciblantl'endothélium pathologiquement activé dans les tissus enflammés, infectés ou tumoraux.Ce vecteur est sous forme de nanoparticules décorées de ligands glycosides capablesd'interagir avec l'E-sélectine, un récepteur exprimé sur les cellules endothélialesactivées.Nous avons mis au point une synthèse de copolymère amphiphile avec une architectureà bloc muni sur sa partie hydrophile d'un ligand glucidique. Ce copolymère a été par lasuite utilisé pour la préparation de nanoparticules de type coeur/couronne. La partiehydrophobe centrale est entourée d'une couronne hydrophile dont l'encombrementstérique et la mobilité limitent l'opsonisation de la particule. Le ciblage actif a été assurépar la présence d'un ligand du récepteur de l'E-sélectine aux extrémités des chaînes depolymères hydrophiles à la surface du vecteur.Avec ces nanoparticules dont les propriétés de surface sont prédéfinies, nous avonsmontré in vitro l'association efficace avec les cellules endothéliales activées, ce qui apermis de valider ce concept de ciblage moléculaire actif par l'intermédiaire du couplerécepteur/ ligand. Un tel système permettra d'améliorer l'indice thérapeutique et labiodistribution des principes actifs anti-inflammatoire et/ou anticancéreux.