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Assemblage de répétitions de la séquence 601 dans le génome de Saccharomyces cerevisiae pour dicter l'espacement des nucléosomes in vivo / Repeats assembly of the 601 sequence into Saccharomyces cerevisiae's genome to dictate nucleosome spacing in vivoLancrey, Astrid 18 May 2018 (has links)
Le positionnement des nucléosomes le long des génomes eucaryotes est crucial étant donné qu’il affecte l’accessibilité de l’ADN à des protéines impliquées dans la transcription, la réplication, ou encore la réparation de l’ADN. Si il est aujourd’hui admis que les remodeleurs de chromatine ainsi que les préférences des nucléosomes pour certains motifs d’ADN constituent les deux principaux déterminants du positionnement des nucléosomes in vivo, leur importance relative fait encore l’objet de controverses. Dans le cadre de cette problématique nous avons développé une stratégie d’assemblage de répétitions de la séquence 601 positionnante de nucléosome directement dans le génome de Saccharomyces cerevisiae. Cette technique assistée par la technologie CRISPR/Cas9 et des oligonucléotides chevauchants s’est révélée très efficace et a permis d’assembler des répétitions sur une étendue d’environ 15 kilobases. Nous avons ainsi pu isoler trois souches se caractérisant par trois longueurs d’ADN de liaison de respectivement 20, 50 et 90 paires de bases séparant deux 601 consécutifs tout le long des répétitions. Ces longueurs d’ADN de liaison ont été choisies du fait de leur compatibilité avec les modèles de la fibre de 30 nm étudiés in vitro et parce qu’elles sont fréquemment observées chez les eucaryotes. Nous avons ensuite regardé si ces répétitions de la séquence 601 suffisent à dicter la succession des nucléosomes de S. cerevisiae selon le pas de chromatine attendu. Pour cela, nous avons eu recours à une approche de MNase-seq afin d’analyser les positions des dyades des nucléosomes dans les répétitions. Les résultats de ces analyses révèlent de façon intéressante l’incapacité de la séquence 601 à positionner le nucléosome dans ce contexte cellulaire et cela malgré l’étendue de la région de 601 répétés constituée. Nous avons également analysé le positionnement des nucléosomes chez ces trois mêmes souches suite à l’inactivation de Chd1, l’un des deux principaux architectes du paysage nucléosomal chez la levure, afin de s’affranchir de son potentiel effet sur le positionnement des nucléosomes dans la région 601. Nos résultats montrent que l’absence de Chd1 ne permet pas de rétablir un positionnement des nucléosomes sur les monomères de 601, suggérant que le 601 n’est pas positionnant in vivo ou que la région répétée est sous l’influence d’autres facteurs de remodelage. D’un point de vue méthodologique, notre technique de construction de répétitions in vivo permet d’envisager des approches simplifiées de biologie synthétique pour la construction de librairies de répétitions dans le génome de S. cerevisiae. / Nucleosome positioning along eukaryotic genomes is crucial as it influences DNA accessibility for DNA binding proteins involved in DNA replication, transcription and repair. It is now accepted that both nucleosome preferences for some DNA sequences and remodeling factors play an important role in nucleosome positioning in vivo. However their relative importance remains a matter of debate. To investigate the role played by DNA sequence in nucleosome positioning in a cellular context we developped a strategy to assemble tandem DNA repeats of a nucleosome positioning sequence directly into Saccharomyces cerevisiae’s genome. This method is assisted by CRISPR/Cas9 and overlapping oligonucleotides and it turned out to be very efficient as it allowed to synthetize about 15 kilobases of tandem DNA repeats inside a yeast chromosome. Using this apporoach we obtained three yeast strains differing by the DNA linker length separating two consecutive monomeres of the 601 nucleosome positioning sequence. We chose three lengths of linker (20, 50 and 90 pb) for two reasons. First, they are compatible with the formation of a 30 nm chromatin fiber in vitro, and second, nucleosome repeat length of 167, 197 and 237 pb are found in eukaryotic genomes. We then verified if nucleosomes are effectively positioned according to the theoretic DNA linker lengths we designed in the “601” repeated region. To that goal we performed MNase-seq analysis to deduce nucleosomes dyads positions in the repeats. Interestingly our results show that the 601 sequence is not able to dictate strong nucleosomes positioning differing from the natural nucleosome repeat length of about 165 pb along the repeats in an in vivo context. We further investigated positions of dyads in the same three strains after inactivating the gene coding for the chromatin remodeler Chd1, which could potentially be responsible of the nucleosomes organization in the repeated area. Our results show no effect of Chd1, indicating that the “601” sequence has no positionning effect in vivo or that other trans-acting factors are implicated in nucleosome positioning in the engineered repeats. Finally, this work provides a new fast and simple approach for synthetic DNA repeats construction inside the yeast genome and could easily be applied for other synthetic chromatin engineering approaches.
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Dynamique et stabilité du nucléosome / Nucleosome dynamics and stabilityElbahnsi, Ahmad 10 January 2017 (has links)
Le nucléosome est l’unité élémentaire de la compaction de l’ADN dans les cellules eucaryotes. C’est un complexe composé par un long segment d’ADN enroulé 1.7 fois en super-hélice autour d’un cœur de huit protéines histones. Les nucléosomes contrôlent l’accessibilité de l'ADN en s'associant et se dissociant le long des génomes et, ce faisant, sont directement impliqués dans la plupart des processus nucléaires. Le but principal de ce travail a été de décrire l'interface ADN-histones en solution pour mieux comprendre la stabilité du nucléosome. Nous avons voulu savoir en particulier comment l'ADN est maintenu enroulé autour du cœur d'histone et comment la séquence de l'ADN pourrait éventuellement affecter l'interface ADN-histones. Plusieurs nucléosomes ont été étudiés par dynamique moléculaire en solvant explicite ; ils diffèrent par la taille des queues d'histone et par les séquences d'ADN qui les forment. Pour garantir une analyse objective de la topologie de l’interface ADN-histones, une méthode basée sur les pavages de Delaunay-Laguerre originellement dédiée aux protéines a été adaptée aux acides nucléiques. Nous montrons ainsi que l'interface ADN-histones est constituée d'un réseau d'interaction très dense, caractérisé par des aires de contact électrostatique et hydrophobe équivalentes. Les queues d'histone renforcent significativement l'interface. Le comportement dynamique des arginines des cœurs structurés et des queues d'histone qui interagissent avec les petits sillons de l'ADN a été examiné en détail. Les cations écrantent les répulsions entre les hélices d'ADN juxtaposées l'une au dessus de l'autre du fait de l'enroulement en super-hélice. Enfin, l’interface ADN-histones est globalement retrouvée dans les nucléosomes formés avec des séquences d’ADN défavorables au nucléosome. Ceci suggère qu'une fois le nucléosome formé, il n'y a pas d'effet décisif de la séquence de l'ADN sur l'interface. / The nucleosome is the fundamental unit of DNA compaction in eukaryotic cells. It consists in a long DNA segment (145-147 bp) wrapped in 1.7 left-handed superhelix turns around a histone octamer. Nucleosomes control the DNA accessibility by assembling and disassembling along the genomes and are therefore involved in most nuclear processes.The main aim of the thesis was to describe the DNA-histone interface in solution to better understand the nucleosome stability. We examined in particular how the DNA is maintained wrapped around the histone and how its sequence affects the DNA-histone interface. Several nucleosomes were studied using molecular dynamics in explicit solvent ; they differed by the tail length and the DNA sequences. To ensure an objective analysis of the topology of the DNA-histone interface, a method based on Delaunay-Laguerre tessellations, originally developed for proteins, was adapted to nucleic acids.Our results show that the DNA-histone interface is composed by a dense network of interactions, characterized by equivalent electrostatic and hydrophobic contact area. The histone tails significantly reinforce the interface. The behavior of arginines belonging to the histone structured cores or tails and that interact with the DNA minor groove was scrutinized in detail. Cations shield the repulsive interactions between the two DNA gyres, closely juxtaposed one above the other because of the superhelix wrapping. Finally, the DNA-histone interface is globally not affected in nucleosomes containing DNA sequences known to disfavor nucleosomes. This suggests that, once the nucleosome established, there is no significant effect of the DNA sequence on the interface.
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