La protéine mTOR (mechanistic Target Of Rapamycin), lorsque dérégulée, favorise le développement tumoral par ses fonctions dans la prolifération et la survie cellulaire. Son activité est contrôlée principalement par les facteurs de sa voie d'activation canonique (PTEN/PI3K/AKT) qui sont souvent mutés dans les cancers. Cependant, certains cancers ne présentent pas d'altérations dans cette voie canonique bien que mTOR soit constitutivement active, suggérant ainsi un mécanisme différent. C'est le cas des gliomes de bas grade dont une grande partie présente des mutations hétérozygotes de l'enzyme Isocitrate déshydrogénase (IDH1 et IDH2) menant à un gain de fonction de celles-ci. En effet, l'α-cétoglutarate (αKG) produite par les formes sauvages sera rapidement transformé en 2-Hydroxyglutarate (2HG) par les formes mutées. De plus, ces gliomes présentent très tôt une activité accrue de mTOR et ce, de façon PTEN indépendante. Un criblage par ARN d'interférence ciblant des enzymes αKG dépendantes a permis l'identification de KDM4A, une lysine déméthylase, comme un nouveau régulateur de mTOR. La régulation de KDM4A sur mTOR n'est pas transcriptionnelle, mais semble due à son interaction avec DEPTOR. En effet, sa stabilité, en absence de KDM4A, est grandement diminuée, ce qui favorise l'activité de mTOR. Ainsi, l'implication de KDM4A sur l'activité de DEPTOR s'avère être un nouveau mode de régulation de la protéine mTOR. Nous avons également découvert que DEPTOR peut être phosphorylé sur sa tyrosine 289, ce qui favorise l'activité de mTOR. Cette tyrosine, située près de sérines connues pour réguler la dégradation de DEPTOR, permet une meilleure stabilité de la protéine. De plus, la phosphorylation favorise une réorganisation rapide du cytosquelette d'actine par l'activation de mTORC2. Nous avons par la suite montré qu'elle diminue l'affinité de DEPTOR pour mTOR amenant une activation accrue de cette voie. Un criblage avec différents inhibiteurs de tyrosines kinases de même qu'une analyse par spectrométrie de masse nous a permis d'identifier les kinases SYK (Spleen Tyrosine Kinase) et EPHB2 comme régulateurs de la phosphorylation tyrosine de DEPTOR. En effet, nous avons démontré que la phosphorylation de SYK sur DEPTOR était dépendante de l'activation de SYK par EPHB2. En plus de cette phosphorylation tyrosine, DEPTOR possède également de nombreuses autres modifications post-traductionnelles. En effet, il peut être ubiquitinilé par des chaînes d'ubiquitine de type K48 promouvant sa dégradation par le protéasome, mais également par des chaînes d'ubiquitine K63 dont leur fonction est encore inconnue. L'absence de modification post-traductionnelles sur les 5 dernières lysines de DEPTOR augmente drastiquement la phosphorylation de la tyrosine 289 suggérant que la méthylation ou l'ubiquitination affecte cette modification. Nous avons également trouvé que DEPTOR pouvait être NEDDylée dans sa portion N-terminale au niveau de ses domaines DEP. Une analyse de spectrométrie de masse après des expériences de marquage de proximité par biotinilation a permis d'identifier de multiples enzymes pouvant potentiellement moduler ces modifications. Toutes ces modifications ouvrent la porte à de nouvelles avenues de régulation de l'activité de DEPTOR sur mTOR. L'implication de KDM4A sur l'activité de DEPTOR de même que la phosphorylation de la tyrosine 289 de DEPTOR se révèlent comme de nouveaux mécanismes régulant l'activité de mTOR pouvant expliquer l'augmentation de l'activité de mTOR dans les cancers où la voie canonique n'est pas affectée. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles avenues thérapeutiques qui, combinées à celles déjà existantes, permettra d'offrir des traitements prometteurs lorsque cette voie est dérégulée, notamment dans les gliomes de bas grade. / Dysregulated mTOR (mechanistic Target Of Rapamycin) is a potent tumor growth inducer known to promote cancer cell proliferation and survival. Its activity can be regulated by numerous factors composing the PTEN/PI3K/AKT canonical pathway, which are often mutated in cancer. However, in a subset of cancer showing a constitutively activated mTOR, there is no alteration within the canonical activation pathway, suggesting different activation mechanisms. Low-grade gliomas harbor mutation on Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 (IDH1/2) conferring gain-of-function by the production of 2-Hydroxyglutarate (2HG) from α Ketoglutarate (αKG). This leads to a constitutive mTOR activation in a canonical independent manner. An RNAi screen led us to identify KDM4A, a αKG dependant lysine demethylase as a new regulator of mTOR activity. KDM4A interacts with DEPTOR, an endogenous inhibitor of mTOR and member of both mTOR complex. Depletion or inhibition of KDM4A by 2HG decreases DEPTOR stability and thereby increases mTOR activity. We also discovered a new post-translational modification (PTM) on DEPTOR, corresponding to a single phosphorylation event on tyrosine 289. While this modification increases DEPTOR stability, it also promotes its dissociation from mTORC1&2, leading to a rapid and sustain increase in mTORC1&2 activity. To identify the upstream signaling pathway(s) leading to tyrosine 289 phosphorylation, we performed mass spectrometry analysis, as well as a small drug screen of different tyrosine kinase inhibitors. Using these combined methods, we identify SYK (Spleen tyrosine kinase), whose expression levels correlate with levels of tyrosine 289 phosphorylation. We also found that SYK-induced phosphorylation of DEPTOR was regulated by the EPHB2 receptor. We have shown that DEPTOR harbors many other PTM like ubiquitination conjugated on lysine 48 promoting proteasomal degradation and ubiquitination conjugated on lysine 63 whose function is still unknown. The absence of PTM on the last 5 lysines of DEPTOR drastically increases the phosphorylation of tyrosine 289 suggesting that methylation and/or ubiquitination affect this modification. We also found that DEPTOR can be NEDDylated in its N-terminal part on its DEP domains. Mass spectrometry analysis after proximity biotinilation assays led us to discover multiple enzymes that could potentially modulate all these modifications. This open new insight on DEPTOR regulation and function on mTOR. Our findings uncovered new mechanisms regulating DEPTOR activity, which can explain the increased mTOR activity in cancer with unaffected PTEN/PI3K/AKT regulatory pathways. Better understanding of this mTOR/DEPTOR regulatory pathway could allow the development of a new therapeutic approach to inhibit mTOR associated cancer progression.

Introduction : L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie caractérisée par une augmentation des pressions pulmonaires menant à une défaillance cardiaque droite. Les cellules musculaires lisses des artères pulmonaires (CMLAP) sont exposées à un niveau de stress accru notamment dû à l’inflammation des tissus et du milieu pseudo-hypoxique. Malgré cet environnement hostile, elles arrivent à proliférer et à survivre. Toutefois, cela entraine une augmentation anormale du dommage à l’ADN. Il existe, cependant, un équilibre entre les dommages à l’ADN et les mécanismes de réparation. PIM1, une onco-protéine à l’activité kinase, est surexprimée en HTAP. Elle est impliquée dans plusieurs voies de signalisation cellulaire, telles la survie et la prolifération, mais la voie de réparation du dommage à l’ADN n’a jamais été explorée en HTAP. De plus, l’inhibiteur de PIM1, le SGI-1776, a été testé en essai clinique en cancer, ainsi l’évaluation de son efficacité pour les patients HTAP pourrait rapidement être mise en place. Objectifs : Évaluer le potentiel thérapeutique du SGI-1776 et élucider l’implication de PIM1 dans la réparation du dommage à l’ADN en HTAP. Méthodes/Résultats : Nous démontrons premièrement que les poumons de patients HTAP (n=10) ainsi que les CMLAP-HTAP (n=5) présentent une surexpression de PIM1. Sur ces mêmes tissus et lignées cellulaires, le précurseur de la reconnaissance des dommages à l’ADN (γH2AX) est également augmenté comparativement aux sujets sains. Ce précurseur est essentiel à l’initiation de la réparation à l’ADN et l’inhibition de PIM1 par SGI-1776 (1,3 et 5μM) diminue la capacité de la réponse au dommage à l’ADN via la voie de la jonction des extrémités non-homologues (NHEJ) : le traitement cause une diminution des facteurs du NHEJ comme Ku70, DNA-PKcs et γH2AX (n=4). Par essai comet, nous démontrons que les dommages sont toujours présents et que ceci diminue la prolifération (Ki67 n=3; p<0.05) et augmente l’apoptose (AnnexinV n=3; p<0.05). In vivo, le SGI-1776 diminue les pressions pulmonaires (n=30, 30±2mmHg vs 49±5mmHg) et diminue le remodelage des artères pulmonaires distales (H&E, 45% vs 65%), ce qui est principalement dû à la restauration de la balance entre la prolifération (Ki67 n=25; p<0.05) et l’apoptose (TUNEL n=25; p<0.05) des artères pulmonaires distales. Conclusion : Nous avons démontré pour la première fois l’implication de PIM1 dans la réparation du dommage à l’ADN en HTAP et que l’inhibition de son activité améliore in vitro et in vivo l’HTAP. / RATIONALE: Pulmonary Arterial Hypertension (PAH) is a fatal disease characterized by the narrowing of pulmonary arteries (PA) due to vascular remodeling. It is now established that this phenotype is associated with enhanced pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) proliferation and suppressed apoptosis. This phenotype is sustained in part by the activation of several DNA repair pathways allowing PASMC to survive despite the environmental stresses seen in PAH. PIM1 is an oncoprotein upregulated in PAH and that has been implicated in many pro-survival pathways in cancer, including DNA repair. PIM1 inhibitors, like SGI-1776, are already in clinical trials in cancer and could thus be beneficial to PAH patients. OBJECTIVES: The aim of this study is to demonstrate the implication of PIM1 in the DNA damage response and the beneficial effect of its inhibition by SGI-1776 in human PAH-PASMC and in rat preclinical model of PAH. METHODS/RESULTS: Using western blot we showed in both human PAH lungs (n=10) and PAH-PASMC (n=5) a significant upregulation of PIM1 compared to control donor (n=5). PIM1 upregulation in PAH was associated with a significant activation of DNA damage sensor (γH2AX), which is critical for DNA repair initiation. We showed that PIM1 inhibition using SGI-1776 (1,3, and 5μM) significantly impaired DNA repair capacity in PASMC (n=4) with a significant repression of Ku70, DNA-PKcs, and γH2AX and decreased ATM expression. We showed no diminution of DNA damage with SGI-1776 treatment (Comet Assay, n=3). As expected, the lack of DNA repair in SGI-1776 treated PAH-PASMC lead to a significant reduction in proliferation (Ki67 n=3; p<0.05) and resistance to apoptosis (AnnexinV assay n=3; p<0.05). In vivo, SGI-1776 10mg*kg-1 given 3 times a week, improves significantly (n=30; p<0.05) monocrotaline-induced PH (decreased RVSP, mean PA pressures and vascular remodeling). CONCLUSION: We demonstrated for the first time that PIM1 is implicated in DNA repair signaling in PAH-PASMC and that repressing its activity everses PAH both in vitro and in vivo.

La maladie d'Alzheimer (MA) est la première cause de démence parmi la population âgée, qui atteint plus de 700 000 Canadiens et environ 55 millions de personnes dans le monde. Il s'agit d'une maladie neurodégénérative caractérisée par un déclin progressif de la mémoire et autres fonctions cognitives. Au niveau neuropathologique, la MA se caractérise par l'accumulation et l'agrégation aberrantes de deux protéines : l'amyloïde beta (Aβ), un peptide issu du clivage amyloïdogénique de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP), et la protéine Tau hyperphosphorylée. Jusqu'à récemment, les traitements pharmacologiques de la MA ciblaient uniquement les symptômes cognitifs et comportementaux, sans s'attaquer à la pathologie sous-jacente. Toutefois, de plus en plus d'évidences suggèrent que la phosphorylation joue un rôle crucial sur ces deux protéines, notamment sur leur accumulation, leur agrégation, et leur neurotoxicité. En effet, la phosphorylation anormale d'APP semblerait favoriser son clivage amyloïdogénique, conduisant à la production, l'accumulation et l'agrégation d'Aβ subséquentes. De même, l'hyperphosphorylation de Tau entraîne une déstabilisation des microtubules, ainsi que l'accumulation et l'agrégation de la protéine. Ainsi, les kinases responsables de la phosphorylation d'APP et de Tau pourraient constituer une cible pour le traitement de la maladie d'Alzheimer et des maladies apparentées. Dans cette thèse, nous avons cherché à étudier le rôle de la Polo-like kinase 2 (PLK2), membre d'une famille conservée de kinases à sérine/thréonine associées au cycle cellulaire, dans la pathogenèse et le traitement de la MA. Divers laboratoires, dont le nôtre, ont reporté une accumulation anormale de la PLK2 dans le cerveau de patients et de modèles animaux de la MA. De plus, des études ont suggéré une phosphorylation directe d'APP par la PLK2, ou encore un lien entre des polymorphismes de PLK2 et le risque de développer la maladie. D'autres observations ont révélé une colocalisation de PLK2 avec la protéine Tau hyperphosphorylée. Mis ensemble, ces résultats indiquent que l'accumulation et l'activité anormales de la PLK2 dans le cerveau pourraient entraîner la phosphorylation d'APP et Tau, aggravant ainsi leur accumulation et agrégation, et la dégénérescence neuronale subséquente. Nous suggérons donc que l'inhibition de l'activité kinase de la PLK2 pourrait réduire les pathologies Aβ et Tau, représentant ainsi une potentielle stratégie pour le traitement de la MA. Dans un premier temps, nous avons étudié l'impact de la surexpression et de l'inhibition de la PLK2 en culture cellulaire. Nos résultats ont confirmé que la PLK2 module les niveaux d'expression et de phosphorylation des protéines APP et Tau de manière activité-dépendante dans des cellules HEK293T transfectées. Notre objectif suivant a consisté à évaluer l'efficacité de l'inhibition pharmacologique de la PLK2, pour atténuer la progression de la maladie, dans différents modèles murins transgéniques de la MA. Dans notre première étude, nous avons examiné l'impact d'un traitement transitoire avec un inhibiteur de la PLK2 hautement sélectif et capable de pénétrer la barrière hématoencéphalique, appelé PLK2i #37, chez des souris 3xTg-AD mâles et femelles. Ce modèle murin est un modèle triple transgénique présentant à la fois les pathologies Aβ et Tau humaines. Dans notre seconde étude, nous avons examiné l'effet d'un traitement chronique avec l'inhibiteur PLK2i #37 chez des souris APP/PS1 mâles et femelles. Ce modèle murin transgénique présente, quant-à-lui, uniquement la pathologie humaine Aβ. Nos résultats ont révélé que le traitement atténuait certains déficits cognitifs dans les deux modèles de souris, et ceci dépendamment du sexe des animaux. Au niveau neuropathologique, chez les souris 3xTg-AD mâles, le traitement a réduit la pathologie Tau et a augmenté les niveaux de protéines synaptiques, sans affecter l'accumulation ou le dépôt d'Aβ dans aucun des deux modèles. Toutefois, de manière paradoxale, les femelles 3xTgAD et APP/PS1 traitées présentaient des pathologies Tau et Aβ exacerbées, respectivement. Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que l'inhibition pharmacologique de l'activité kinase de la PLK2 réduit le déclin cognitif et module des composantes clés de la neuropathologie de la MA. Les effets controversés observés au niveau cellulaire et moléculaire suggèrent la nécessité d'étudier plus en profondeur les mécanismes exacts de son potentiel thérapeutique. En outre, nos études mettent en avant la nécessité de prendre en compte les différences liées au génotype et au sexe lors de l'évaluation de traitements de la MA. / Alzheimer's disease (AD) is the most common cause of dementia in the aged population, estimated to affect more than 700 000 Canadians and over 55 million people worldwide. This progressive neurodegenerative disorder manifests in the form of memory impairment and cognitive decline. Neuropathologically, AD is characterized by the aberrant accumulation and aggregation of two proteins: amyloid β (Aβ), a peptide derived from the amyloidogenic cleavage of the amyloid precursor protein (APP), and hyperphosphorylated Tau. Until recently, pharmacological treatments for AD mainly targeted cognitive and behavioral symptoms without addressing the underlying disease pathology. However, accumulating evidence indicates that phosphorylation plays a crucial role in the accumulation, deposition, and associated neurotoxicity of these two proteins. In fact, abnormal phosphorylation of APP seems to promote its amyloidogenic processing and the subsequent production, accumulation, and aggregation of Aβ. In parallel, Tau hyperphosphorylation results in the destabilization of microtubules and the protein accumulation and aggregation. Therefore, the natural kinases responsible for APP and Tau phosphorylation may represent a viable diseasemodifying target for the treatment of AD and related dementia. The present thesis sought to investigate the role of Polo-like kinase 2 (PLK2), a member of a conserved cell cycle-related serine/threonine kinase family, in the pathogenesis and treatment of AD. Our laboratory and others previously reported an abnormal accumulation of PLK2 in the brains of patients and animal models of AD. This finding aligns with in vitro and in vivo evidence suggesting a direct interaction and phosphorylation of APP by PLK2, in addition to reports of a direct link between PLK2 polymorphisms and AD risk. Other studies revealed co-localization of PLK2 with hyperphosphorylated Tau. Taken together, these findings suggest that the abnormal accumulation and activity of PLK2 in the brain may result in APP and Tau phosphorylation, subsequently exacerbating Aβ and Tau accumulation and deposition, and neuronal degeneration. Therefore, we hypothesized that inhibition of PLK2 kinase activity may reduce Aβ and Tau pathologies, representing a potential strategy for the treatment of AD. Initially, we investigated the impact of PLK2 overexpression and inhibition in cell-based assays. Our results confirmed that PLK2 modulates APP and Tau protein expression and phosphorylation levels in a kinase activity-dependent manner in transfected HEK-293T cells. Our subsequent objective was to evaluate the effectiveness of pharmacological inhibition of PLK2 in mitigating disease progression in different transgenic mouse models of AD. In our initial study, we investigated the impact of transient treatment with a potent, highly selective, and brain-penetrant PLK2 inhibitor, designated PLK2i #37, in male and female 3xTg-AD mice, a triple transgenic model exhibiting both human Aβ and Tau pathologies. In our second study, we examined the effect of chronic treatment with PLK2i #37 in male and female APP/PS1 mice, a transgenic model only displaying human Aβ pathology. Our findings revealed that treatment with PLK2i #37 mitigated certain cognitive deficits in both models, albeit in a sex-dependent manner. Intriguingly, at the neuropathological level, treated 3xTgAD and APP/PS1 females presented with exacerbated Tau and Aβ pathologies, respectively. Conversely, in male 3xTg-AD mice, the treatment reduced Tau burden and increased synaptic protein content, without affecting Aβ accumulation or deposition in either model. Overall, our findings demonstrated that pharmacological inhibition of PLK2 kinase activity reduces cognitive decline and modulates key components of AD neuropathology. The conflicting effects observed at the cellular and molecular level suggest the need to further investigate the exact mechanisms of its therapeutic potential. Furthermore, our studies also highlight the need to account for genotypeand sex-related differences when evaluating AD treatments.

La maladie de Parkinson est une maladie neurologique chronique caractérisée par la dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta. Une deuxième caractéristique neuropathologique de cette maladie est l’accumulation des agrégats intracellulaires appelés les corps de Lewy (CLs). Ces agrégats sont majoritairement formés par une protéine pré-synaptique, α-synucléine (α-syn). Cette accumulation pathologique interfère avec les voies métaboliques vitales des neurones telles que la transmission synaptique et l’activité mitochondriale, ce qui engendre la mort cellulaire. Par conséquence, éliminer les formes toxiques, diminuer l’expression de la forme native et réduire ainsi la probabilité de la formation d’agrégats pourrait être une stratégie thérapeutique d’intérêt pour le traitement de la maladie de Parkinson et d’autres désordres qui y sont reliés. Dans ce contexte, notre équipe a récemment décrit une nouvelle voie d’élimination de l’α-syn qui est catalysée par l’activité enzymatique de la kinase Polo-like kinase 2 (PLK2). Cependant, les mécanismes cellulaires ainsi que l’identité des molécules impliquées sont encore méconnus. Donc, mes travaux se sont concentrés sur l’étude de cette voie et ses différentes étapes qui mènent à enlever l’effet toxique de l’α-syn. Dans ce mémoire nous montrons que, en plus de la PLK2, la PLK3, un autre membre de la famille des PLKs, est capable de phosphoryler l’α-syn au niveau du résidu S129 et induire son élimination. En plus, nous déclarons que cette action exige une interaction physique entre les 2 protéines (α-syn et PLK2) impliquant le domaine N-terminal et qu’une étape de poly-ubiquitination est essentielle pour que ce complexe protéique se dirige vers la voie de dégradation autophagique. Cette action de la PLK2 est observée également sur des formes mutées de l’α-syn tels que α-syn A30P, α-syn A53T et d’une manière plus accentuée sur la forme mutante α-syn E46K. La caractérisation de cette voie d’élimination offre de nouvelles opportunités pour le développement des traitements qui favorisent, d’une façon spécifique et sélective, la dégradation de l’α-syn et par conséquent la réduction des formes toxiques de cette dernière. / Parkinson's disease is a chronic neurological disease characterized by the progressive degeneration of the dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. A second neuropathological feature of this disease is the accumulation of intracellular aggregates called Lewy bodies. These aggregates are formed by a pre-synaptic protein, α-synuclein (α-syn). This pathological accumulation interferes with the vital metabolic pathways of neurons such as synaptic transmission and mitochondrial activity, leading to cell death. Consequently, promoting the elimination of the toxic forms, reducing the expression of the native form and decreasing the probability of aggregate formation could be a therapeutic strategy of interest for the treatment of Parkinson's disease and other related disorders. Recently, we have described a novel α-syn degradation pathway that is catalyzed by the enzymatic activity of Polo-like kinase 2 (PLK2). However, the cellular mechanism and the identity of the molecules involved are still unknown. So, my work has focused on studying this pathway and its various steps that lead to remove the toxic effect of α-syn. In this thesis we show that, in addition to PLK2, PLK3, another member of the PLK family, is able to phosphorylate α-syn at S129 and induce its elimination. In addition, we declare that this action requires a physical interaction between the 2 proteins (α-syn and PLK2) involving the N-terminal domain and that a poly-ubiquitination step is essential for the autophagic degradation of the α-syn and PLK2 complex. This effect of PLK2 is also observed on mutated forms of α-syn such as α-syn A30P, α-syn A53T and is more pronounced in the case of the α-syn E46K mutant. The characterization of this elimination pathway offers new opportunities for the development of treatments that allow, in a specific and selective manner, the degradation of α-syn and thus the reduction of its toxic forms.

Il est de plus en plus reconnu que la neurobiologie de la récompense et du renforcement joue un rôle important dans le développement de l'obésité. Parmi les gènes candidats entourant ces processus, DRD2 est l'un des plus étudié. Récemment, sa mutation la plus connue (TaqIA, rsl800497) a été relocalisée dans le gène adjacent ANKK1. Ce dernier n'ayant pas été directement étudié en lien avec l'obésité, l'objectif de cette étude était de répliquer les résultats précédents sur DRD2 en plus de tester l'association de polymorphismes du gène ANKK1 avec l'obésité. Trois mutations du gène DRD2 et cinq de ANKK1 ont été génotypées chez 946 sujets de l'Étude des familles du Québec. Ces derniers ont été phénotypés pour plusieurs indices d'adiposité, leurs comportements alimentaires ont été mesurés par questionnaire et leur diète par journal alimentaire. Les associations les plus fortes ont été observées avec ANKK1 rsl7115439 et DRD2 rs6277. Chez les femmes, le polymorphisme ANKK1 rsl 7115439 était associé à des valeurs plus élevées d'adiposité alors que chez les hommes, cet allele était associé à une consommation plus élevée de lipides. Le polymorphisme DRD2 rs6277 était également associé à des valeurs d'adiposité plus élevées chez les femmes et à une diète plus riche en gras chez les hommes. Aucune association n'a été observée avec les comportements alimentaires du TFEQ . Ces résultats indiquent que des variations génétiques communes des gènes DRD2 et ANKK1 pourraient être impliquées dans la prédisposition à l'obésité.

RAS est une petite protéine Rho-GTPase à la tête d'un réseau de signalisation prolifératif important. Les sentiers activés par RAS incluent les Mitogen-Activated proteins Kinases (MAPK) et la voie Phosphoinositide-3-kinase (PI3K) /Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR). Bien que de nombreuses évidences soutiennent une forte implication de RAS dans la carcinogenèse, les mécanismes moléculaires précis liant RAS et prolifération cellulaire ne sont pas tous élucidés. En utilisant des données publiques de phosphoprotéomique, notre équipe a identifié Zinc Finger Protein 768 (ZNF768) comme une nouvelle cible de RAS essentielle à la croissance et à la prolifération. ZNF768 est un facteur de transcription qui est déstabilisé au niveau post-traductionnel par les voies MAPK et mTOR/AKT. La déplétion aigue de ZNF768 induit prématurément une entrée en sénescence, un état caractérisé par un arrêt irréversible du cycle cellulaire, et souvent mis en place en réponse au stress. Nos études montrent que ZNF768 est dégradée durant ce phénomène ainsi que durant la sénescence réplicative. De plus, la surexpression de ZNF768 réduit l'entrée en sénescence, via un mécanisme majoritairement dépendant du facteur de transcription p53, qui joue un rôle important dans la sénescence. ZNF768 affecte négativement la phosphorylation de certains résidus clés pour l'activation de p53 et inhibe son activité transcriptionnelle. Nous avons par ailleurs démontré une interaction physique entre ces deux protéines. L'ensemble de ces résultats suggère que les voies MAPK et mTOR, toutes deux activées par RAS, déstabilisent ZNF768 afin de renforcer la sénescence prématurée. De manière intéressante, les niveaux de ZNF768 sont élevés dans certaines tumeurs humaines. Ainsi, nous proposons un modèle dans lequel ZNF768 puisse favoriser la carcinogenèse en réduisant la sénescence et en favorisant la prolifération. / RAS is a small Rho-GTPase protein that integrates growth factors signaling and activates several proliferating pathways including Mitogen-Activated Proteins Kinases (MAPK) and Phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR). Although many evidence indicate that RAS is involve in carcinogenesis, the molecular mechanisms that link RAS to cellular proliferation are not well understood. By using phosphoproteomics data, our team identified Zinc Finger Protein 768 (ZNF768) as a new target of RAS signaling essential to growth and proliferation. ZNF768 is a transcription factor destabilized at the post-translational level by MAPK and mTOR/AKT. The acute depletion of ZNF768 induces senescence, a stable arrest of the cell cycle triggered by cellular stress. Our results show that ZNF768 is depleted during replicative and premature senescence. In addition, overexpression of ZNF768 bypasses senescence by a mechanism that is mainly dependent on the activity of p53, a transcription factor involved in senescence. Interestingly, ZNF768 interacts with p53 and inhibits its transcriptional activity by modulating its phosphorylation. Thus, MAPK and mTOR/AKT pathways destabilise ZNF768 to reinforce senescence. Moreover, ZNF768 levels are high in various human tumors. Altogether, these results suggest that ZNF768 promotes carcinogenesis by blocking senescence and by stimulating proliferation.

Les voies de signalisation Wnt et FGF sont parmi les plus importantes dans les communications inter-cellulaires qui régissent le développement et l’homéostase des tissus embryonnaires ou adultes. Bien que l’on connaisse énormément de choses sur ces voies et les protéines qui les composent, plusieurs questions persistent quant à leur régulation. Notre travail fait usage du modèle amphibien Xenopus laevis dans l’étude du rôle de deux MAP4K kinases de la famille Misshapen: xTNIK et xMINK dans la balance entre les branches «canonique» et «non-canonique» de la signalisation Wnt, ainsi que dans l’étude d’une nouvelle protéine adaptatrice de l’endocytose: E-Syt2 et de son rôle dans la régulation de la signalisation FGF. La voie signalétique Wnt est principalement traduite par la famille des récepteurs serpentins Frizzled vers deux voies distinctes : la voie dite «canonique» régulant la β-catenine nucléaire, et la voie dite «non-canonique» qui active les petites GTPases Rac et RhoA ainsi que la MAP-kinase JNK et les PKCs. Nous montrons ici que TNIK (Traf2 and Nck-interacting kinase) et xMINK (Misshapen/NIKs-related kinase) sont des composantes essentielles de ces deux voies de réponse. xTNIK et xMINK interagissent ensemble in vivo et subissent un clivage protéolytique libérant des domaines Kinase et Citron-NIK-Homology (CNH) respectivement activateur et suppresseur du signal. Les deux kinases interviennent dans la voie «non-canonique» cependant, alors que xTNIK est également un médiateur de la voie «canonique», xMINK y joue un rôle antagoniste et ces effets dépendent de leurs activités catalytiques. Nous apportons enfin la preuve qu’une régulation spécifique du clivage protéolytique des deux pro-enzymes dans les différents tissus embryonnaires régule leur activité de façon différentielle et suggérons qu’il s’agit là d’un mode d’aiguillage de la réponse Wnt entre les voies «canonique» et «non-canonique» in vivo. Enfin, nous montrons que la protéine membranaire de type synaptotagmine E-Syt2 est essentielle dans la phase précoce de l’endocytose du récepteur aux FGF activé, elle-même nécessaire à l’activation de ERK et à l’induction du mésoderme. E-Syt2 interagit spécifiquement avec le récepteur aux FGF activé ainsi qu’avec l’Adaptin-2. Il est en outre requis en amont de Ras dans l’activation de ERK et nos données identifient donc E-Syt2 comme un adaptateur endocytique de la voie de la clathrine. / The Wnt and FGF pathways are among the most critical inter-cellular signalling pathways controlling embryo development and the homeostasis of adult tissues. Although much is known about the signal transduction routes and proteins constituting these pathways, many questions concerning their regulation remain to be answered. The present work uses the Xenopus laevis model system to study the role of two kinases of the Misshapen family of MAP4K signalling kinases, xTNIK and xMINK, in the balance between canonical and non-canonical branches of Wnt signalling, and the role of a new endocytic adapter protein, E-Syt2, in regulation of FGF signalling by endocytosis. Wnt signals are predominantly transduced via the Frizzled family of serpentine receptors to two distinct pathways, the canonical pathway regulating nuclear -catenin and a non-canonical pathway that activates the small GTPases Rac and RhoA, the JNK MAP-kinase and PKC. My work shows that xTNIK (Traf2 and Nck-interacting kinase) and xMINK (Misshapen/NIKs-related kinase) are essential and indeed integral components of both the canonical and non-canonical Wnt pathways. xTNIK and xMINK interact with each other and are proteolytically cleaved in vivo to generate Kinase domain fragments that are active in signal transduction, and Citron-NIK-Homology domain (CNH) fragments that are suppressive. The Kinase domain fragments of xTNIK mediate both canonical and non-canonical signalling, whereas those derived from xMINK mediate non-canonical signalling but strongly antagonize canonical signalling. This work suggests that tissue specific regulation of the proteolytic cleavage of xTNIK and xMINK controls the balance between canonical and non-canonical Wnt signalling. The synaptotagmin-related membrane protein E-Syt2 was found to be essential for an early phase of activated FGF receptor endocytosis that is necessary for functional ERK activation and mesoderm induction. E-Syt2 interacts selectively with the activated FGF receptor and with Adaptin-2, and is required upstream of Ras for ERK activation. Together these data identified E-Syt2 as an endocytic adapter for the Clathrin-dependent pathway.

Les protéines kinases de type NIMA (NIMA related kinases - Neks) forment une famille relativement bien conservée chez les eucaryotes. Plusieurs d’entre elles, comme la protéine kinase NIMA d’Aspergillus nidulans et la protein Nek2 de mammifères ont fait l’objet d’études suffisamment approfondies pour les impliquer dans la régulation du cycle cellulaire. L’objectif du présent travail était de caractériser la famille des Neks chez les plantes, et plus particulièrement de déterminer le rôle de PNek1, une Nek de peuplier. J’ai identifié neuf PtNeks chez Populus trichocarpa, sept AtNeks chez Arabidopsis thaliana et six OsNeks chez Oryza sativa. L’analyse phylogénétique et leur distribution chromosomique suggèrent une descendance unique chez les plantes, probablement à partir de Nek1. L’analyse du profil d’expression transcriptionnelle indique que la régulation de l’expression des Neks est liée aux patrons de développement basipétal de la feuille et vasculaire de la plante. Plus particulièrement, l’analyse de l’expression du gène PNek1 révèle une concordance exacte avec les sites de production de l’auxine, du développement basipétal de la feuille et de l’initiation du système vasculaire. PNek1 n’est toutefois pas induite par la signalisation de l’auxine. La surexpression de PNek1 chez Arabidopsis induit des anomalies importantes au niveau de l’inflorescence, empêchant même la fertilisation de la fleur. Au plan cellulaire, PNek1 est localisé dans le nucléole et s’accumule lors de la phase G2 précédant la mitose. L’accumulation de PNek1 est aussi induite lors d’un stress génotoxique au point de contrôle en G1/S. Des résultats récents de double hybride indiquent que PNek1 pourrait être impliquée dans la maturation de l’ARNm puisqu’elle interagit avec DBR1, une protéine directement impliquée dans l’épissage. Le présent travail offre une perspective inédite de la littérature des Neks comme régulateurs du cycle cellulaire. Le contexte biologique particulier du peuplier m’a aussi conduit à associer les Neks au développement d’organes complexes. Cette approche et ces observations représentent donc en soit une contribution originale, se distinguant des nombreuses études antérieures faites chez les mammifères, où seule leur relation au cycle cellulaire a été étudiée. / The NIMA-related kinases family (Neks) is well conserved among eukaryotes. Several studies, especially on Aspergillus nidulans NIMA and mammalian Nek2, have tagged them as cell cycle regulators. The objective pursued in this work was to characterise the plant Nek family and, more specifically, to identify a possible role for PNek1, a Nek from poplar tree. Here, I describe nine PtNeks in Populus trichocarpa, seven AtNeks in Arabidopsis thaliana and six OsNeks in Oryza sativa. Phylogenetic analysis in addition to their chromosomal distribution suggest a unique origin for all plant Neks. Exhaustive transcript expression analysis indicates that plant Neks regulation is related to the basipetal and vascular plant development patterns. Moreover, PNek1 promoter expression analysis reveals a striking similarity with sites of auxin production, basipetal leaf development and vascular initiation. However, PNek1 is not induced by auxin signalling. PNek1 overexpression in Arabidopsis induces severe inflorescence anomalies, which can lead to flower sterility. At the cell level, PNek1 is localised in the nucleoli and accumulates during the G2 phase before the onset for mitosis. PNek1 transcript accumulation could also be induced by a genotoxic stress at the G1/S checkpoint. Yeast two-hybrid experiments indicate that PNek1 could be involved in mRNA maturation since it interacts with DBR1, a protein directly involved in RNA splicing. This work offers a unique perspective to the actual Neks literature as cell cycle regulators. The particular biological context of poplar trees also brought me to associate Neks with complex organ development. This approach and these observations represent an original contribution, distinguishing itself from the numerous mammalians studies which only looked at their relation to the cell cycle regulation.

La voie de signalisation mTORCl/S6Kl est impliquée dans le développement de la résistance à l'insuline associée à l'obésité en exerçant une boucle de rétro-contrôle négative sur la voie de signalisation PI3K-Akt. Tandis que l'utilisation à court terme de la rapamycine, l'inhibiteur pharmacologique de la voie mTORCl, permet d'inhiber le rétro-contrôle négatif, les effets de l'inhibition chronique de la voie sur le métabolisme ne sont pas connus. L'objectif principal des études présentées dans cette thèse était d'investiguer les effets métaboliques de l'inhibition chronique de la voie de signalisation mTORCl/S6Kl in vitro et in vivo. Dans la première étude, nous avons montré que l'inhibition chronique de mTORCl/S6Kl découple l'activation d'Akt de la PI3K ce qui cause une résistance à l'insuline dans les cellules 3T3-L1. Dans une deuxième étude, nous avons découvert que l'utilisation chronique de la rapamycine in vivo cause une intolérance au glucose et une résistance à l'insuline de par une augmentation de la gluconéogénèse hépatique en plus d'affecter négativement le métabolisme des lipides. Dans une troisième étude, nous avons démontré que l'inhibition chronique de mTORCl/S6K1 dans les cellules hépatique FAO découple l'activation d'Akt de la PI3K ce qui augmente la production de glucose hépatique. Finalement, dans une quatrième étude, nous avons déterminé que l'inhibition chronique de mTORCl/S6K1 dans les cellules L6 ne permet pas de restaurer le transport du glucose stimulé par l'insuline en présence d'un excès de nutriments. L'ensemble de nos études démontre le rôle important joué par la voie de signalisation mTORCl/S6K1 sur le contrôle du métabolisme du glucose et des lipides et limite l'inhibition chronique de mTOR comme cible thérapeutique pour le traitement du diabète de type 2 et de l'obésité.

Les lipides sont présents en grande concentration au cerveau où ils y jouent des rôles structuraux, biochimiques, et de signalisations cellulaires connues pour influencer nos comportements. Cependant, leurs impacts sur la physiologie des neurones sont encore mal compris. Dans cette thèse, nous avons étudié la physiologie des neurones du cortex entorhinal suite à des traitements alimentaires changeant la teneur en lipide du cerveau. Le cortex entorhinal a été sélectionné car il joue un rôle essentiel dans les processus cognitifs et est impliqué dans diverses maladies telles l'Alzheimer et l'épilepsie. Nous avons observé que la consommation d'huile de canola:soya, comparativement à une huile de carthame:maïs, module l'ensemble des propriétés actives des neurones comme le potentiel d'action, l'activité de décharge et les réponses postsynaptiques excitatrices. Des études supplémentaires ont suggéré que les acides gras monoinsaturés étaient les ingrédients actifs des huiles de canola:soya à ce niveau. Ensuite nous avons étudié les effets d'un acide gras polyinsaturé n-3 de 22 carbones le DHA, chez un modèle murin de la maladie Alzheimer (MA), la souris 3xTg-AD. L'acide docosahexaénoïque (DHA) a prévenu la perte de capacitance cellulaire et la hausse de l'activité de décharge des neurones, en plus de compenser la déficience de reconnaissance et de réduire l'expression d'un phénotype akinétique chez les souris transgéniques. Une étude chez l'animal non transgénique (NonTg) a démontré que la consommation d'acide linolénique (LNA), un acide gras polyinsaturé n-3 de 18 carbones, ne reproduisait pas les effets neuronaux du DHA. Finalement, nos travaux ont démontré que la kinase PAK (p21 -activated kinase) exerce un rôle important, quoique complexe, sur les marqueurs neuropathologiques et les anomalies comportementales et morphologiques chez la souris 3xTg-AD. En somme, nos résultats démontrent que les lipides alimentaires peuvent influencer la fonctionnalité du cerveau et qu'on peut les utiliser pour corriger certaines anomalies physiologiques associées à la MA. De plus, nous avons approfondi le rôle de la kinase PAK dans le développement de la MA.