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The dissertation is focused on assessing the influence of yeast culture and selenium addition on yeast culture in feed diet, on colostrum quality and blood serum parameters. The content of immunoglobulins G and the density of colostrum, as the main parameters of the quality of the colostrum, were evaluated in the first born cows and other cows on the second and higher lactation and compared with each other. At the same time, blood serum parameters were also monitored as supplementary indications of feeding intervention in the feed diet of breeds. The main aim of the work was to evaluate the influence of additions of feed additives on the quality and composition of colostrum. Immunoglobulins G were analyzed in all colostrum and blood serum samples. IgG were determined by the ELISA method. The results obtained indicate that the addition of yeast culture and selenium to yeast culture did not have the expected positive effect on improving the quality and composition of cows' colostrum or on blood serum indicators.

Le sérum ajouté aux milieux de culture est connu pour être une substance difficile à contrôler en raison de la présence de facteurs variables. Le but de cette étude était de faire varier les conditions de culture en retirant le sérum lors de la montée à l'interface air-liquide et de poursuivre les observations sur la qualité des substituts cutanés sains et psoriasiques produits par la méthode d'auto-assemblage. Les résultats histologique, macroscopique et immunohistochimique des substituts sains cultivés avec ou sans sérum ne montrent aucune différence significative. Les analyses infrarouges effectuées sur ces derniers permettent d'observer que ceux cultivés en absence de sérum possèdent une meilleure organisation lipidique au niveau de la couche cornée. Par contre, l'absorption percutanée démontre des différences au regard des propriétés physico-chimiques des molécules étudiées. De plus, les substituts conçus à partir de cellules psoriasiques affichent des résultats différents lorsque le sérum est retiré. Il semble que l'apport du sérum soit davantage important lors de l'utilisation de cellules pathologiques.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation du programme génétique de l'épithélium intestinal sont encore à ce jour très peu connus. Dans ce travail, nous avons étudié la régulation des membres de la famille de facteurs de transcription C/EBP en utilisant la lignée épithéliale intestinale de crypte IEC-6 afin de mieux comprendre le rôle de ces gènes dans l'intestin. Dans un premier temps, nous avons vérifié par Northern l'expression des ARNm des C/EBPs suite à la stimulation des cellules avec du sérum qui favorise la prolifération cellulaire et avec un traitement au dexaméthasone qui diminue la prolifération cellulaire. Le sérum induit à des niveaux variables les ARNm des trois isoformes alors que les niveaux d'ARNm de C/EBP? et C/EBP? augmentent rapidement suite à un traitement aux glucocorticoïdes. Par des études de run-on, nous démontrons que le sérum agit surtout par des mécanismes post-transcriptionnels alors que le dexaméthasone influence les niveaux d'ARNm principalement au niveau transcriptionnel. Les analyses par Western nous permettent de constater une induction des trois protéines C/EBP?, ? et ?, parallèle à celle des ARNm suite à une stimulation par le sérum. Par contre, les variations de l'expression de ces trois protéines en présence de dexaméthasone par rapport aux niveaux d'ARNm témoignent d'une certaine régulation post-traductionnelle. La capacité de liaison à l'ADN des C/EBPs augmente suite à la stimulation par le sérum mais ne varie pas suite à un traitement au dexaméthasone, tel que révélé par la technique de rétention sur gel. Des études d'immunofluorescence montrent une localisation nucléaire pour C/EBP? et C/EBP?. Par contre, pour la première fois, nous démontrons une localisation différente de C/EBP?, soit périnucléaire et cytoplasmique, contrairement à une localisation nucléaire chez les hépatocytes et adipocytes. La régulation complexe des C/EBPs dans ces conditions particulières suggère un rôle potentiel de ceux-ci dans la croissance et la réponse inflammatoire des cellules épithéliales intestinales de la crypte.

Contexte Des travaux antérieurs ont montré que l'interleukine-6 circulante (IL-6) était un facteur prédicteur significatif de la survenue de seconds cancers primaires (SCP) chez les patients atteints d'un cancer de la sphère oto-rhino-laryngologique (ORL). Objectif Le but de cette étude était d'identifier les facteurs associés aux niveaux sériques d'IL-6 chez les patients atteints de cancer ORL de stade I-II. Méthodes Cette étude a été réalisée dans le cadre d'un essai de chimioprévention de phase III. Un échantillon de sérum a été obtenu avant tout traitement auprès de 527 des 540 patients présentant un cancer ORL recrutés pour participer à l'essai clinique. L'IL-6 a été mesurée par immunométrie chimioluminescente. Les caractéristiques sociodémographiques et cliniques des patients, leurs habitudes de vie et les caractéristiques de leur tumeur ont été évaluées. Les facteurs indépendamment associés aux niveaux sériques d'IL-6 ont été identifiés en utilisant un modèle de régression linéaire multiple. Résultats La concentration médiane d'IL-6 dans le sérum était de 3,1 ng/L (intervalle interquartile : 2,20-4,40). L'analyse multivariée a permis d’identifier huit facteurs significativement associés à l'IL-6 (P ≤ 0,05) : l’âge, le sexe, le statut matrimonial, l’indice de masse corporelle, le tabagisme, l’indice de comorbidités, le score de performance de Karnofsky et le site tumoral. Chez les fumeurs, les taux sériques d'IL-6 augmentaient de façon dose-dépendante avec la durée du tabagisme (p de tendance = 0,03) et avec le nombre de paquets-années consommés (p de tendance = 0,03). Conclusion Ces résultats ont montré que plusieurs facteurs de risque standards de SCP sont aussi associés aux taux circulants d'IL-6. Ceci suggère que l'effet de ces facteurs sur la survenue de SCP pourrait être médié par un processus inflammatoire. De plus, nous avons montré une relation doseréponse avec la quantité ou la durée du tabagisme, suggérant un rôle causal du tabac dans la production d'IL-6. / Background In a previous work, we reported that circulating interleukin-6 (IL-6) significantly improves outcome prediction for second primary cancer (SPC) in head and neck cancer (HNC) patients. Objective The purpose of this study was to identify factors associated with IL-6 serum levels in patients with stage I or II HNC. Methods This study was conducted as part of a phase III chemoprevention trial. A pretreatment serum sample was obtained from 527 of the 540 HNC patients recruited in the trial. IL-6 was measured on an Immulite analyzer with chemiluminescent immunometric assay (Siemens Diagnostics). Patients’ sociodemographic and medical characteristics, lifestyle habits and cancer characteristics were evaluated before radiation therapy. Factors independently associated with IL-6 levels were identified using the multiple linear regression. Results The median of IL-6 serum level was 3.1 ng/L (Interquartile range: 2.20-4.40). In the multivariate analysis, eight factors were significantly associated with IL-6 (P ≤ 0.05): age, sex, marital status, body mass index (BMI), smoking, comorbidity index, Karnofsky performance status, and cancer site. In cigarette smokers, IL-6 serum levels increased with longer durations of cigarette smoking (p-value for trend = 0.03) and with the number of pack-years consumed (p-value for trend = 0.03). Conclusion These results showed that several standard risk factors of SPC, such as age, BMI and smoking status, are associated with circulating IL-6 levels. This suggests that the effect of these factors on the occurrence of SPC might be mediated by an inflammatory process. Moreover, we have shown a dose-response relationship with the quantity smoked or the duration of smoking suggesting a causal role of tobacco in IL-6 production.

Le nombre de thérapies cellulaires à l'étude va grandissant. Parmi ces thérapies, on retrouve la thérapie cellulaire de la dystrophie musculaire de Duchenne. Cette dernière vise l'amélioration des conditions de vie des enfants atteints par cette maladie génétique rare. En effet, on dénombre 1 garçon sur 3500 touché par cette maladie. Il s'agit d'une maladie génétique irréversible affectant le gène de la dystrophine, qui occasionne une dégradation prématurée des fibres musculaires. Les patients touchés se retrouvent rapidement immobilisés, ce qui amène une mort lente, généralement causée par une insuffisance pulmonaire ou cardiaque, entre l'âge de 20 à 30 ans. Cette thérapie consiste à prélever des cellules du patient qui seront mises en culture, corrigées génétiquement, pour alors être greffées vers les muscles ciblés. Pour contribuer à la sécurité de cette thérapie, un milieu de culture cellulaire non supplémenté par du sérum sanguin (serum-free medium, SFM) a été développé par Victor Parent, étudiant au doctorat sous la supervision d'Alain Garnier. Ce milieu permet de remplacer le milieu conventionnel utilisé pour multiplier ces cellules (serum containing media, SCM) contenant du sérum fœtal bovin (fetal bovine serum, FBS). Le FBS est efficace en culture cellulaire, cependant il augmente les risques de contamination chimique et biologique. Il fait en sorte que la composition du milieu de culture est variable d'un lot à l'autre de FBS, ce qui augmente la variabilité du procédé de croissance cellulaire et son coût dispendieux n'est pas à l'abri des fluctuations du marché. Ces fortes contraintes motivent le développement de milieux définis sans sérum. Le SFM a été développé en testant plus de 6 milieux de base et plus de 60 ingrédients divers. Cependant les cellules cultivées dans ce milieu ne présentent pas la même morphologie que celles cultivées en présence de FBS. Aussi, en fin de culture en SFM, les cellules peuvent présenter un début de différentiation en myotubes. Cette différentiation est non désirable lors de la culture de cellules précurseurs des muscles (myoblastes). De plus, le coût de l'ensemble des ingrédients du SFM représente 1600 $/L, soit 5 fois celui du milieu standard (SCM). Afin de résoudre ces problèmes et réduire le coût de ce milieu, une étude a été lancée pour optimiser le SFM. Pour ce faire, un algorithme d'analyse d'image a été utilisé afin d'évaluer objectivement, simplement et en direct, la morphologie cellulaire. Cette méthode est non destructive et a la capacité d'analyser automatiquement cette morphologie en étant combinée à un microscope automatisé dans un environnement contrôlé. Combiné à l'utilisation de plans statistiques d'expérience, ces moyens permettent d'obtenir les informations nécessaires en utilisant un minimum d'échantillons, d'efforts et de coûts. Afin de répondre aux objectifs de ce projet, quatre groupes de plans d'expérience ont été effectués sur les ingrédients existants du SFM. Les résultats de ces essais ont permis d'exclure quatre des huit ingrédients les plus coûteux du SFM, ce qui représente une diminution totale de son coût de 59%, aboutissant à l'identification d'un milieu optimal (MSFM). De plus, la morphologie et le temps doublement des cellules dans le MSFM est similaire au SCM et ne présente aucune formation de myotubes. Un essai de greffe de cellules cultivées avec ce milieu démontre que la greffe de cellules cultivées dans le MSFM est 20% plus efficace in vivo par rapport aux milieux standards (SFM et SCM). Face à deux compétiteurs de ce milieu, le MSFM se situe parmi les moins chers du marché (2 fois plus élevé que le SCM) et il est 81% plus performant que son plus proche concurrent. En conclusion, cette recherche a permis d'optimiser un milieu de culture cellulaire sans sérum. Cette optimisation rend ce milieu, le MSFM, le plus performant et le moins cher actuellement disponible. Il va donc ainsi pouvoir s'intégrer dans tous travaux de recherche menés sur les myoblastes humains ainsi que lors du développement de thérapies cellulaires de la dystrophie musculaire de Duchenne et finalement de l'application de ces thérapies.

La thérapie cellulaire pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est présentement à l'étude chez l'humain. Elle consiste à injecter aux patients des cellules précurseurs de muscle ("muscle precursor cells", MPC) saines. Ce traitement a récemment démontré qu'il était efficace en essais cliniques de phase 1 sur de petits volumes de muscle (1 ce). Cependant, il reste plusieurs problèmes à résoudre au niveau du procédé de production de ces cellules avant que la thérapie soit applicable pour le traitement complet des patients. Pour le moment, le seul milieu de culture commercial qui permet une bonne prolifération des MPC contient du sérum sanguin d'origine bovine, un produit animal non-défini pouvant être contaminé par des virus ou des prions d'origine inconnue, ce qui peut entraîner des risques pour la santé des patients. Quelques milieux ne contenant pas de sérum sont également disponibles commercialement, par contre aucun des ces milieux ne permet une expansion cellulaire satisfaisante. L'objectif de notre projet est de développer un milieu de culture sans sérum pour l'expansion des MPC par une approche de fractionnement séquentiel et itératif, ce qui devrait permettre à terme l'isolation des facteurs sériques stimulant la croissance des MPC. Pour ce faire, nous avons adopté une méthodologie basée sur la planification statistique des expériences pour identifier les composés qui permettent une bonne expansion des cellules, sur de longues périodes et de façon économique. La procédure de fractionnement choisie consiste en une séparation basée sur l'ultrafiltration et la chromatographie d'échange anionique. Plusieurs fractions ont été obtenues et analysées individuellement et en combinaison pour identifier leur effet sur l'expansion cellulaire. Les résultats montrent que certaines fractions ont un effet positif sur la croissance cellulaire, meilleur que celui obtenu avec le milieu contenant du sérum complet. D'autres techniques analytiques comme la chromatographie liquide couplée en ligne avec la spectrométrie de masse (LCMS) et Pélectrophorèse ont également été utilisées pour analyser des facteurs présents dans ces fractions.

La plupart des pathologies, qu'elles soient d'origine génétique ou non trouvent leur origine dans l'altération structural et/ou fonctionnelle de protéines d'intérêt. L'agrégation, la glycation et l'oxydation constituent les principaux types de modification protéique fréquemment observées dans de nombreuses maladies tels que le diabète, l'athérosclérose ou encore les maladies neurodégénératives. Généralement, l'altération des activités biologiques de ces protéines est étroitement corrélée avec ses changements conformationnels et structuraux. L'albumine représente la protéine circulante la plus abondante et constitue le plus important antioxydant du plasma sanguin susceptible d'être exposée à un stress glycoxydant accru, et aboutir à la formation de Produits Avancés de Glycation (AGEs) dont les effets peuvent être néfastes au niveau cellulaire et tissulaire. Dans cette étude, je me suis intéressé à l'effet de trois types d'altérations, que sont l'agrégation, la glycation et l'oxydation, sur la structure, le statut redox et l'activité antioxydante de l'albumine ainsi que l'incidence de cette protéine modifiée sur la physiologie de différentes lignées cellulaires. Au cours de ce travail, j'ai abordé les quatre points suivants : 1. Afin de mieux comprendre l'impact de ces processus altératifs sur les propriétés antioxydantes de l'albumine, j'ai étudié, en utilisant des techniques de la Biochimie et de la Biophysique, les modifications structurales de la protéine soumise successivement à la glycation, l'agrégation et aux deux processus simultanément. 2. J'ai mis en évidence et identifié des cibles protéiques sensibles à l'oxydation au niveau d'adipocytes matures humains incubés en présence d'albumine bovine glycoxydée in vitro. 3. J'ai effectué une comparaison de l'action différentielle des modèles in vitro de d'AGEs préparés à partir de l'albumine d'origine bovine ou humaine au niveau de monocytes THP1. 4. Enfin, afin de valider les caractéristiques structurales et biologiques obtenues à partir de nos modèles in vitro d'AGEs dérivés de l'albumine, j'ai étudié sur des modèles purifiés à partir de plasmas de sujets, l'état structural, redox et antioxydant de l'albumine altérée in vivo. Les résultats obtenus lors de ce travail permettent de mettre en avant l'importance de la structure native de la plus abondante des protéines circulantes sur l'intégrité de ses fonctions biologiques et en particulier sur son activité antioxydante. Également, cette étude apporte un nouvel éclairage sur l'implication de l'albumine altérée dans de nombreux désordres métaboliques tels que le diabète.