Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by leandro spinola (l.spinolafla@gmail.com) on 2009-11-20T21:51:13Z No. of bitstreams: 1 dissertacao F N M Viana.PDF: 2137567 bytes, checksum: 87da30dd1e4f284e75ac1059c71edb17 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2009-11-24T17:59:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertacao F N M Viana.PDF: 2137567 bytes, checksum: 87da30dd1e4f284e75ac1059c71edb17 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-24T17:59:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao F N M Viana.PDF: 2137567 bytes, checksum: 87da30dd1e4f284e75ac1059c71edb17 (MD5) Previous issue date: 2006-05 / A Síndrome de Resistência aos Hormônios Tireoideanos (SRHT) é caracterizada pela resposta reduzida dos tecidos-alvo aos hormônios tireoideanos (HTs). É comumente devida a mutações em um alelo do gene do receptor do hormônio tireoideano b (TRb) que codifica para um TR mutante, o qual inibe a função do TR nativo, fenômeno conhecido como dominância negativa. Em genes regulados positivamente pelo T3, o mecanismo molecular da dominância negativa envolve a dimerização do TR mutado com o TR nativo ou com RXR, sobre o DNA. Porém, pouco se sabe como isso ocorre em genes cuja transcrição é reprimida por T3. O objetivo desse estudo foi investigar o mecanismo de dominância negativa em genes regulados negativamente por T3, bem como a importância da dimerização envolvida nesse processo. Para isso, células U937 foram co-transfectadas com vetores de expressão do TRâ1 nativo ou TR mutado associados ao gene repórter da luciferase dirigido por promotores regulados negativamente: AP-1, TRH ou TSHá. Os TRs mutados utilizados foram os descritos na SRHT (F451X e G345R). Além disso, o mutante L422R, que é deficiente na sua propriedade de dimerização também foi utilizado. Os resultados mostraram que o F451X e G345R, quando comparado ao TR nativo, não reprimem a transcrição na presença de T3. Quando co-transfectado com TR nativo, F451X (1:5) reduz em 61% a inibição transcricional do TSHá, mas em apenas 16% em AP-1 e não prejudica a repressão em TRH. Efeito similar foi observado com outro mutante da SRHT, o G345R. A dominância negativa não foi observada no promotor com sítio AP-1 ou no TRH, mesmo quando a concentração dos mutantes, F451X e G345R, foi 10x maior que TR nativo. A introdução da mutação L422R no mutante F451X (L422R/F451X) e no G345R (L422R/G345R) corrigiu o forte efeito dominante negativo desses mutantes na regulação do promotor do TSH. É interessante observar que o mutante L422R, na presença de T3, apresentou uma taxa de repressão transcricional semelhante ao TR nativo no promotor do TRH (74%) e AP-1 (78%) mas significativamente inferior na regulação do promotor do TSH, 11% em relação ao TR nativo. Nossos resultados sugerem que a dimerização está envolvida na dominância negativa do TR mutado quando este regula a transcrição do promotor do TSH, enquanto que no promotor do TRH e AP-1, a ligação via monômeros de TR parece ser a forma oligomérica preferida e incapaz de induzir a dominância negativa. Coletivamente, esses resultados sugerem que o efeito dominante negativo imposto pelo TR mutado varia de acordo com o promotor que é regulado negativamente por TR e que a forma monomérica não parece exercer a dominância negativa. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Resistance to thyroid hormone (RTH) is characterized by the reduced response of the target tissue to thyroid hormone (TH). Usually is related with mutations in one allele of thyroid hormone receptor beta (TRâ) that is encoded for TR mutant, which impairs the normal function of TR wild type (TRwt), a phenomenon described as a dominant-negative effect. ln positive regulated genes for T3, this effect involves the dimerization of TR mutant with TRwt or with RXR on DNA. However, it is not well understood how this occur in genes which transcription is down regulated by T3. The aim of this study was to investigate the importance of dimerization in the dominant-negative mechanism in negative regulated genes by T3. For this, the U937 cells were co-transfected with TRâ1wt expression vectors or TR mutant, associated to luciferase reporter gene, driven by negative regulated promoters such as AP-l, TRH or TSH. The TR mutants were described in the RTH (F451X or G345R). The mutant L422R, that is defective in the dimerization, was also utilizated. The results showed that F451X and G345R, when compared with TRwt, did not suppress the transcription in the presence of T3. When co-transfected with TRwt, F451X (1:5) reduced in the 61 % the TSHá transcription inhibition, but only 16% in AP1 and did not damage the suppression in TRH. The same effect was observed with other RTH utant, the G345R. The dominant-negative effect was not observed in the promoter with AP-l or TRH, even so the concentration of the mutants, F451X and G345R, was ten times higher than TRwt. The presence of the mutation L422R in the mutant F451X (L422R/F451X) and in the G345R (L422R/G345R) corrected the strong dominantnegative effect these mutants in the regulation of the TSH. Is interesting to observe that the mutant L422R, in the presence of T3, show the suppression rate was similar to TRwt in the TRH promoter (74%) and AP-l (78%) but significant1y lower in the regulation of the TSH promoter (11%). Our results suggest that dimerization is involved in the dominant-negative effect of TR mutant in the regulation of the transcription of the TSH promoter, while in the TRH and AP-l promoter, TR seems preferentially to bind as monomers and it is incapable to persuade the dominantnegative effect. Taken together, these results suggest that the dominant-negative effect of the mutants varies with the type of promoter which is negative regulated for TR and the monomers can not practice the dominant-negative effect.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Esta tese apresenta 3 trabalhos completos apresentados na forma de 2 manuscritos e 1 capítulo de livro. São eles: Artigo 1 - A Brazilian Database of Resistance to Thyroid Hormone: identification of 17 new cases and 6 novel mutations in the thyroid hormone receptor ß gene - 24; Artigo 2 - The Proline in Codon 452 of TRß Plays a Critical Role in the Interaction with Corepressor and Coactivator - 43 e Capítulo do livro "Endocrinologia", editado por Mario J. A. Saad, Rui M. B. Maciel e Berenice B. Mendon<;a intitulado "Resistência aos hormônios da tiróide" - 75. O interesse na linha de pesquisa sobre Síndrome de Resistência aos Hormônios Tiroidianos e aspectos funcionais dos Receptores dos Hormônios Tiroidianos derivou-se da presença, em nosso ambulatório, de pacientes que necessitavam de maior esclarecimento diagnóstico, para os quais uma pesquisa molecular das mutações caudadoras da síndrome poderia esclarecer definitivamente tal diagnóstico.#Síndrome / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Maricilda Palandi de Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T17:10:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Petroli_ReginaldoJose_M.pdf: 2303670 bytes, checksum: 1836c8a6df94a76ee177d830781dc293 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Considera-se que insensibilidade androgênica seja a causa mais freqüente dos distúrbios da diferenciação do sexo em pacientes com cariótipo 46,XY. Trata-se de uma anomalia recessiva ligada ao cromossomo X, que pode se manifestar de forma branda, parcial ou completa, com um amplo espectro de variação fenotípica. O gene do receptor de andrógenos (AR) está localizado no cromossomo X, na região Xq11-12, sendo organizado em oito exons separados por introns de até 26 kb. Sua região codificante apresenta aproximadamente 2.757 pares de bases traduzindo uma proteína de 919 aminoácidos, cujo peso molecular é de aproximadamente 110 kDa. A proteína AR apresenta três domínios funcionais: domínio de regulação transcricional (amino-terminal), domínio de ligação ao DNA que contém dois dedos de zinco (zinc finger) e domínio de ligação ao esteróide (carboxi-terminal). O domínio amino-terminal possui repetições dos aminoácidos glutamina e glicina cujos números podem variar dentro da população normal. O domínio de ligação ao esteróide (carboxi-terminal), apresenta o maior número de mutações, cerca de 55% das descritas neste gene. Entre o domínio de ligação ao DNA e o domínio de ligação ao esteróide encontra-se a região hinge que contém um sinal responsável pela localização nuclear necessária para a translocação do complexo andrógeno/receptor do citoplasma para o núcleo da célula. Pacientes com cariótipo 46,XY e diagnóstico de insensibilidade androgênica geralmente apresentam fenótipo feminino ou ambigüidade genital, porém a produção de testosterona é normal. Nestes pacientes a investigação de mutações no gene do receptor de andrógeno é indicada para a identificação da alteração molecular relacionada à doença. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo a caracterização das alterações moleculares do gene AR, através da análise de seus oito exons e junções exons-introns por reação da cadeia da polimerase (PCR) seguida de sequenciamento dos fragmentos amplificados. Das 47 famílias que compõem a casuística deste trabalho, 14 apresentaram mutações no gene, sendo uma relacionada ao fenótipo brando da insensibilidade androgênica (p.P694S), sete relacionadas ao fenótipo parcial da insensibilidade androgênica (p.Q58L, p.A596T, p.S597R, p.M742V, p.Q798E, p.L830F e p.A896V) e seis relacionadas ao fenótipo completo da insensibilidade androgênica (p.R774H, p.P766S, p.C806F, p.R832Term, p.R855H e p.V866M). Uma paciente apresentou duas alterações, ambas no exon 6 deste gene. Quatro mutações estão sendo descritas pela primeira vez neste trabalho em pacientes com insensibilidade androgênica / Abstract: The androgen insensitivity syndrome (AIS) is considered the most frequent disorders of sex differentiation in patients with 46,XY karyotype. It is a recessive X linked disorder, which manifests as mild, partial or complete forms, with a broad spectrum of phenotypic variation. The androgen receptor gene (AR) is located on the X chromosome within Xq11-12 region. It is organized in eight exons separated by introns up to 26 kb in length. Its coding region comprises approximately 2,757 base pairs translating a protein of 919 amino acids, whose molecular weight is approximately 110 kDa. The AR protein has three functional domains: the transcriptional regulatory domain, the DNA binding domain which contains two zinc fingers and the steroid binding domain in the carboxy-terminal region. The amino-terminal domain presents repeats of glutamine and glycine whose numbers of residues vary within the normal population. The steroid-binding domain presents the highest number of mutations, around 55% of the mutations described in this gene are located in this region. Between the DNA-binding domain and the steroid-binding domain there is a hinge region that contains a signal responsible for nuclear localization required for translocation of the complex androgen/receptor from the cytoplasm to the cell nucleus. Patients with 46,XY karyotype and androgen insensitivity diagnosis usually have female or ambiguous genitalia, but normal testosterone production. In these patients the investigation of androgen receptor gene mutations is indicated to identify the molecular changes related with AIS. Therefore, the aim of this study was to characterize molecular alterations in the AR gene, by analysis of the eight exons and introns-exons junctions by polymerase chain reaction (PCR) followed by sequencing the amplified fragments. Fourteen out of 46 families comprised in this study had mutations identified. One mutation corresponded to the mild phenotype of androgen insensitivity (p.P694S), seven were related to the partial androgen insensitivity phenotype (p.Q58L, p.A596T, P. S597R, p.M742V, p.Q798E, p.L830F and p.A896V), and six were associated to the complete androgen insensitivity phenotype (p.R774H, p.P766S, p.C806F, p.R832Term, p.R855H and p.V866M). One patient presented two mutations, both located in exon 6 of the gene. Four mutations were described for the first time in this research in patients with androgen insensitivity / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Fernanda Caroline Soardi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Petroli_ReginaldoJose_D.pdf: 6228632 bytes, checksum: e6e99d402e3d99ccab57c84290065e84 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O receptor de andrógenos (AR) é um fator de transcrição pertencente à superfamília de receptores nucleares e é ativado por fosforilação e dimerização sob a ligação ao hormônio. Várias funções são atribuídas a este receptor, sendo a principal delas o desenvolvimento e manutenção das características sexuais masculinas, atua na regulação da expressão gênica e diferenciação celular em tecidos alvos. O presente trabalho teve por objetivo principal a análise do efeito das mutações p.Pro695Ser, p.Ser759Tre, p.Leu768Val., p.Cis806Fen+p.Gln798Glu, p.Leu830Fen, p.Ile898Fen e p.Pro904Arg sobre a função do AR. As mutações acima citadas, localizadas no domínio de ligação ao hormônio, foram identificadas por sequenciamento direto do gene do AR de pacientes 46,XY com diferentes graus da Síndrome da Insensibilidade Androgênica (AIS). Mutações nesse domínio geralmente rompem a ligação aos andrógenos naturais, porém há algumas que não afetam essa ligação, mas interferem na interação entre os domínios amino e carboxi-terminal (N/C terminal), importante para a estabilização receptor-ligante. Assim, ambas funções foram investigadas. Para se avaliar a capacidade de transativação das proteínas AR mutantes, foi realizada a técnica de mutagênese sítio dirigida no cDNA completo, seguida de transfecção e expressão em células e mamíferos e, análise de transativação induzida por concentrações crescentes de 5?-diidrotestosterona (DHT) utilizando-se um gene repórter. A análise das interações N/C-terminal para cada AR mutante foi realizada pela técnica de duplo-híbrido em células de mamíferos. A mutação p.Pro695Ser apresentou atividades de transativação de 85% e 82% nos ensaios transativação com o cDNA completo e no duplo-híbrido, respectivamente, em valores de DHT fisiológicos (cerca de 1 nM). As atividades atingiram valores normais em concentrações elevadas de DHT indicando um baixo efeito sobre a atividade gonadal. No entanto, em concentrações de DHT inferiores a atividade de transativação decai para menos de 50% nos dois experimentos, podendo afetar as funções do AR em tecidos não gonadais. Esta mutação foi considerada "branda" e corresponde perfeitamente ao fenótipo masculino do paciente que se apresentava com ginecomastia, mas com fertilidade preservada. Com 1 nM de hormônio, as mutações p.Ser759Tre, p.Leu830Fen, p.Ile898Fen apresentaram atividade de transativação superior a 20%, havendo um aumento de resposta com concentrações crescentes. No entanto, o comportamento de cada uma no experimento de interação N/C diferiu sendo que a p.Ile898Fen não apresentou atividade em nenhuma concentração de ligante; as p.Ser759Tre e p.Leu830Fen responderam positivamente ao aumento da concentração de DHT atingindo 50% e 250% da atividade trancricional do receptor selvagem, respectivamente. Esses resultados indicam um fenótipo parcial de AIS (PAIS) para os portadores das mutações p.Ser759Tre e p.Leu830Fen. Nesses casos verificou-se uma boa correlação dos achados funcionais com os fenótipos dos pacientes que apresentavam graus variados de PAIS. Já para a mutação p.Ile898Fen o fenótipo esperado baseando-se nos resultados funcionais seria o de AIS na forma completa (CAIS), porém os pacientes portadores desta mutação apresentavam graus variados de ambiguidade genital compatíveis com o fenótipo PAIS. Isto indica que outros fatores devem estar influenciando a manifestação fenotípica nesse caso. A mutação p.Leu768Val apresentou atividade transcricional nula em 1 nM de DHT nos dois experimentos, um perfil típico do fenótipo CAIS apresentado pelo portador desta mutação. As mutações p.Gln798Glu e p.Cis806Fen estudadas separadamente apresentaram respostas à indução de DHT semelhantes às de mutações "brandas" e PAIS, respectivamente. No entanto, quando estudadas em conjunto, a atividade de transativação com 1 nM foi inferior a 10%, aumentando com o aumento da concentração de ligante, comportamento compatível com mutações mais graves resultando no fenótipo CAIS observado nesse caso. Por último, a mutação p.Pro904Arg, embora tenha reduzido a atividade trancricional para cerca de 20% da selvagem no experimento com o cDNA completo, no experimento com duplo híbrido a atividade foi nula indicando uma ação mais grave compatível com a forma CAIS observada. A análise funcional do AR aqui realizada pode elucidar alguns mecanismos moleculares associados a cada mutação, bem como pode fornecer subsídios para a resposta ao tratamento com DHT em cada caso em particular / Abstract: The androgen receptor (AR) is a transcription factor that belongs to the superfamily of nuclear receptors activated by phosphorylation and dimerization by hormone binding. Several functions are attributed for AR, like male sex development, regulation of gene expression and cell differentiation in target tissues. The aim of this study was to analyze the effect of mutations p.Pro695Ser, p.Ser759Tre, p.Leu768Val, p.Cys806Phe+ p.Gln798Glu, p.Leu830Phe, p.Ile898Phe and p.Pro904Arg upon AR transactivation activity. All mutations studied here are located in the hormone-binding domain and were identified in patients with different degrees of androgen insensitivity syndrome (AIS) by AR gene sequencing. Mutations in this domain can result in the impairment of androgen ligation, but there are cases that it does not affect the binding but interfere with the interaction between the amino and carboxi-terminal domains (N/C terminal), important step for receptor-binding stabilization. Thus, both functions have been studied in this work. To evaluate the ability of AR transactivation of mutant proteins, the site-directed mutagenesis assay was performed on full-length cDNA, followed by transfection and expression in mammalian cells. The analysis of transactivation of a reporter gene with different dihydrotestosterone (DHT) concentrations was performed. The analysis of N/C-terminal interactions for each mutant AR was performed by two- hybrid mammalian assay. The mutation p.Pro695Ser reveled transactivation activities of 85% and 82% in transactivation assays with the full-length cDNA and two hybrid assay, respectively, at DHT physiological values (approximately 1 nM). The activities reached normal values at high DHT concentrations, indicating a low effect on gonadal activity. However, in low DHT concentrations, the transactivation activity decays to less than 50% in both experiments, which may affect AR functions in non-gonadal tissues. This mutation was considered "mild" and corresponds perfectly to the male phenotype of the patient who presented with gynecomastia, but with preserved fertility. With 1 nM hormone, the p.Ser759Tre, p.Leu830Phe, p.Ile898Phe mutations showed transactivation activity higher than 20%, the response increased with higher DHT concentrations. However, in N/C interaction assays, those mutations showed different results. The p.Ile898Phe revealed a complete disruption in N/C interaction at all hormone concentrations; the p.Ser759Tre and p.Leu830Phe showed positive response with the increasing in DHT concentrations and reached 50% and 250% of the transcriptional activity of wild type, respectively. Such results indicate a partial AIS phenotype (PAIS) as functional effect for p.Ser759Tre and p.Leu830Phe. In these cases there was a positive correlation with the phenotypes of patients that presented different degrees of PAIS. For the p.Ile898Phe, the expected phenotype based on functional analysis would be the complete form of AIS (CAIS), but the patients with this mutation had variable degrees of genital ambiguity consistent to PAIS. This indicates that other factors must influence the phenotypic manifestation. The p.Leu768Val revealed a complete disruption at 1 nM DHT in both experiments, typical of CAIS. The p.Gln798Glu and p.Cys806Phe mutations studied separately revealed responses to the induction of DHT similar to Mild and Partial phenotypes, respectively. However, when analyzed together, the transactivation activity of 1 nM was lower than 10%, increasing in high ligand concentration, which is consistent to CAIS phenotype. Finally, p.Pro904Arg, although showed residual transcriptional activity around 20% of the wild type in the experiment with the full-length cDNA, it abolished the transcriptional activity when N/C terminal interaction was tested indicating a CAIS phenotype, as observed in the patient. Functional analysis of the AR performed here could elucidate some molecular mechanisms associated with each mutation, and may provide a basis for response to treatment with DHT in each particular case / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Submitted by Maria Aparecida (cidazen@gmail.com) on 2017-12-04T15:19:39Z No. of bitstreams: 1 Carolina Abreu de Carvalho.pdf: 1818066 bytes, checksum: 5d7b157435ace852cabbfd08eaba9af0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-04T15:19:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carolina Abreu de Carvalho.pdf: 1818066 bytes, checksum: 5d7b157435ace852cabbfd08eaba9af0 (MD5) Previous issue date: 2017-10-17 / Introduction: Several studies have documented the association between inflammation and metabolic outcomes. The Dietary Inflammatory Index (DII) is a tool to evaluate the inflammatory potential of the diet. Studies associating the DII with the metabolic syndrome or insulin resistance still controversial. Purpose: to assess the association of the DII with insulin resistance (IR) or metabolic syndrome (MS). Methods: A cross-sectional study was conducted on 2017 adults aged 23 to 25 years in Ribeirão Preto, Brazil. Food consumption was assessed using a validated Food Frequency Questionnaire. The DII was calculated from 35 available food parameters. IR was determined from the classification of HOMA-IR values (≥2.7uU mL-1). MS was diagnosed based on the Joint Interim Statement (JIS) criterion. The association of DII score with IR or MS was determined by Poisson regression analysis with robust estimation of variance. The variables included in the multivariable model were selected from Directed Acyclic Graphs (DAG). Results: The diet of the young adults studied showed a high inflammatory potential, with a mean DII of 1.10 (range: -4.69 to +5.28). The prevalence of MS was 12.2% and of IR was 12.3%, both greater in males. In adjusted analysis, the DII was not associated with IR or MS in either sex. Conclusions: Although this association was not detected in this sample of young adults, the study demonstrated that their diet had a high inflammatory potential, a fact that may increase the risk for the development of non-communicable diseases in the future. / Introdução: Diversos estudos têm documentado a associação entre inflamação e desfechos metabólicos. O Índice Inflamatório da Dieta (IID) é uma ferramenta para avaliação do potencial inflamatório da dieta. Trabalhos associando o IID à síndrome metabólica ou resistência insulínica ainda controversos. Objetivo: avaliar a associação do IID com resistência insulínica (RI) ou síndrome metabólica (SM). Materiais e Métodos: Trata-se de um estudo transversal, realizado com 2017 adultos de 23 a 25 anos, em Ribeirão Preto, Brasil. O consumo alimentar foi avaliado a partir de um Questionário de Frequência Alimentar validado. O IID foi calculado a partir de 35 parâmetros alimentares. A RI foi avaliada a partir da classificação de valores de HOMA-IR (≥2,7 uU mL-1). Para diagnosticar SM foi considerado o critério do Joint Interim Statement (JIS). A associação do IID com RI ou SM foi avaliada por análise de regressão de Poisson com estimativa robusta da variância. As variáveis incluídas no modelo multivariado foram selecionadas a partir de gráficos acíclicos direcionados (Directed Acyclic Graph – DAG). Resultados: A dieta dos adultos jovens estudados apresentou elevado potencial inflamatório, com média de IID de 1,10, variando de -4,69 a +5,28. A prevalência de SM foi de 12,2% e de RI 12,3%, ambas maiores no sexo masculino. Na análise ajustada, o IID não se associou com RI ou SM em ambos os sexos. Conclusão: Apesar da associação não ter sido encontrada nesta amostra de adultos jovens, o estudo evidencia que a dieta dos jovens estudados tem um elevado potencial inflamatório, o que pode aumentar o risco para o desenvolvimento de doenças e agravos não-transmissíveis no futuro.