Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ana Maria Iba Kanashiro / Banca: José Moacir Marin / Resumo: A glicoproteína de superfície (8) do vírus da bronquite infecciosa (VBI) em aves; é um alvo antigênico importante para a indução de imunidade e como antígeno utilizado no imunodiagnóstico da infecção causada por este vírus. Nesse estudo, a forma recombinante da subunidade 81 da glicoproteína 8 da estirpe M41 do VBI foi clonada e expressa como proteína de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o epítopo V-5 em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador dessa proteína foi amplificado a partir do RNA genômico da estirpe M41 do VBI, por meio das técnicas da reação de transcrição reversa (RT) e da reação da polimerase em cadeia (PCR). Foi amplificada toda a seqüência codificadora de interesse e fossem geradas extremidades compatíveis com a inserção no vetor pYE82.1N5-His-TOPO. Este vetor foi usado na transformação de leveduras, tendo sido obtidos os clones transformantes específicos portadores do inserto gênico. A expressão da proteína de fusão foi então induzida, em células de S. cerevisiae, sendo produzida a proteína recombinante 81 de fusão com peso molecular 95 kDa. Essa proteína apresentou com uma elevada reatividade cruzada para a proteína 8 do próprio vírus, tal como demonstraram os resultados das análises pelo Western blotting e ELl8A. Essa proteína de fusão foi, devido à presença da cauda de poli¬histidina, prontamente purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel ¬agarose e, posteriormente utilizada com sucesso no desenvolvimento de um método indireto de ELl8A para a detecção de anticorpos específicos de galinhas infectadas com o VBI. / Abstract: The surface glycoprotein of infectious bronchitis virus (IBV) is a important antigenic target for the induction of immunity and as antigen in the immunodiagnosis of infection caused by this virus. In this study, the gene of 51 glycoprotein of M41 strain of the IBV was cloned and expressed as a fusion protein containing a poly-histidine and epitope V-5 tags in the yeast cells of Saccharomyces cerevisiae. The 51 gene was amplified from genomic RNA of the M41 strain of VBI, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR). The entire coding sequence of 51 gene was amplified and inserted in the vector pYE52.1N5-His-TOPO. This construct was used for transforming yeast cells, and to obtain specific clones carrying the inserted gene. The expression of the fusion protein was induced in transformed cells of S. cerevisiae, and a recombinant 51 protein was produced with a molecular weight of 95 kDa. A high cross¬reactivity with the original 51 protein from the virus was detected by Western blotting and ELl5A. The presence of the poly-histidine tail in the fusion recombinant protein favored their prompt purification by affinity chromatography in a column of nickel¬sepharose. This recombinant 51 protein was successfully used in the development of an indirect method of ELl5A for the detection of specific anti-IBV antibodies in chickens experimentally infected or vaccinated with this virus. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-14Bitstream added on 2014-06-13T20:35:46Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_ap_me_jabo.pdf: 460448 bytes, checksum: eeb8cefed995b5624ebdb1b544ded04b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A glicoproteína de superfície (8) do vírus da bronquite infecciosa (VBI) em aves; é um alvo antigênico importante para a indução de imunidade e como antígeno utilizado no imunodiagnóstico da infecção causada por este vírus. Nesse estudo, a forma recombinante da subunidade 81 da glicoproteína 8 da estirpe M41 do VBI foi clonada e expressa como proteína de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o epítopo V-5 em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador dessa proteína foi amplificado a partir do RNA genômico da estirpe M41 do VBI, por meio das técnicas da reação de transcrição reversa (RT) e da reação da polimerase em cadeia (PCR). Foi amplificada toda a seqüência codificadora de interesse e fossem geradas extremidades compatíveis com a inserção no vetor pYE82.1N5-His-TOPO. Este vetor foi usado na transformação de leveduras, tendo sido obtidos os clones transformantes específicos portadores do inserto gênico. A expressão da proteína de fusão foi então induzida, em células de S. cerevisiae, sendo produzida a proteína recombinante 81 de fusão com peso molecular 95 kDa. Essa proteína apresentou com uma elevada reatividade cruzada para a proteína 8 do próprio vírus, tal como demonstraram os resultados das análises pelo Western blotting e ELl8A. Essa proteína de fusão foi, devido à presença da cauda de poli¬histidina, prontamente purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel ¬agarose e, posteriormente utilizada com sucesso no desenvolvimento de um método indireto de ELl8A para a detecção de anticorpos específicos de galinhas infectadas com o VBI. / The surface glycoprotein of infectious bronchitis virus (IBV) is a important antigenic target for the induction of immunity and as antigen in the immunodiagnosis of infection caused by this virus. In this study, the gene of 51 glycoprotein of M41 strain of the IBV was cloned and expressed as a fusion protein containing a poly-histidine and epitope V-5 tags in the yeast cells of Saccharomyces cerevisiae. The 51 gene was amplified from genomic RNA of the M41 strain of VBI, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR). The entire coding sequence of 51 gene was amplified and inserted in the vector pYE52.1N5-His-TOPO. This construct was used for transforming yeast cells, and to obtain specific clones carrying the inserted gene. The expression of the fusion protein was induced in transformed cells of S. cerevisiae, and a recombinant 51 protein was produced with a molecular weight of 95 kDa. A high cross¬reactivity with the original 51 protein from the virus was detected by Western blotting and ELl5A. The presence of the poly-histidine tail in the fusion recombinant protein favored their prompt purification by affinity chromatography in a column of nickel¬sepharose. This recombinant 51 protein was successfully used in the development of an indirect method of ELl5A for the detection of specific anti-IBV antibodies in chickens experimentally infected or vaccinated with this virus.

Submitted by CAREN PAVANI null (caren_pavani@hotmail.com) on 2017-08-29T17:29:24Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-POS-Caren-DEFINITIVO-V-2-HJM-AGO-23-17.pdf: 1281724 bytes, checksum: 16544949d05b1aee20711a16abcbfdac (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A lombada de seu trabalho só é necessária na versão impressa, para encadernação. Por favor, exclua a lombada da versão digital. Corrija estas informações e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-08-29T18:44:21Z (GMT) / Submitted by CAREN PAVANI null (caren_pavani@hotmail.com) on 2017-08-29T18:51:55Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-POS-Caren-DEFINITIVO-V-2-HJM-AGO-23-17.pdf: 1278516 bytes, checksum: 04ce7b2fc7a143ce39b6187b81ee676f (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-08-29T18:59:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pavani_c_me_jabo.pdf: 1278516 bytes, checksum: 04ce7b2fc7a143ce39b6187b81ee676f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T18:59:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pavani_c_me_jabo.pdf: 1278516 bytes, checksum: 04ce7b2fc7a143ce39b6187b81ee676f (MD5) Previous issue date: 2017-08-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Em plantéis avícolas, é frequente a ocorrência de doenças infecciosas respiratórias e dentre estas, destaca-se a Bronquite Infecciosa (BI), uma doença aguda e altamente contagiosa de aves. A BI é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI), cujo processo infeccioso geralmente provoca perdas econômicas significativas para as criações avícolas. A extensa variação genética, especialmente nas regiões hipervariáveis (HVRs) do gene S1, é uma das principais características da evolução do VBI, e resulta no surgimento de diversas variantes, que requerem um diagnóstico molecular que inclua a detecção dessas novas estirpes, como o genótipo brasileiro (BR-VBI), pois a detecção e identificação do agente etiológico são essenciais para o controle dessa enfermidade. Para tanto, é necessário que os métodos de diagnóstico empregados sejam sensíveis, específicos e de baixo custo. Foi então desenvolvida e avaliada neste estudo uma técnica de Nested-RT-PCR (BR-Nested-RT-PCR) utilizando um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores desenvolvido dentro da região HVR3 do gene S1 de estirpes variantes brasileiras do VBI para a detecção e identificação de linhagens do genótipo brasileiro do VBI presentes em amostras biológicas de aves e comparada com a Nested-RT-PCR universal, utilizando oligonucleotídeos iniciadores universais para a mesma região do gene S1. Os resultados demonstraram que a técnica BR-Nested-RT-PCR apresentou uma elevada sensibilidade na detecção de estirpes do genótipo BR-I do VBI e não gerou produtos amplificados a partir de amostras de vírus heterólogos testados (vírus da doença de Newcastle, metapneumovírus aviário, reovírus e vírus da doença de gumboro), nem de estirpes do VBI classificadas em outros genótipos.). Ademais, quando foram comparadas as técnicas BR-Nested-RT-PCR com a técnica universal de Nested-RT-PCR foram obtidas boa concordância (k = 0,67), sensibilidade relativa de 85,4% e especificidade relativa de 81,6% para a detecção direta e identificação de estirpes do genótipo BR em amostras de campo. Em conclusão, a técnica de BR-Nested-RT-PCR desenvolvida no presente estudo, oferece uma opção de menor custo e menor complexidade do que a técnica de RT-PCR em tempo real para detectar e diferenciar estirpes do genótipo BR-I do VBI, sem comprometer a especificidade ou a sensibilidade, tendo, assim, o potencial de viabilizar a adoção de meios mais efetivos para o diagnóstico direto de estirpes do genótipo BR-I do VBI em amostras colhidas de aves mantidas em criações comerciais. / Infectious bronchitis (IB) is an acute and highly contagious disease of birds. IB is caused by infectious bronchitis virus (IBV), which usually results in significant economic losses for poultry farms. The extensive genetic variation, especially in the hypervariable regions (HVRs) of the S1 gene, is one of the main characteristics of the evolution of IBV, and results in the appearance of several variants that require a molecular diagnosis which includes the detection of these new strains, such as Brazilian I genotype (BR-I), since the detection and identification of the causative agent are essential for the control of the disease. Therefore, the diagnostic methods used must be sensitive, specific and inexpensive. A Nested-RT-PCR (BR-Nested-RT-PCR) technique was developed and evaluated in this study using a set of primers designed for the HVR3 region of the S1 gene for the detection and identification of Brazilian genotype strains of IBV present in biological samples from birds and compared with universal Nested-RT-PCR using universal primers for the same region of the S1 gene. The results demonstrated that the BR-Nested-RT-PCR technique had a high sensitivity to detect IBV strains from BR-I genotype and did not generate amplified products from heterologous virus samples tested (Newcastle disease virus, avian metapneumovirus, Reovirus and Gumboro disease virus), neither from IBV strains of other genotypes. In addition, the comparison between BR-Nested-RT-PCR techniques with the universal Nested-RT-PCR technique revealed good agreement (k = 0.67), relative sensitivity of 85.4% and relative specificity of 81.6 % for the direct detection and identification of BR-I genotype strains in field samples. In conclusion, the BR-Nested-RT-PCR technique developed in the present study offers a lower cost and less complex option than the real-time RT-PCR technique to detect and differentiate strains of the BR-I genotype of IBV without compromising specificity or sensitivity, and has the potential to provide a more effective mean for the direct diagnosis of BR-I IBV strains in samples collected from birds reared in commercial flocks. / CNPq: 132790/2015-7

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_paula_finger.pdf: 729110 bytes, checksum: fe15bb22f0abb92bf1b2938fd6dcdfc9 (MD5) Previous issue date: 2011-12-19 / The chickens infectious bronchitis (IB) is a highly contagious viral disease which causes predominantly respiratory lesions manifested clinically and invariably by sneezing and tracheo-bronchial rales, which may lead to more severe signs, with a decrease in fertility and reduction of eggs production. The infectious bronchitis virus (IBV) encodes four major structural proteins: N (nucleocapsid protein), S (spike protein), E (envelope protein) and M (membrane protein) being the S protein is cleaved into S1 and S2. The 1 subunit (S1) is found exposed in the viral envelope, which makes it an important or main inducer of neutralizing antibodies against the IBV, the main target for the host s immune system. The variations in two regions of the envelope s S1 subunit, called hypervariables regions, may originate to new serotypes. The IBV s mutation and recombination capacity and the selection pressure exerted by the prolonged use of live vaccines contribute to the appearance of a wide variety of serotypes and subtypes of IBV. The objective of this study was to express, in Pichia pastoris, the gene that encodes the surface protein S1 of IBV strain M41 and, in Escherichia coli, to express the S1 of the synthetic gene designed from consensus sequences of national and international field samples, as an interesting alternative for the production of antigen that can be used for monitoring vaccination of birds and also an antigen that is suitable for the use in serological diagnostic. The cloning and expression of glycoprotein S1 in both heterologous expression systems was successfully performed. The process of expression using E. coli was simple and quick when compared to the use of P. pastoris. The P. pastoris was able to express the entire S1; however, it showed difficulty in secreting the glycoprotein. The results will be evaluated for use in immunodiagnostic kit for monitoring the disease in poultry, being more affordable than the ones existing currently. / A bronquite infecciosa das galinhas (IB) é uma enfermidade viral altamente contagiosa que causa predominantemente lesões respiratórias que se manifestam clinicamente e invariavelmente por espirros e estertores tráqueo-bronquiolares, podendo levar a sinais mais severos, com diminuição na fertilidade e redução da produção de ovos. O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) codifica quatro proteínas estruturais importantes: N (proteína do nucleocapsídeo), S (proteína de superfície), E (proteína do envelope) e M (proteína da membrana), sendo a proteína S subdividida em S1 e S2. A subunidade 1 (S1) encontra-se exposta no envelope viral, o que torna-a um importante, ou principal, indutor da produção de anticorpos neutralizantes frente ao IBV, sendo o principal alvo para o sistema imune do hospedeiro. As variações em duas regiões da subunidade S1 do envelope, chamadas regiões hipervariáveis, podem dar origem a novos sorotipos. A capacidade de mutação e recombinação de IBV e a pressão de seleção exercida pelo uso prolongado de vacinas vivas contribuem para o aparecimento de uma grande variedade de sorotipos e subtipos de IBV. O objetivo deste trabalho foi expressar em Pichia pastoris o gene que codifica a proteína de superfície S1 da estirpe M41 do IBV e, em Escherichia coli, expressar a S1 de um gene sintético elaborado a partir de sequências consenso de amostras de campo nacionais e internacionais, como uma alternativa interessante para a produção de antígeno que possa ser utilizado para monitoramento vacinal das aves e também um antígeno que seja adequado para utilização em diagnóstico sorológico. A clonagem e a expressão da glicoproteína S1 em ambos os sistemas heterólogos de expressão foi realizada com sucesso. O processo de expressão usando E. coli foi rápido e simples quando comparado ao uso da P. pastoris. A P. pastoris foi capaz de expressar a S1 inteira, porém, apresentou dificuldade em secretar a glicoproteína. Os resultados obtidos deverão ser avaliados para uso em Kit de imunodiagnóstico para monitoramento da enfermidade na avicultura, sendo de custo mais acessível do que os existentes no mercado.