En esta tesis se describe un estudio espectroelectroquímico in-situ de la adsorción y reactividad, sobre electrodos de oro, de pequeñas moléculas modelo derivadas de la urea (tiourea (TU) e hidroxiurea (HU)) y compuestos relacionados con las mismas (disulfuro de formamidina, (FDS)), cianato y ácido cianúrico (CYA)). La caracterización voltamperométrica del comportamiento de estas moléculas se complementó con el estudio mediante espectroscopía infrarroja in-situ (IRRAS y ATR-SEIRAS) y Raman (SERS). Además se realizaron cálculos teóricos (DFT) para interpretar los espectros de especies adsorbidas a partir de las geometrías optimizadas y las frecuencias armónicas correspondientes. El trabajo experimental se realizó principalmente con electrodos nanoestructurados de oro, comparando su comportamiento con el obtenido con electrodos monocristalinos Au(111) y Au(100). La caracterización microscópica, voltamperometrica y espectroscópica de los electrodos nanoestructurados de oro, preparados por evaporación térmica sobre sustratos de Si, ha mostrado para los mismos una orientación preferente (111). En el estudio del comportamiento de la tiourea, se ha demostrado la existencia de un proceso de adsorción irreversible de la misma a través del átomo de azufre, con el enlace C-S inclinado con respecto a la normal a la superficie. A potenciales suficientemente altos, la TU adsorbida se desprotona oxidativamente dando lugar a capas mixtas de TU y aniones tioureato, los cuales se enlazan de forma bidentada a través de átomo de azufre y el nitrógeno desprotonado de uno de los grupos amino. Este tipo de capas también puede formarse por disociación homolítica del FDS, producto de la oxidación de la TU. Los cálculos DFT para el FDS indican que esta especie se fisisorbe con una orientación paralela a la superficie de oro. La hidroxiurea presenta un perfil voltamperométrico de oxidación irreversible complejo sobre los electrodos de oro. Esto sugiere la existencia de procesos que involucran especies adsorbidas, con una rápida acumulación de las mismas y un bloqueo de sitios superficiales que produce la inhibición de la reacción de oxidación de HU. En los experimentos espectroscópicos se han detectado bandas asociadas a la formación de CO2, óxido nitroso y aniones cianato adsorbidos, los cuales podrían dar lugar a la formación de ácido isociánico al pH al que se realizan los experimentos. Se han detectado además otras especies adsorbidas que dan lugar a una estructura de bandas de absorción compleja entre 1300 y 1800 cm-1 en los espectros ATR-SEIRAS. Cálculos DFT han demostrado que no hay contribución de la propia HU a estas bandas, planteándose la presencia de otros adsorbatos que conservan el esqueleto NCN y que se forman en etapas sucesivas de desprotonación oxidativa. En particular, una banda alrededor de 1800 cm-1 podría estar relacionada con el grupo carbonilo de la nitrosoformamida, un intermedio propuesto para la oxidación química de la HU. Se ha realizado un estudio espectroelectroquímico paralelo del comportamiento en medio neutro de la adsorción, sobre electrodos de oro, de los aniones cianato. Se han obtenido perfiles voltamperométricos sobre superficies monocristalinas de oro que muestran procesos de adsorción/desorción reversibles con respecto al potencial. Los espectros IRRAS presentan bandas de adsorción en un amplio rango de frecuencias entre 2150 y 2250 cm-1 que, de acuerdo con los cálculos DFT, corresponden a aniones cianato adsorbidos a través de átomo de nitrógeno en una variedad de sitios de adsorción y con frecuencias que dependen de los acoplamientos entre especies adsorbidas que aumentan al hacerlo el grado de recubrimiento. La contribución de posibles formas protonadas (ácidos ciánico e isociánico) puede considerarse como despreciable ya que estas especies interaccionan muy débilmente con la superficie electródica. Por otra parte, experimentos con capas finas de oro en contacto con disoluciones neutras de cianato, muestran bandas adicionales entre 1300 y 1800 cm-1 en los espectros ATR-SEIRA que plantean la existencia de otras especies adsorbidas formadas a partir de cianato adsorbido. La observación de estas bandas en la región de los grupos carbonilo, sugiere la posibilidad de una proceso de trimerización del cianato adsorbido, vía su transformación en ácido isociánico, para formar el anión monocianurato adsorbido. Esta hipótesis se ve refrendada por los espectros obtenidos con los electrodos de capa fina de oro en disoluciones de ácido cianúrico, similares, salvo la banda del cianato adsorbido, a los que se obtienen en disoluciones de cianato, y por los cálculos DFT, que ratifican que el anión monocianurato se adsorbe con su plano molecular perpendicular a la superficie mientras que el ácido cianúrico lo haría de forma paralela a la superficie de Au(111).

Cette thèse concerne le développement d’approches spectroscopiques infrarouge et Raman exaltées de surface: la spectroscopie infrarouge exaltée de surface (SEIRAS) combinée avec une cellule de perfusion et la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) couplée avec l’électrochimie. Dans le cadre du premier projet, différentes protéines ont été étudiées : lactose perméase (LacY), complexe I et IM30. Nous avons déterminé le pKa de Glu325 dans LacY sauvage et dans différents mutants portant des mutations dans le centre actif de translocation des protons. Sauvage complexe I a été oxydé avec différents agents oxydants et réduit avec NADH. Spectres différentiels correspondants ont été analysés. Des changements conformationnels dans la protéine IM30, induits par la présence des ions Mg2+, ont été observés.Dans le cadre du deuxième projet, une cellule spectroélectrochimique contenant une grille d’or a été adaptée pour étudier des protéines redox actives. Cette grille d’or sert à la fois de substrat SERS et d’électrode de travail. Cyt c, Hb et Mb ont d'abord été utilisés pour valider la configuration, puis l'approche a été étendue pour étudier une protéine membranaire. / This thesis concerns the development of surface-enhanced infrared and Raman spectroscopic approaches: surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) combined with perfusion cell and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) combined with electrochemistry. Within the first project different proteins were studied: Lactose Permease (LacY), complex I and IM30.The pKa of Glu325 in LacY WT and in different mutants carrying mutations in the proton translocation active center was determined. WT complex I was oxidized with different oxidizing agents and reduced with NADH. Corresponding redox-induced conformational changes were studied. The evidence was given that Mg2+ ions induce conformational changes in the protein IM30.Within the second project the spectroelectrochemical cell containing gold grid electrode was adopted for the studies of redox active proteins. This gold grid serves both as working electrode and as SERS active substrate. First Cyt c, Hb and Mb were used to validate the setup and then the approach was extended to study a membrane protein.

Le domaine de la bioénérgétique traîte de la circulation et de la transformation de l’énergie dans et entre des organismes et leur environnement. Dans ce manuscrit de thèse, la respiration cellulaire et plus particulièrement la première enzyme de la chaîne respiratoire, la NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complexe I) ont été étudiées, dans l’objectif de clarifier sa fonction et son implication dans certaines maladies. Dans une première partie, la création d’une sonde impliquant l’enzyme immobilisée de façon biomimétique est décrite. La caractérisation de ce système est effectuée via spectroscopie infrarouge par exaltation de surface (SEIRAS) couplée à de l’électrochimie. Sa réponse à l’ajout de substrats et d’inhibiteurs est ensuite présentée. Dans une seconde partie, l’interaction du Complexe I avec des lipides et des inhibiteurs (Zn2+ et NADH-OH) ainsi que le rôle d’une Tyrosine située au site de fixation du NADH ont été étudiés par spectroscopies IR et UV-Vis différentielles induites par électrochimie. L’exploration des résultats obtenus sous un angle structural a finalement permis de proposer un modèle pour le mécanisme de couplage entre la réduction d’ubiquinone et le pompage de protons par le Complexe I. / The field of bioenergetics deals with the flow and transformation of energy within and between living organisms and their environment. The work presented in this thesis report focuses on cellular respiration and more specifically on the first enzyme of the respiratory chain, NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I). This was done to clarify details about its function and its implication in disease. First, the creation of a sensor involving the biomimetically immobilized enzyme is presented and probed through a combination of surface enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) and electrochemistry. This sensor is then tested against different substrates and inhibitors. In a second part, the interaction of Complex I with lipids, inhibitors (Zn2+ and NADH-OH) and the role of a Tyrosine residue situated in the NADH binding pocket are investigated through electrochemically induced UV-Vis and FTIR difference spectroscopies. The results gathered through these experiments are then explored under a structural perspective and a coupling mechanism between quinone reduction and proton translocation by Complex I is proposed.

The field of bioenergetics deals with the flow and transformation of energy within and between living organisms and their environment. The work presented in this thesis report focuses on cellular respiration and more specifically on the first enzyme of the respiratory chain, NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I). This was done to clarify details about its function and its implication in disease. First, the creation of a sensor involving the biomimetically immobilized enzyme is presented and probed through a combination of surface enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) and electrochemistry. This sensor is then tested against different substrates and inhibitors. In a second part, the interaction of Complex I with lipids, inhibitors (Zn2+ and NADH-OH) and the role of a Tyrosine residue situated in the NADH binding pocket are investigated through electrochemically induced UV-Vis and FTIR difference spectroscopies. The results gathered through these experiments are then explored under a structural perspective and a coupling mechanism between quinone reduction and proton translocation by Complex I is proposed.

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