Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T02:12:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JoseAntonioda_D.pdf: 21581539 bytes, checksum: 099864fc5149a9352616af17207c291d (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As técnicas utilizadas no esclarecimento de estruturas macromoleculares estão situadas em campos interdisciplinares, onde os pesquisadores encontram-se unidos por um interesse comum, no sentido de detalhar o entendimento da função biológica e a relação com sua estrutura primária e tridimensional. Os inibidores de sementes de leguminosas são encontrados sob várias isoformas. Alguns métodos, como a espectrometria de massas, determinação da seqüência Nterminal e eletroforese bidimensional, vêm sendo amplamente explorados com o propósito de caracterizar melhor as isoformas presentes em sementes. A eletroforese bidimensional do inibidor de tripsina de Copaíba (CTI) revelou a presença de vários spots na faixa de 11 e 9 kDa. CTI foi resolvido em dois picos (CTI-I e CTI-II) quando submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18 em sistema HPLC. Esses picos distintos foram submetidos à eletroforese bidimensional sendo três spots observados para CTI-I com pl de 8.0, 8.5 e 9.0 e três spots para CTI-II com pl de 4.7, 4.6 e 4.3. A análise por espectrometria de massa foi realizada para as subunidades CTI-I e CTI-II objetivando determinar as massas moleculares acuradas e prováveis números de isoformas para cada subunidade. Os espectros confirmaram uma heterogeneidade para CTI-I e CTI-II com predominância dos picos de massa 10.719 e 8.244, respectivamente. A impossibilidade em seqüenciar todos os spots para cada subunidade de CTI, norteou a escolha dos spots A e F de forma continuar os estudos de sequenciamento. Os spots A e F foram submetidos a digestões enzimáticas com as proteases tripsina, SV8 e clostripaína. A massa exata dos peptídeos de cada digesto foi determinada por espectrometria de massas utilizando MALDI- TOF. Os peptídeos mais intensos foram purificados e seqüenciados em um HPLC capilar acoplado ao espectrômetro de massas ESI QTOF. A estrutura primária final de CTI, determinada a partir da massa dos peptídeos das digestões enzimáticas e da seqüência obtida por espectrometria de massas indicou 182 resíduos de aminoácidos, apresentando elevado grau de homologia em relação a outros inibidores de tripsina do tipo Kunitz de vegetais; inclusive com o resíduo de arginina na posição do sítio reativo. A estrutura cristalográfica CTI foi resolvida, revelando que este inibidor é composto por duas cadeias polipeptídicas não covalentemente ligadas e possui apenas uma ponte dissulfeto. t de as diferenças estruturais, CTI é um inibidor efetivo de tripsina com uma constante de dissociação de 1,2 nM, da mesma ordem de grandeza que os inibidores padrões como STI, ETI ou WCI. Sua estrutura tridimensional revela que isso se deve ao fato de que as discrepâncias estruturais não afetam a conformação canônica do seu loop reativo. A comparação entre a seqüência deduzida dos mapas experimentais da densidade eletrônica e a seqüência determinada por 2D-PAGE e espectrometria de massas MALDI-TOF e ESI-QTOF, mostra um acordo de aproximadamente 75%, que pode ser devido à presença de várias isoformas que é um aspecto comum das proteínas extraídas de sementes. Experimentos objetivando a determinação dos residuos de aminoácidos importantes na atividade inibitória de CTI foram realizados utilizando reagentes modificadores específicos. O inibidor CTI foi inativado em 48 e 81% por EDC e PGO, respectivamente. Esses compostos atuam em grupos carboxila de Asp e Glu (EDC) e resíduos de arginina (PGO) , indicando funcionalmente a importância do resíduo de arginina na interação do inibidor com a protease. Estudos da estabilidade conformacional em diferentes pHs, temperaturas e agentes caotrópicos fomecem importantes informações sobre a biogênese e estrutura das proteínas. Um estudo verificando o efeito de agentes físico-químicos (pH, temperatura, DTT, uréia e cIoreto de guanidina) na estabilidade conformacional do inibidor de tripsina (CTI) purificado de sementes de Copaifera langsdorffii foi realizado. CTI, um inibidor atípico da família Kunitz, demonstrou ser resistente em sua estabilidade funcional, apesar de sofrer prejuízos na estrutura quatemária após redução em 1 mM DTT como evidenciado por SDS-PAGE, gel filtração em protein-pack, experimentos cinéticos, espectros de fluorescência e de dicroísmo circular. Os experimentos de desnaturação em função dos agentes caotrópicos foram monitorados pela intensidade de fluorescência dos resíduos de triptofano. A desnaturação de CTI na presença de agentes caotrópicos mostrou ser um processo reversível após diálise, para estrutura e função no caso da uréia e do cloreto de guanidina. Os resultados indicaram que a desnaturação de CTI envolve pelo menos dois estágios: nativo e desnaturado. A presença de 3.5 M de uréia ou GdnHCI inibiu 50% e 100% da atividade inibitória, respectivamente. Ambos agentes caotrópicos promoveram um deslocamento do centro de massa. O cálculo da estabilidade conformacional AG (H20) foi feito tomando-se o deslocamento nos comprimentos de onda máxima de emissão de fluorescência como parâmetro. O AG (H2O) em função da concentração de uréia e guanidina foi de 63.0 e 54.0 Kcal mol-1, respectivamente. Os cálculos de centro de massa foram tomados em função da concentração do agente desnaturante em ambos os casos / Abstract: The techniques used in the clarification of macromolecular structures are situated in interdisciplinary fields, where the researchers find themselves united by a common interest in detailing the agreement of the biological function and the relation with its primary and threedimensional structure. The inhibitors of leguminous seeds are found under severa I isoforms. Some methods, as the mass spectrometry, determination of the N-terminal sequence and bidimensional electrophoresis have been widely explored with the purpose of better characterizing these isoforms in seeds. The bidimensional electrophoresis of the Copaiba trypsin inhibitor (CTI) disclosed to the presence of several spots in the 9 and 11 kDa. CTI was resolved in two peaks (CTI-I and CTI-II) when submitted to the reverse phase chromatography in C18 column in HPLC system. These distinct peaks had been submitted to bidimensional electrophorese, 3 spots had been observed for CTI-I with pl of 8.0, 8.5 and 9.0 and three spots for CTI-II with pl of 4.7, 4.6 and 4.3. The analysis for mass spectrometry was carried through for subunits CTI-I and CTI-II objectifying to determine the accurate molecular masses and probable numbers of isoforms for each subunit. The specters had respectively confirmed microheterogeneity for CTI-I and CTI-II with predominance ofthe peaks ofmass 10,719 and 8,244, respectively. The impossibility to sequence ali spots for each subunit of CTI guided the choice of spots more intense (A and F) to continue the sequence studies. Spots A and F had been submitted to the enzymatic digestions with proteases trypsin, SV8 and clostripain. The accurate mass of the peptide of each digest was determined by mass spectrometry using MALDI-TOF MS. The most intense peptides were been purified and sequenced in a LC connected to the spectrometer of mass ESI QTOF. The primary structure of CTI, determined trom the mass of the peptide of the enzymatic digestions and the sequence gotten for mass spectrometry indicated 182 residues of amino acids, presenting a raised degree of similarity to other Kunitz-type inhibitors of the plant, also with the residue of arginine in the position of the reactive site. The crystallographic structure of CTI inhibitor was solved and reveals that, CTI is composed by two non-covalently bound polypeptide chains and only one disulfide bridge. In spite of these structural differences, CTI is an effective trypsin inhibitor with a dissociation constant of 1.2 nM, a value comparable to other standard Kunitz-type inhibitors like STI, ETI or WCI. It three-dimensional structure reveals that this is because the structural discrepancies do not affect the canonical conformation of reactive loop of CTI. The comparison between the sequence deduced from the experimental electron density maps and the sequence determined using 2D-PAGE, MALDI- TOF and ESI-QTOF mass spectrometry shows an agreernent of about 75%, which can be due to the presence of various isoforms that is a common aspect of proteins extracted trom seeds. Experiments objectifying the determination of the important amino acid residues in the inhibitory activity of the CTI were perfomed using specific modifying reagents. The CTI inhibitor was inactivated in 48 and 81% for EDC and PGO, respectively. These composites act in carboxyl group of Asp and Glu (EDC) and residues of arginine (PGO), indicating functionally the importance of the arginine residue in the interaction of inhibitor with protease. Studies of the conformacional stability in different pHs, temperatures and chaotropic agents have given a wealth of information on the structure and biogenesis of proteins. A study verifying the effect of physico-chemical agents (pH, temperature, DTT, urea and guanidine hydrochloride) in the conformacional stability of trypsin inhibitor (CTI) purified trom seeds trom Copaifera langsdorffii was carried through. CTI an atypical inhibitor of the Kunitz family demonstrated to be resistant in its functional stability, although suffering trom damages in the quatemary structure with reduction in 1 mM DTT as evidenced for SDS-PAGE, gel filtration in protein-pack, kinetic experiments, spectrum of fluorescence and circular dichroism. The denaturation experiments in function of the chaotropic agents were monitored by the intensity of the fluorescence of tryptofan residues. The CTI denaturation in the presence of chaotropic agents showed to be a reversible process after dialysis, for structure and function in the case of the urea and guanidine chloride. The results had indicated that the denaturation of CTI involves at least two steps: native and denatured. The presence of 3.5 M of urea or GdnHCI inhibited 50% and 100% of the inhibitory activity, respectively. 80th chaotropic agents had promoted a displacernent of the mass center. The conformational stability calculations dG (H2O) were made by taking the wavelengths corresponding to the maximum fluorescence emission as a pararneter. The dG (H2O) value in function of the concentration of urea and guanidine chloride were 63,0 and 54,0 Kcal mol-1, respectively. The calculations of center of mass were taken as a function of the denaturating agent concentration in both cases / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Gil Eduardo Serra, Marcos Silveira Buckeridge / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-23T11:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Panegassi_ValeriaRegina_M.pdf: 4872944 bytes, checksum: 843d64597cb44d77f72603fdf6c6237a (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: As sementes de faveiro (Dimorphandra mollis) utilizadas neste trabalho foram obtidas na caatinga do Estado do Piauí. Estas sementes foram imersas em solução de NaOH 5% a 100ÜC durante 20mín, seguida de lavagem do material em água corrente, a fim de separar casca do endosperma mais embrião, O material seco sem casca foi triturado e posteriormente peneirado e separado em diferentes frações. As amostras de sementes trituradas com e sem casca e as amostras de suas frações retidas na peneira com 420µm de abertura foram submetidos à análises de composição incluindo teor de galactomanano, proteínas, cinzas, fibra bruta e lipídios. A partir de análises do extrato aquoso de galactomanano hidrolisado foi determinada a composição monossacarídica das frações separadas por peneiramento a fim de avaliar a razão manose;gafactose do poiissacarideo, que apresentou ser em torno de 2,4:1. A fração que apresentou maior rendimento foi aquela separada em peneira com 420^m de abertura. Com esta fração foram feitos ensaios iniciais de toxicidade em camundongos, e foi classificado como Praticamente Atóxico. Amostras da mesma fração foram submetidas a análise reométrica em reômetro HAAKE (Modelo Rotovisco RV20), variando a concentração do galactomanano disperso em água, temperatura, pH, concentração de NaCI e de sacarose, mostrando que a amostra tem comportamento não-newtoniano e pseudoplástico. A partir destas análises foi observada a estabilidade da viscosidade aparente com variação da concentração de NaCI e em pH variando entre 4,0 e 7,0. Também foi observado que a adição de sacarose à dispersão pode ocasionar um acréscimo na viscosidade e, o aumento da temperatura da dispersão ocasiona um decréscimo na viscosidade. A amostra também foi misturada com goma xantana (1:1) e foi observada a formação de gel. A mesma mistura apresentou um aumento significativo na viscosidade, quando comparada à viscosidade apresentada peias dispersões dos polissacarídeos separadamente / Abstract: The seeds of faveiro (Dimorphandra mollis) were obtained in the stunted vegetation of the brazilian State of Piauí. These seeds were immersed in a solution of NaOH 5% at 100°C during 20min, followed by washing the materia! in running water, to separate the skin from the endosperm plus embryo. The dry decoated materia! Was ground and later sifted and separated into different fractions. The samples of ground seeds and the fraction left on the 420pm sifter were subjected to composition analyses, including the galactomannan, protein, ash, raw fiber, and lipid contents. From the analyses of the hydrolyzed galactomannan, the monosaccharide composition was obtained by HPLC analysis of the samples obtained in the left fractionating, in order to evaluate the mannose:galactose ratio of the polysaccharide, which proved to be 2.4:1. The fraction with the largest production was obtained in the sifter with 420µm. With this fraction, primary toxicity tests were performed on mice, reaching the classification of Basically Non-toxic. Samples from the same fraction were analysed in a HAAKE RV20 rheometer, with variation of the concentration of galactomannan dispersed in water, temperature, pH, sucrose and NaCI, demonstrating that the sample had a non-newtonian pseudoplastic behavior. From these analyses, the stability of viscosity was observed in the presence of NaCI and pH varying from 4.0 to 7.0. The viscosity decreased in higher temperature and can increase in the presence of sucrose solutions. The sample was also mixed with xantan (1:1) for the observation of gel formation. The same mixture showed a significant increase in viscosity, when compared to the viscosity shown by the dispersions of the polysaccharides separately / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Marcos Silveira Buckeridge / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T01:56:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Potomati_Adriana_M.pdf: 3844525 bytes, checksum: a4265df5110a1f434b5ef1ef7a4e4852 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Galactomananos são polissacarídeos de reserva da parede celular, compostos por uma cadeia principal de manoses P-(1_4), com ramificações simples de galactose, ligadas 0:-(1 _6) à cadeia principal. São compostos típicos de sementes em espécies da família Leguminosae e os estudos feitos até o momento indicam que este seja uma molécula bifuncional, exercendo um papel no controle da embebição no início da germinação e posteriormente servindo como reserva de carbono para o crescimento inicial da plântula. As sementes de Sesbania marginata (Leguminosae-Faboideae) acumulam galactomanano no endosperma (21 % da massa de matéria seca da semente), o qual é completamente degradado após a germinação, por ação de três enzimas: 0:galactosidase, endo-p-mananase, e exo-p-mananase (ou p-manosidase). Os produtos da degradação são transferidos para os cotilédones e eixo embrionário em crescimento, acumulando amido, que é posteriormente degradado ao longo do crescimento da plântula. No presente traballho foi verificado que o ácido abscísico (ABA 10-4M) é capaz de retardar a germinação das sementes de S.marginata e inibir significativamente o crescimento do embrião. O acompanhamento das variações das massas fresca e seca mostrou que o ABA tem um efeito transitório na massa seca, apresentando um efeito drástico no ganho de massa fresca, sugerindo que sua ação seja na absorção de água pelo embrião em crescimento. Um efeito parcial do ABA foi verificado sobre a degradação do galactomanano, sendo este efeito também caracterizado pela inibição do aumento na atividade de uma das enzimas de degradação, a 0:galactosidase. Em experimentos em que o ABA foi aplicado antes e/ou depois da protrusão da radícula (que sinaliza o início da degradação do galactomanano) foi verificado que o hormônio tem efeito sobre a degradação do galactomanano principalmente quando aplicado antes da protusão da radícula ou durante as 144h do experimento e menor quando aplicado depois da protusão da radícula. Os efeitos sobre a massa fresca do embrião foram idênticos em intensidade aos observados para o endosperma. No entanto, não houve efeito sobre a massa seca do embrião. Quando endosperma e embrião foram isolados e tratados de forma similar, observou-se efeito do ABA sobre a degradação do galactomanano nas condições experimentais, mas sobre massa fresca do embrião o efeito só foi verificado quando o ABA foi mantido durante 144h e não houve qualquer efeito sobre a massa seca. Como ocorreu uma grande diferença em massa do embrião, quando o endosperma foi retirado, conclui-se que o galactomanano funciona mais como uma reserva de água que de carbono para o embrião e que o efeito do ABA parece ser principalmente na degradação do galactomanano, com consequências para o embrião. Assim, o ABA atua mais como um modulador que como inibidor do processo de degradação de reservas e seu aproveitamento pelo embrião em crescimento / Abstract: Galactomannans are storage cell wall polysaccahrides found In endospermic seeds of legumes. They are thought to be storage polymers, since it has been observed for a few species (among them Sesbania marginata) that it is completely broken down after germination and its products are transferred to the growing embryo. We examined the effect of ABA (10-4M abscisic acid) on the degradation of galactomannan in isolated endosperms and intact seeds of S.marginata. We found that after seed germination the initial embryo growth was retarded by ABA. Ultrastructural analysis showed that the embryo is completely surrounded by an endosperm which displays very thick galactomannan containing cell walls. Although an inhibitory effect has been observed on the increase of fresh weight of the embryo, the effect of ABA on the dry weight was weaker and transítory (from 48 to 96h). Endosperm dry weight and galactomannan degradation were significantly inhibited and the activity of a-galactosidase was strongly inhibited by ABA. The addition of ABA before and/or after mobilisatíon ín íntact seeds or isolated endosperm, showed that whereas addítion of ABA before mobilisation did not affect dry weight decrease in intact seeds, it was strongly affected in isolated endosperms. On the other hand, whereas ABA affected embryo fresh weight íncrease in intact seeds, but not in isolated embryos, no significant effect was observed on dry weight. This results suggest that ABA affects galactomannan degradation and by doing 50, prevents water absorption by the embryo, rather than affect its dry weight. As ABA has been detected in the endosperm os seeds of S.marginata, it ís proposed that it probably acts as a modulator of galactomannan mobilisation and consequently sinchronises it with early growth of the embryo / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular

Orientador: Sylvio Luis Honorio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-26T06:41:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Linares_JussaraBerthoFantinatti_M.pdf: 382992 bytes, checksum: be93e67d3f02ae20ea77d906dae46632 (MD5) Previous issue date: 1999 / Mestrado

Orientador : Luiz Fernandes Razera / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-27T23:40:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ticelli_Marcelo_M.pdf: 424261 bytes, checksum: 617246353394c59b237e6363969b1816 (MD5) Previous issue date: 2001 / Mestrado

Orientador: Angelo Luis Cortelazzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T14:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bordignon_MartaVanise_M.pdf: 14114031 bytes, checksum: e474fe13b032d52c696b039462d1fb17 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: No presente trabalho, foram utilizadas sementes de Eugenia uniflora (pitanga) e Campomanesia xanthocarpa (guabiroba), coletadas em matas nativas do município de Carazinho - RS, e armazenadas em vidros a 4°C. As sementes quiescentes foram colocadas para germinar e caracterizadas citoquímica e bioquimicamente quanto as suas principais reservas. A cada quinze dias foram realizados novos testes de germinação, com respectivo processamento do material para análises microscópicas e dosagens das reservas. Sementes de E. uniflora permaneceram viáveis durante todo o período analisado (105 dias), mantendo índices de germinação superiores a 70%. C. xanthocarpa apresentou-se viável apenas nos primeiros quinze dias, indicando característica fortemente recalcitrante. As duas espécies apresentaram-se com mais de 40% de umidade em seus frutos maduros. Para a pitanga elas têm massa 3 vezes maior do que para guabiroba e tem como principal reserva o amido (36%), seguido de proteínas (20%). Nesta última ocorre praticamente o inverso, com proteínas representando mais de 37% da matéria seca e quantidades consideráveis de carboidratos (18%). Os resultados indicaram ainda um elevado teor lipídico nas sementes de guabiroba. Em nível celular, as principais alterações observadas em guabiroba durante a perda de viabilidade foram devidas à fusão do material protéico e aumento do poder redutor do material fenólico presente nas células cotiledonares. Em pitanga, apesar de não ter havido perda de viabilidade, observou-se uma diminuição significativa dos grãos de amido e maior reatividade do material protéico ao longo do tempo de estocagem decorrente de um aumento na disponibilidade de radicais amina. Verificou-se ainda um aumento significativo no conteúdo de açúcares livres e solúveis, provavelmente decorrente da hidrólise do amido presente nas células das sementes de pitanga. Em termos comparativos, além das características apontadas, foi observada uma maior disponibilidade de material péctico nas paredes celulares das sementes de guabiroba / Abstract: Seeds of Eugenia uniflora (pitanga) and Campomanesia xanthocarpa (guabiroba) were colected in native forest of district Carazinho - RS, and stored in glass at 4°C. Germination tests of quiescent seeds were carried out every 15 days. The viability of E. uniflora continued for the investigation period of 105 days, with germination index above 70%, while in C. xanthocarpa the viability was 15 days, characteristic of recalcitrant seeds. Moisture content of seeds was mainteinad around 40% in mature fruits. The main storage component of pitanga is starch (36%). Another important reserve is protein (20%), while guabiroba presents more than 37% of their fresh weight in proteins and considerable quantity of carbohydrates (18%). These seeds contain high lipid content. The cellular alterations of guabiroba during the loss of viability were the fusion of protein material and increase the reductibility of phenolic material present in cotyledon cells. Pitanga with continued viability, showed a significant reduction of starch grains and increase of protein reativity during storage.An increase in free and soluble sugar was detected, as a result of the starch hydrolysis of pitanga cells. Wall cells of guabiroba seeds showed more disponibility of pectic material in pitanga / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador : Marcia Regina Braga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T13:38:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rahal_RodrigoLuis_M.pdf: 7301015 bytes, checksum: 9e19a74a6ceb4e3be5e79c3422aa0662 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Sesbania marginata Benth. é uma leguminosa tropical que acumula galactomanano nas paredes celulares espessadas do endosperma de suas sementes. Este polissacarídeo de reserva é formado por resíduos de D-manose, ligados entre si por ligações 13-1,4, formando uma cadeia principal linear, com resíduos de D-galactose unidos a esta através de ligações ((-1,6. Durante o processo de germinação, o galactomanano é completamente degradado e considerável quantidade de monossacarídeos e oligossacarídeos é produzida e translocada para o embrião em crescimento. Concomitantemente ao processo de germinação, há a produção de moléculas indutoras de fitoalexinas e a liberação de substâncias fungitóxicas para os exsudados das sementes. Neste trabalho, investigou-se a possibilidade de que oligossacarídeos provenientes da degradação do galactomanano possam induzir a produção de fitoalexinas em cotilédones de soja - material-teste utilizado para avaliar a atividade indutora - além de se analisar as substâncias fungitóxicas produzidas normalmente pelas sementes de S. marginata. Extratos de endospermas+testa do 4° ao 6° dias de germinação e de endospermas isolados no 1° e 5° dias de germinação mostraram-se mais eficazes na indução da síntese de fitoalexinas. O fracionamento em coluna de Bio Gel-P2 indicou que as moléculas ativas, presentes em algumas frações, eram compostas por dois resíduos de manose e um de galactose, possivelmente correspondentes a trissacarídeos resultantes da degradação do galactomanano. Os compostos fungitóxicos foram extraídos de exsudados de sementes e de sementes intactas após 48 horas de germinação. Pelo menos quatro substâncias fungitóxicas foram detectadas, sendo algumas delas já presentes em sementes quiescentes e outras encontradas após o 1 ° dia de germinação. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que, além de regular a embebição de água e servir de fonte de carbono para o embrião em crescimento, durante sua degradação, o galactomanano pode originar fragmentos que possivelmente ativam respostas de defesa em tecidos de sementes de S. marginata. A liberação desses fragmentos e a presença de substâncias fungitóxicas em exsudados da semente dessa espécie parecem estar intimamente relacionados ao metabolismo de seus carboidratos de reserva, permitindo que as sementes germinem e as plântulas se desenvolvam em um ambiente altamente competitivo / Abstract: Sesbania marginata Benth is a tropical legume that stores galactomannan in its thickened endospermic cell walls. These polysaccharides are composed of a linear backbone of 13-1,4- linked D-mannose residues to which D-galactose residues are attached by a-1,6 linkages. Following germination, the galactomannan is completely broken down producing considerable amounts of mono and oligosaccharides, which are transferred to the growing embryo. Concomitantly, phytoalexin-inducing molecules are produced and fungitoxic compounds are released from the germinating seeds. In the present work we investigated the possibility of some oligosaccharides generated during galactomanan degradation can induce phytoalexin production in soybean cotyledons - a test species used for assays of eliciting activity- and we extracted the fungitoxic compounds following germination. Extracts from endosperm+coat of 4-6 days of germination and from isolated endosperms of 1 and 5 days of germination were shown to be more effective in promoting phytoalexin production. Fractionation on Bio-Gel P2 column indicated that the active molecules found in some fractions are composed by two manosyl and one galactosyl residues, being a trissaccharide resultant of the galactomannan degradation. Fungitoxic compounds were extracted from seed exsudates and intact seeds after 48 h of germination. At least four fungitoxic substances were detected, some of them already present in quiescent seeds and other appearing after 1 day of germination. Our data suggest that besides playing a role in water imbibition and as a source of carbon for the embryo growth, galactomannans generate fragments that can signal plants to protect themselves by activating defense mechanisms in their tissues following germination. The release of these fragments and the presence of fungitoxic compounds in seeds of S. marginata seem to be closely related to their carbohydrate storage metabolism, allowing these seeds to germinate and the seedlings to develop in a highly competitive environment / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular

Orientadores: Sergio Marangoni, Maria Ligoa Rodrigues Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:08:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_SilvanaCristina_D.pdf: 10029993 bytes, checksum: ad9db9a8d51acb16d319ba5e9f510538 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Os objetivos deste trabalho foram purificar e caracterizar bioquimicamente uma lectina e determinar a estrutura primária de um inibidor de serinoproteinases tipo Kunitz de sementes da espécie D. regia (Leguminosae-Caesalpinioideae) e também verificar o efeito in vitro do inibidor sobre a atividade das enzimas digestivas dos insetos lepidópteros A. kuehniella e C. cephalonica. Para a purificação da lectina e do inibidor de serinoproteinases, as sementes foram trituradas e a farinha foi submetida a uma extração salina 10%. Após centrifugação, o sobrenadante (extrato total) foi dialisado, liofilizado e aplicado em colunas de exclusão molecular, troca iônica e coluna de fase reversa C18 em sistema de HPLC. As frações eluídas foram monitoradas a 280 nm de absorbância. A lectina e o inibidor purificados foram designados como DRL (Delonix regia lectin) e DrTI (Delonix regia trypsin inhibitor), respectivamente. Após a identificação e purificação, a lectina foi analisada em SDS-PAGE 12,5%, revelando que esta proteína tem massa molecular aparente de 12 kDa sob condições redutoras (DTT 0,1 M) e não redutoras. O gel nativo revelou que DRL é uma proteína constituída por apenas uma cadeia polipeptídica. Os testes de inibição da atividade hemaglutinante foram realizados com eritrócitos de ratos, utilizando-se os seguintes açúcares: D-glicose, D-glicosamina, D-frutose, D-manose, D-sacarose, D-galactose, D-galactosamina, D-rafinose, Dlactose e D-maltose e verificamos que a atividade hemaglutinante de DRL foi inibida mais especificamente por glicose a uma concentração de 0,048 mM, indicando que esta lectina pertence ao grupo glicose-manose. A composição de aminoácidos da lectina mostrou alto conteúdo de ácido aspártico, ácido glutâmico e glicina, mas nenhum resíduo de cisteína foi observado. A determinação da região N-terminal da lectina revelou alta homologia com outras lectinas de leguminosas tais como, con A, lentilha e ervilha. A faixa de pH para a atividade da lectina foi de 8-9 com perda total da sua atividade em faixa de pH ácido (2-4). Além disso, a lectina manteve sua atividade após tratamento térmico a 70°C, durante 30 minutos, com perda de 50% de sua atividade a 100°C. DRL não necessitou de cálcio para sua atividade, mas é dependente de manganês, sugerindo que DRL é uma metaloproteína. O tratamento de DRL com uréia resultou em perda total da AHE, enquanto que na presença do DTT, a lectina manteve sua atividade normal provavelmente devido à ausência de pontes dissulfeto na molécula. A determinação da estrutura primária do DrTI, comprovou que este inibidor pertence à família Kunitz de inibidores de proteinases. A região do sítio reativo possui um resíduo de ácido glutâmico ao invés de arginina ou lisina, mas a molécula apresentou dois "Ioops" compostos por quatro resíduos de cisteína com alta similaridade com outros inibidores tipo Kunitz. Os estudos de inibição in vitro mostraram que, numa concentração de apenas 5J.lg, o DrTI inibiu cerca de 92% da atividade das proteases dos insetos A. kuehniella e C. cepha/onica, indicando alta afinidade do inibidor por estas enzimas. A digestibilidade in vitro do DrTI pelas proteases dos insetos foi analisada em SDS-PAGE 12,5% e revelou que o inibidor foi resistente à proteólise após 72h. Entretanto, a incubação do DrTI com a tripsina bovina resultou em clivagem nos primeiros 30 minutos de reação. A atividade residual máxima do inibidor, após estes ensaios de digestibilidade pelas proteases de A. kuehniella, C. cephalonica e tripsina bovina foi de 69,5%, 64,9% e 34,57%, respectivamente / Abstract: The aims of this work were to purify and to characterize biochemically a lectin and to determine the primary structure of a Kunitz-type serineproteinase inhibitor from seeds of Delonix regia specie (Leguminosae-Caesalpinioideae) and also to verify the in vitro effect of the inhibitor towards to digestive enzymes activities of the lepidoptera insects A. kuehniella and C. cephalonica. For lectin and serine proteinase inhibitor purification, the seeds were tritured and the flour was submitted to saline extraction 10%. After centrifugation , the supernatant (total extract) was dialised, Iyophylized and applied in molecular exclusion, ion exchange and reverse phase C18 HPLC columns. The eluted fractions were monitored by absorbance at 280 nm. The lectin and the inhibitor purified were designated DRL (Delonix regia lectin) and DrTI (Delonix regia trypsin inhibitor), respectively. After identification and purification, the lectin was analyzed in SDS-PAGE 12.5%, showing that this protein has an apparent molecular mass of 12 kDa under reduced (DTT 0.1 M) and non reduced conditions. Analysis of native gel revealed that DRL is a protein constituted by only one polypeptide chain. The inhibition tests of hemagglutinating activity were realized with rat erytrocytes, using the following sugars: D-glucose, D-glucosamine, D-fructose, Dmannose, D-sucrose, D-galactose, D-galactosamine, D-raffinose, D-Iactose and Dmaltose and we verified that hemagglutinating activity of DRL was more specifically inhibited by glucose at 0.048 mM concentration, indicating this lectin belongs to the glucose-mannose group. The lectin aminoacid composition showed high content of aspartic acid, glutamic acid and glycine, but cysteine residue was not detected. The determination of the N-terminal region of the lectin revealed high homology with other leguminous lectins such as, con A, lentil and pea. The pH range for the lectin activity was 8-9 and DRL lost activity totally in range of acid pH (2-4). Furthermore, the lectin maintained activity after thermal treatment to 70°C, during 30 minutes, with lost of 50% in activity at 100°C. DRL does not require calcium for the activity but is manganese dependent, suggesting that DRL is a metalloprotein. The treatment of DRL with urea resulted in total lost of hemagglutinating activity, while in the presence of DTT, the lectin maintained normal activity probably due absence disulfide bridges in the molecule. The primary structure determination of DrTI, proved that this inhibitor belongs to the Kunitz family of proteinase inhibitors. The region of reactive site presented a glutamic acid residue instead of an arginine or Iysine, but the molecule presented two "loops", composed by four cysteine residues, with high similarity with other Kunitz type inhibitors. The in vitro inhibition studies with insect proteases from A. kuehniella and C. cephalonica showed at concentration of only 5mg, DrTI inhibited about of 92% of the proteases these insects, indicating high affinity of the inhibitor by these enzymes. In vitro digestibility of DrTI by insect proteases was analyzed in SDS-PAGE 12.5% and revealed that the inhibitor was resistant to the proteolysis after 72h. However, the incubation of DrTI with bovine trypsin resulted in cleavage in the first 30 minutes of reaction. The maximal residual activity of the inhibitor, after these digestibility assays by proteases from A. kuehniella, C. cephalonica and bovine trypsin was 69.5%, 64.9% and 34.57%, respectively / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Roberto Trigo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:09:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GuimaraesJunior_PauloRoberto_M.pdf: 3789804 bytes, checksum: 9b0f124ff4de38cd1150f8a53a219c00 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ecologia

Orientador: Paulo Sergio Moreira Carvalho de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T07:45:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pizo_MarcoAurelio_D.pdf: 5952785 bytes, checksum: e94ba01c80c8d632259f57abfb92dfd5 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: Este estudo trata das interações entre formigas e diásporos não-mirmecocóricos no chão de uma floresta Atlântica (Parque Estadual Intervales) no sudeste do Brasil. Conduzido entre abril de 1995 e junho de 1997, o estudo foi dividido em três partes que abordam as duas formas pelas quais os diásporos não-mirmecocóricos tomam-se disponiveis para as formigas que frequentam o chão da floresta: (1) caídos das árvores (Capítulos 1 e 2) e (2) contidos nas fezes de vertebrados frugívoros (Capítulo 3). O Capítulo 1 relata o levantamento das interações entre formigas e diásporos não-mirmecocóricos feito durante dois anos ao longo de um transecto de 5 km amostrado mensalmente. Um total de 886 interaçôes envolvendo 37 espécies de formigas e 56 diásporos foram registradas. O número de interações registrado mensalmente não esteve correlacionado nem com a temperatura média nem com a pluviosidade mensais que, no entanto, estiveram positivamente correlacionadas com o número de espécies de formigas registrado nas interações. Possíveis padrões de variação sazonal no uso de diásporos pelas formigas podem ter sido mascarados pelo uso constante deste recurso pelas duas espécies de formigas mais abundantes na área de estudo (uma Pheidole e uma Solenopsis), e pela frutificação massiça de algumas plantas cujos diásporos são especialmente atrativos para as formigas. No capítulo 2, seis plantas não-mirmecocóricas (Virqla oleifera, Eugenia stictosepala, Cabralea canjerana, Citharexylum myrianthum, Alchomea glandulosa e Hyeronima alchorneoides), cujos diásporos diferem em tamanho e conteúdo lipídico, foram selecionadas para a investigação de como estas características afetam a interação formiga-diásporo. As formigas rapidamente descobriram e limparam (i. e., removeram a polpa ou arilo) os diásporos colocados no chão da floresta. A taxa de recrutamento e a presença das formigas foi maior para os diásporos ricos em lipídeos do que para aqueles pobres em lipídeos. A taxa de remoção e a distância média de deslocamento foi maior para os diásporos pequenos. A formiga Ponerinae Pachycondyla striata, uma das que mais frequentemente explorou os diásporos ricos em lipídeos, transportou estes diásporos para seus ninhos e, posteriormente, abandonou-os limpos e intactos nos "depósitos de lixo" localizados fora dos ninhos. Testes de germinação com diásporos limpos e "não-limpos" revelaram que a remoção da polpa ou arilo aumenta o sucesso de germinação em Virola oleifera, Cabralea canjerana, Citharexylum myrianthum e Alchornea glandulosa. Um análise por cromatografia gasosa revelou que a composição de ácidos graxos dos arilos estudados era bastante semelhante à do elaiossomo de uma semente mirmecocórica típica (Ricinus communis), corroborando assim a hipótese de que alguns arilos e elaiossomos são estruturas quimicamente semelhantes. No Capítulo 3, a remoção por formigas de três espécies de sementes (Philodendron corcovadensis e P. apendiculatum - Araceae e Aechmea sp. - Bromeliaceae) naturalmente encontradas nas fezes de macacos-prego (Cebus apella) foi investigada no sub-bosque e em cinco clareiras. A variação na taxa de remoção entre as sementes pesquisadas, entre sub-bosque e clareiras e também entre as várias clareiras (que diferiam em tamanho e estágio sucessional), foi abordada. Dezessete espécies de formigas (4 subfamílias, 9 gêneros) foram registradas nas fezes, oito das quais removeram sementes. Após 24 h de exposição às formigas, 68 % das sementes foram removidas das porções experimentais de fezes que continham 15 sementes. A espécie de semente afetou a taxa de remoção tanto na comparação sub-bosque vs. clareiras quanto na comparação entre clareiras, enquanto o sítio de deposição das fezes não teve nenhum efeito. Estes resultados podem ser interpretados como consequência do efeito "igualador" que três espécies de formigas Myrmicinae (Pheidole spp.) tiveram sobre a remoção das sementes das fezes. Estas espécies foram responsáveis pela maior parte das interações formiga-semente observadas (77 % no sub-bosque e nas clareiras) e estão entre as mais abundantes formigas do chão da floresta tanto no sub-bosque quanto nas clareiras. Concluindo, interações entre formigas e diásporos não-mirmecocóricos encontrados no chão da floresta são comuns, especialmente em matas úmidas de baixada que combinam grande abundância de formigas com disponibilidade anual de diásporos. O tamanho e conteúdo lipídico dos diásporos são fatores determinantes para o resultado destas interações. Devido a grande abundância de formigas em florestas neotropicais, e a flexibilidade que algumas delas apresentam em relação ao gradiente microclimático que exploram, a remoção de sementes das fezes de vertebrados frugívoros é menos afetada pelas diferenças nas condições microclimáticas entre sub-bosque e clareiras do que pela espécie de semente envolvida / Abstract: This study investigates the interaction between ants and non-myrmecochorous diaspores in a lowland Atlantic rain forest (Parque Estadual Intervales) in southeast Brazil. The study, conducted between April 1995 and June 1997, was divided into three parts which explore both ways through which nonmyrmecochorous diaspores become available to litter-foraging ants: (1) falling from parent plants (Chapters 1 and 2), and (2) embedded in vertebrate frugivore feces (Chapter 3). Chapter 1 reports a survey of the ant-nonmyrmecochorous diaspore interactions carried out during two years along a 5-km transect sampled monthly. A total of 886 interactions involving 37 ant species and 56 different diaspores were recorded. No seasonal pattern of diaspore use by ants became clear. The monthly number of interactions was not significantly correlated either with rainfall or mean temperature. The number of ant species recorded in the interactions, however, was associated with these climatic parameters. Any seasonal pattern of diaspore use by the ant community may have been masked by the year-round use of diaspores by the two most common litter-foraging ant species in the study site (one Pheido/e and one So/enopsis), and by the massive and episodic fruiting of some plant species whose diaspores are especially attractive to ants. In Chapter 2, six nonmyrmecochorous plant species (Virola oleifera, Eugenia stictosepala, Cabralea canjerana, Citharexylum myrianthum. Alchornea g/andu/osa and Hyeronima alchorneoides) whose diaspores differ in size and lipid content were selected to investigate how these features affect the outcome of ant-diaspore interactions. Ants were in general rapid at discovering and cleaning the diaspores (Le., removal ofpulp or aril). Recruitment rate and ant attendance were higher for lipid-rich diaspores than for lipid-poor ones. Removal rate and displacement distance were higher for small diaspores. The large ponerine antPachycondyla striata, one of the most frequent attendants to lipid-rich arillate diaspores, transported the latter into their nests and discarded cleaned intact seeds on refuse piles outside the nest. Gennination tests with c1eaned and unc1eaned diaspores revealed that the removal of pulp or aril may increase germination success in Virola oleifera, Cabralea canjerana, Citharexylum myrianthum and A/chornea g/andu/osa. Gas chromatography analyses revealed a close similarity in the fatty acid composition of the arils of the lipid-rich diaspores and the elaiosome of a typical myrmecochorous seed (Ricinus communis), corroborating the suggestion that some arils and elaiosomes are chemically similar structures. In Chapter 3, the removal of three seed species-(Phi/odendron corcovadensis andP. apendicu/atumAraceae, and Aechmea sp. - Bromeliaceae) from the feces of Capuchin monkeys (Cebus ape//a) by ants in the understory and in five treefall gaps was investigated. I asked if seed removal varied among seed species, between understory and gaps, and also among gaps differing in size and age. Seventeen ant species (4 subfamilies, 9 genera) were recorded on the feces, eight of which were observed removing seeds. On average, 68 % of the seeds were removed from the feces portions containing 15 seeds each after 24 h. For both the understory vs. gap and the among-gap comparisons seed species significantly affected the proportion of seeds removed, while deposition site had no effect. These results can be interpreted as a consequence of the equalizing effect that three myrmicine ants (Pheidole spp.) had upon seed removal. These species were responsible for the bulk of ant-seed interactions observed (77 % in the both understory and gaps sites) and figure among the most abundant litter-foraging ants in the understory and gaps. In conc1usion, interactions between ants and fallen nonmyrmecochorous diaspores is common, especially in lowland rainforests where the abundance of ants is coupled with the year-round availability of fleshy diaspores. The size and the lipid-content of the diaspores are major determinants of the outcome of such interactions. Due to the high abundance of ants in neotropical forests, and the flexibility of some ant species in the microclimatic gradient they use, seed removal from vertebrate frugivore feces is likely to be less affected by differences in microclimatic conditions between understory and gaps than by the seed species involved. / Doutorado / Ecologia / Doutor em Ciências