Integrin-linked kinase (ILK) is an important mechanoreceptor that mediates many cellular signaling pathways. Its dysregulation causes dilated cardiomyopathy and other complications in the heart. Restoration of ILK improves cardiac function and survival, but the exact mechanism is unknown. Recent studies in our lab suggest that the cardioprotective properties of ILK may be related to its regulation of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA2a). The protein expressions of ILK and SERCA2a are positively correlated based on adenoviral transduction of ILK and siRNA targeting ILK in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. From analysis of their calcium transients, ILK transduction resulted in increased beat rate and faster calcium clearance while siRNA knockdown produced the opposite effect. The use of SERCA-specific inhibitor thapsigargin nullified the observed effects of ILK transduction. Based on these results, we conclude that ILK’s cardioprotective properties are partly related to improving calcium handling in cardiomyocytes through the regulation of SERCA2a.

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Die Herzinsuffizienz ist trotz zahlreicher Therapiemöglichkeiten immer noch eine der häufigsten chronischen Erkrankung und Todesursachen in westlichen Industrienationen. Eine zentrale Rolle in der Regulation der effizienten Herzkontraktion nimmt die zyklisches Adenosin-3’,5’-monophophat(cAMP)-Signalkaskade ein, wobei Veränderungen in der Kompartimentierung des sekundären Botenstoffes bisher nicht vollständig verstanden sind. Ziel dieser Studie war es deshalb Regulationsmechanismen des lokalen cAMP-Pools der Mikrodomäne der ATP-abhängigen Calciumpumpe 2a des sarkoplasmatischen und endoplasmatischen Retikulums (SERCA2a) in kardialen Mausmyozyten unter den pathologischen Rahmenbedingungen der Herzinsuffizienz zu untersuchen. Hierfür wurde ein post-Myokardinfarkt Mausmodell an einer transgene Mauslinie verwendet, die einen cAMP-abhängigen auf Förster-Resonanz-Energietransfer(FRET)-basierenden Biosensor, lokalisiert in der SERCA2a-Mikrodomäne, in vivo exprimiert. Mit Hilfe von Echtzeit-FRET-Messungen an frisch isolierten, lebenden Kardiomyozyten wurden die Beiträge der am Herzen relevanten Phosphodiesterase(PDE)-Familien zur Begrenzung des lokalen cAMP-Pools in der SERCA2a-Domäne 12 Wochen nach Myokardinfarkt gemessen und mit einer Kontrollgruppe (Sham) verglichen. Hierbei zeigte sich, dass in der Mikrodomäne sowohl unter Ruhebedingungen, als auch nach β-adrenerger Vorstimulation, eine signifikante Aktivitätsminderung der PDE4, verglichen mit der Sham-Gruppe, nachweisbar ist. Da dies mit Veränderungen im lokalen cAMP-Pool der die SERCA2a reguliert einhergeht, bietet diese Studie also eine interessante Grundlage für die weitere Untersuchung der im Krankheitsfall auftretenden Funktionsabweichungen.

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Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4217.pdf: 3961717 bytes, checksum: 3053793c39a626c9cf9d5fb8f9c0fa21 (MD5) Previous issue date: 2011-02-18 / Universidade Federal de Sao Carlos / The ventricular myocardial contractility of the matrinxã teleost, Brycon amazonicus, was analysed in previous experimentation with isometric multicellular preparations, in time effect and force-frequency relationship experiments, with and without exposure to the alkaloid ryanodine, a sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ release blocker. In this study, different methodological approaches were used, such as isometric stress (EI, mN.mm-2), that permitted to identify the sensitivity of the myocardium to ryanodine, with the majority contribution of Ca2+ from the SR. The use of time to peak tension and time to half relaxation parameters (TPT and THR, ms) were ineffective to evaluate the contraction and relaxation performances during time effect experiments. New approaches such as contraction rates and initial relaxation rates (TC and TIR, mN.mm-2.s-1) demonstrated directly the impairment of the myocardium exposed to ryanodine. The negative staircase effect, characteristic of the teleost s forcefrequency relationship was evidenced by EI. The maximum rates of contraction and maximum rates of relaxation (TMC and TMR, mN.mm-2.s-1) and the average rates of contraction and average rates of relaxation (TMedC and TMedR, mN.mm-2.s-1) showed the impairment of the myocardium contractility exposed to ryanodine as well as the low sensitivity of frequency increments on the contractility when considered the values of TPT and THR. The TMedC and TMedR values indicated a greater possibility of heart rate regulation than the TMC and TMR values, probably due to these estimates consider the amount of instantaneous rate changes of contraction wave on calculation instead of just one point on the curve. The cardiac pumping capacity (CBC, mN.mm2.min-1) showed that the optimal range of frequency for isometric contraction is narrow and that the myocardium of the species should be working on the limit at rest. The analyses of integral of isometric tension (ITI, mN.mm- 2.s), and integral of isometric tension per minute (ITIPM, mN.mm-2.min), showed that these were unsuitable indexes for the assessment of cardiac contractility in the way they were calculated, as inconsistent interpretations were generated, probably by using information from the curve of contraction irrelevant to the isometric preparation. The contractility index (IC, mN.mm-2) created in this work, suggested that the myocardium contractility of the species is more sensitive to increases in frequency. On the other hand, the contractility index per minute (ICPM, mN.mm-2) showed that the optimum range of frequencies for the B. amazonicus myocardial contraction can be much wider and could allow performance reserve, such as reported in other studies of cardiac function in teleosts. The protein expression of SERCA2a and phospholamban (PLB) were analysed by Western Blot technique and their expression supported the findings of the SR functionality. The comparative analysis of these proteins, using amino acid sequences available in public databases (GenBank and UniProt), revealed levels of similarity between the SERCA2a and PLB in fish and other vertebrates, strengthened the findings of studies with Western Blot experiments. Taken together, the results suggest that B. amazonicus myocardium is dependent on SR Ca2+ stores under physiological frequencies and, despite the negative staircase pattern, must possess a performance reserve at supraphysiologic frequencies. / A contratilidade do miocárdio ventricular do teleósteo matrinxã, Brycon amazonicus, foi analisada com dados de experimentos prévios, realizados com preparações isométricas multicelulares e protocolos de efeito do tempo e de relação forçafrequência, com e sem exposição ao alcalóide rianodina, bloqueador dos canais de liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático (RS). Nesse estudo foram utilizadas diferentes abordagens metodológicas de tratamento de dados, como o estresse isométrico (EI, mN.mm-2), a partir do qual foi possível identificar a sensibilidade do miocárdio à rianodina, com contribuição majoritária do Ca2+ proveniente do RS. A utilização dos tempos para o pico de tensão e para metade do relaxamento (TPT e THR, ms), se mostraram ineficazes para avaliar o desempenho da contração e relaxamento no experimento do efeito do tempo. Novas abordagens na análise dos dados, como a taxa de contração e taxa inicial de relaxamento (TC e TIR, mN.mm- 2.s-1) demonstraram explicitamente o comprometimento do miocárdio durante a exposição à rianodina. O efeito escada negativo, característico da relação forçafrequência de teleósteos foi evidenciado pelo EI. As taxas máximas de contração e de relaxamento (TMC e TMR, mN.mm-2.s-1) e as taxas médias de contração e de relaxamento (TMedC e TMedR, mN.mm-2.s-1) além de demonstrarem o comprometimento da contratilidade durante exposição à rianodina, indicaram que existe um menor comprometimento da tensão durante elevação da frequência, quando comparados aos valores de TPT e THR. A TMedC e a TMedR apresentaram resultados relacionados a uma frequência cardíaca com maior possibilidade de ajustes do que a TMC e a TMR, provavelmente por considerarem o conjunto de variação das taxas instantâneas da contração e não somente um único ponto da curva. A capacidade de bombeamento cardíaco (CBC, mN.mm-2.min-1) mostrou que a faixa ótima de frequência para contração isométrica é estreita e que o miocárdio da espécie deve estar trabalhando no limiar na condição de repouso. As análises da integral da tensão isométrica (ITI, mN.mm-2.s), e da integral da tensão isométrica por minuto (ITIPM, mN.mm-2.min) mostraram-se inapropriadas para a avaliação da contratilidade cardíaca pelo modo como foram calculadas, uma vez que geraram interpretações incoerentes, provavelmente por utilizarem informações da curva de contração irrelevantes para a preparação isométrica. O índice de contratilidade (IC, mN.mm-2) criado nesse trabalho, sugere que o miocárdio da espécie é mais sensível às elevações de frequência. Por outro lado, o índice de contratilidade por minuto (ICPM, mN.mm-2) mostrou que a faixa ótima de frequências para a contração cardíaca de B. amazonicus pode ser mais ampla, o que permitiria uma reserva de desempenho, assim como observado para outros teleósteos. A expressão das proteínas SERCA2a e fosfolambano (PLB) foram analisadas pela técnica de Western Blot e sua expressão reforçaram os achados de funcionalidade do RS. A análise comparativa dessas proteínas utilizando sequências de aminoácidos disponíveis em bancos de dados públicos (GenBank e UniProt) revelou os níveis de similaridade entre a SERCA2a e PLB de peixes e mamíferos, reforçando os achados dos estudos com Western Blot. Em conjunto, os dados sugerem que o miocárdio do B. amazonicus, apresenta uma nítida dependência do RS em frequências fisiológicas e, apesar de exibir um claro padrão escada negativo, deve apresentar uma reserva de desempenho para frequências suprafisiológicas.

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Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6572.pdf: 3046018 bytes, checksum: a72ab59cf0526c45a9dee765c02c9f7c (MD5) Previous issue date: 2014-12-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / The Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA), phospholamban (PLB) and the Na+-Ca2+ exchanger (NCX) proteins are essential for the cardiac calcium management and myocardial contractility in vertebrates. The increase in metabolic rate generated from mechanical and physiological process of digestion is known as specific dynamic action (SDA) and represents the energy cost of processing, digestion and absorption of food. In several groups of reptiles, feeding generates a rapid increase in rates of gas exchange, whose peak usually occurs one or two days after feeding, before suffering a slower decline and returning to preprandial values. Ingestion of large quantity of food demands a metabolic elevation and leads to indemnities related in ventricular mass and an increase in myocardial force contraction, avoiding an overload on the cardiovascular system. During the fasting, depletion of body mass occurs and it can also reach the heart muscle. To describe the importance and the changes in SERCA2, PLB and NCX proteins on the effects of feeding/digestion in reptiles broad-snouted caiman (Caiman latirostris), burmese phyton (Python molurus) and also by prolonged fasting in South-American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus) Western blotting technique was used. We observed the homology existence between the proteins of reptiles in relation to mammals. The SDA increased expression of SERCA2 protein in three species of reptiles. The SDA can also have unduced the expression of an isoform and/or reduced phosphorylation at some active sites of SERCA2 in ventricular tissue of P. molurus. A direct relationship between the expression of SERCA2 with the PLB expression in C. durissus was observed. However in P. molurus and C. latirostris this relation does not exist. The three reptiles expressed the PLB with molecular mass of 50 kDa, whereas the mouse expressed 25 kDa. The vast evolutionary distance that separates mammals of reptiles may have caused the rise of isoforms between these groups, explaining this difference. The increased expression of NCX along with lower expression of SERCA2 and PLB in C. durissus in food group Fasting compared to the other two groups suggests a higher calcium mobilization in this feeding regime, which would be advantageous from the energy point of view. The expression of NCX with different molecular mass between the three species, a smaller number of consensus regions with the animals phylogenetically more distant and the great plasticity of NCX gene to form distinct proteins, suggest the expression of proteins isoforms with the reptiles studied in this research. / As proteínas Ca2+-ATPase do Retículo Sarcoplasmático (SERCA2), Fosfolambam (PLB) e o Trocador Na+/Ca2+ (NCX) são fundamentais para o manejo do cálcio e a contratilidade miocárdica nos vertebrados. A elevação da taxa metabólica gerada a partir dos processos mecânicos e fisiológicos da digestão é conhecida como "ação dinâmica específica" (SDA) e representa o custo energético do processamento, digestão e absorção dos alimentos. Em vários grupos de répteis, a alimentação gera um rápido aumento nas taxas de troca gasosa, cujo pico ocorre geralmente um dia ou dois após a alimentação, antes de sofrer um declínio mais lento e retornar aos valores pré-prandiais. A ingestão de grandes massas de alimento demanda uma elevação metabólica e leva a uma compensação na massa ventricular e um aumento na força de contração do miocárdio, evitando uma sobrecarga no sistema cardiovascular. Durante o jejum ocorre depleção da estrutura corpórea podendo também atingir o músculo cardíaco. Para descrever a importância e as mudanças nas proteínas SERCA2, PLB e NCX diante os efeitos da alimentação/digestão nos répteis cascavel sul-americana (Crotalus durissus terrificus), na píton (Python molurus) e também do jejum prolongado no jacaré-de-papo-amarelo (Caiman latirostris), utilizada a técnica molecular Western blotting. Observou-se a existência de homologia entre as proteínas dos répteis com relação aos mamíferos. A SDA levou a uma maior expressão da proteína SERCA2 nas três espécies de répteis. A SDA também pode ter induzido a expressão de uma isoforma e/ou uma menor fosforilação em alguns sítios ativos da SERCA2 no tecido ventricular de P. molurus. Uma relação direta entre a expressão da SERCA2 com a expressão do PLB foi verificada somente em C. durissus, não havendo tal relação em P. molurus e C. latirostris. As três espécies de répteis expressaram o PLB com mesma massa molecular, de 50 kDa, e diferente da do rato, que é de 25 kDa. A grande distância evolutiva que separa os répteis dos mamíferos pode ter ocasionado o surgimento de isoformas entre esses grupos, explicando tal diferença. O aumento da expressão do NCX em C. latirostris do grupo alimentar Digestão sugere uma maior mobilização do cálcio e um maior inotropismo de forma frequência-específica através dessa proteína. A maior expressão do NCX juntamente com a menor expressão da SERCA2 e do PLB em C. durissus no grupo alimentar Jejum em relação aos outros dois grupos alimentares sugere uma maior mobilização do cálcio pelo NCX nesse regime de alimentação, o que seria vantajoso do ponto de vista energético. A expressão do NCX com diferentes massas moleculares entre as três espécies estudadas, um menor número de regiões conservadas em animais filogeneticamente mais distantes, e a grande plasticidade do gene da proteína NCX em formar proteínas distintas, sugere a expressão de proteínas isoformas nos répteis estudados.