Cardiovascular disease, which involves the cardiac, cerebrovascular and peripheral vascular system, is the major cause of morbidity and mortality in the western world. Changes in the vascular microenvironment trigger cascades of molecular events involving altered signaling, transcription and translation of a gene. The aim of this thesis was to increase our understanding on the molecular regulation of activated vascular smooth muscle cells. The first study looking at PDGF-D expression provides new insights into the regulatory mechanisms controlling the phosphorylation of Sp1. Studies performed identified three amino acids in Sp1 (Thr668, Ser670 and Thr681) that is phosphorylated by PKC-zeta activated by AngII. In the second study, the translational regulatory role of a novel gene YrdC induced by injury was investigated. Current knowledge of translational regulators controlling altered gene expression is little and studies in this thesis shows a splice variant of YrdC playing an important role in controlling mRNA translation and thus protein synthesis in the context of injury. The final study investigated in this study was the increased expression of the apoptotic FasL by the activation of GATA6. Although FasL has been extensively studied over the years, this is the first study linking a GATA factor with FasL in any cell type and provides key insights into the transcriptional events underpinning FasL-dependent SMC apoptosis following exposure to AngII.

Prostasin is expressed at the apical surface of normal epithelial cells and suppresses in vitro invasion of cancer cells. Prostasin re-expression in the PC-3 prostate carcinoma cells down-regulated the epidermal growth factor receptor (EGFR) protein expression and EGF-induced phosphorylation of the extracellular signal-regulated kinases (Erk1/2). We report here that prostasin and its activating enzyme matriptase are capable of inducing proteolytic cleavages in the EGFR extracellular domain (ECD) when co-expressed in the FT-293 cells, generating two amino-terminally truncated fragments EGFR135 and EGFR110, at 135 and 110 kDa. Prostasin's role in EGFR cleavage is dependent on the serine active-site but not the GPI-anchor. The modifications of EGFR were confirmed to be on the primary structure by deglycosylation. EGFR135 and EGFR110 are not responsive to EGF stimulation, indicating loss of the ligand-binding domains. EGFR110 is constitutively phosphorylated and in its presence Erk1/2 phosphorylation is increased in the absence of EGF. The protease-induced EGFR cleavages are not dependent on EGFR phosphorylation. The EGFR ECD proteolytic modification by matriptase-prostasin is also observed in the BEAS-2B normal lung epithelial cells, the BPH-1 benign prostate hyperplasia and the MDA-MB-231 breast cancer cell lines; and represents a novel mechanism for epithelial cells to modulate EGF-EGFR signaling.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第17780号 / 医博第3806号 / 新制||医||999(附属図書館) / 30587 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妻木 範行, 教授 武藤 学, 教授 松田 道行 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é caracterizado pela presença de resistência à insulina, a qual pode ser modulada pelo estrógeno, tanto em fêmeas como em machos. Nesse processo, o transportador de glicose GLUT4 (gene Slc2a4, solute carrier family 2 member 4) desempenha papel importante, pois aumento da expressão do GLUT4 melhora o controle glicêmico. Estradiol (E2) regula a expressão do Slc2a4 por meio do balanço dos efeitos contrários de seus receptores (ERs): ER-alfa estimula e ER-beta inibe a expressão. Efeitos transcricionais dos ERs envolvem a participação de co-reguladores, destacadamente o SP1 (transcription factor Sp1), potente estimulador do Slc2a4. Entretanto, o papel do SP1 na regulação do Slc2a4 mediada pelos ERs é desconhecido; e este foi o objetivo do presente estudo. Investigou-se adipócitos maduros 3T3-L1, tratados por 24 horas com E2, agonista de ER-alfa (PPT) ou agonista de ER-beta (DPN). Avaliou-se: a expressão gênica (RT-qPCR) de Slc2a4 e Sp1; o conteúdo (Western blotting) total de GLUT4 e o nuclear de ER-alfa/beta e SP1; a atividade de ligação do SP1 no Slc2a4 (ensaio de mobilidade eletroforética); e a formação de complexos SP1/ER-alfa (imunoprecipitação). Os resultados confirmaram que E2 aumenta a expressão de Slc2a4/GLUT4 pela ação preponderante do ER-alfa. O agonista PPT aumentou: o conteúdo nuclear de SP1, a interação SP1/ER-alfa e a atividade de ligação do SP1 no Slc2a4. O agonista DPN indicou que a ação repressora do ER-beta não envolve o SP1. Conclui-se que o efeito estimulador do ER-alfa na expressão do Slc2a4 envolve mecanismo de transativação gênica via SP1. Essas observações colocam a cooperação ER-alfa/SP1 como um novo alvo para o desenvolvimento de medidas terapêuticas para resistência à insulina e diabetes mellitus tipo 2 / Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is characterized by insulin resistance, which can be modulated by estrogen in both females and males. In this process, the glucose transporter GLUT4 (solute carrier family 2 member 4 gene - Slc2a4) plays an important role, since increasing GLUT4 expression improves glycemic control. Estradiol (E2) regulates the expression of Slc2a4, by a mechanism in which estrogen receptors (ERs) play opposite effects: ER-alpha stimulates, whereas ER-beta inhibits the expression. Transcriptional effects of ERs involve co-regulators, notably the transcription factor SP1, a powerful enhancer of Slc2a4. However, the role of SP1 in the ERs-mediated regulation of Slc2a4 is unknown; and that was the aim of the present study. Differentiated adipocytes 3T3-L1 were treated (24 hours) with E2, ER-alpha agonist (PPT) or ER-beta agonist (DPN). It was analyzed: gene expression (RT-qPCR) of Slc2a4 and Sp1; total content o GLUT4 and nuclear content of ER-alpha/beta and SP1 (Western blotting); binding activity of SP1 into Slc2a4 promoter (electrophoretic mobility shift assay); and content of nuclear SP1/ER-alpha complexes (immunoprecipitation). Results confirmed that E2 increases the expression of Slc2a4/GLUT4, by the dominant effect of ER-alpha. The ER-alpha agonist PPT increased the nuclear content of SP1, the interaction of SP1/ER-alpha, and the binding activity of SP1 into the Slc2a4. The agonist DPN evinced that ER-beta activity does not involve the SP1. In conclusion, the enhancer effect of ER-alpha upon Slc2a4 gene expression involves a transactivation mechanism via SP1. This observation point outs the cooperation of ER-alpha/SP1 as a new target for the development of approaches to treat insulin resistance and T2DM

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral. / This work shows, for the fIrst time, the involvement of the RECK gene in cell cycle progression. Our data shows that the RECK gene product regulates cell cycle progression by altering the G1 to S transition. Also, we show that RECK is able to induce p21 expression and, consequently, lead to hypophosphorylation of the Rb protein, revealing at least one molecular mechanism through which RECK modulates the cell cycle progression. It has been described that induction of the c-Myc transcription factor promotes cell proliferation and cell transformation by regulating several genes that are involved in cell cycle progression. Here, we show that activation of a Mycestrogen receptor fusion protein with 4-hydroxytamoxifen in mouse fibroblasts was suffIcient to repress the expression of the RECK gene, by acting at the RECK promoter region. In addition, we show that Myc-responsiveness seems to be mediated by the upstream Sp1 sites and to be dependent on cromatin remodelling mechanisms. RECK gene expression was aIso evaluated during human glioma progression. Our results indicate that RECK gene expression is not altered during glioma progresslOn, but a correlation was found between the abundance of RECK expression in gliomas and patient survival. The levels of RECK expression can be considered a good prognostic indicator for glioma patients. Better understanding of RECK gene regulation may contribute to uncover the mechanisms of cell cycle and tumor progression, and to the development of new strategies for cancer prevention and therapeutic intervention.

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Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral. / This work shows, for the fIrst time, the involvement of the RECK gene in cell cycle progression. Our data shows that the RECK gene product regulates cell cycle progression by altering the G1 to S transition. Also, we show that RECK is able to induce p21 expression and, consequently, lead to hypophosphorylation of the Rb protein, revealing at least one molecular mechanism through which RECK modulates the cell cycle progression. It has been described that induction of the c-Myc transcription factor promotes cell proliferation and cell transformation by regulating several genes that are involved in cell cycle progression. Here, we show that activation of a Mycestrogen receptor fusion protein with 4-hydroxytamoxifen in mouse fibroblasts was suffIcient to repress the expression of the RECK gene, by acting at the RECK promoter region. In addition, we show that Myc-responsiveness seems to be mediated by the upstream Sp1 sites and to be dependent on cromatin remodelling mechanisms. RECK gene expression was aIso evaluated during human glioma progression. Our results indicate that RECK gene expression is not altered during glioma progresslOn, but a correlation was found between the abundance of RECK expression in gliomas and patient survival. The levels of RECK expression can be considered a good prognostic indicator for glioma patients. Better understanding of RECK gene regulation may contribute to uncover the mechanisms of cell cycle and tumor progression, and to the development of new strategies for cancer prevention and therapeutic intervention.

O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é caracterizado pela presença de resistência à insulina, a qual pode ser modulada pelo estrógeno, tanto em fêmeas como em machos. Nesse processo, o transportador de glicose GLUT4 (gene Slc2a4, solute carrier family 2 member 4) desempenha papel importante, pois aumento da expressão do GLUT4 melhora o controle glicêmico. Estradiol (E2) regula a expressão do Slc2a4 por meio do balanço dos efeitos contrários de seus receptores (ERs): ER-alfa estimula e ER-beta inibe a expressão. Efeitos transcricionais dos ERs envolvem a participação de co-reguladores, destacadamente o SP1 (transcription factor Sp1), potente estimulador do Slc2a4. Entretanto, o papel do SP1 na regulação do Slc2a4 mediada pelos ERs é desconhecido; e este foi o objetivo do presente estudo. Investigou-se adipócitos maduros 3T3-L1, tratados por 24 horas com E2, agonista de ER-alfa (PPT) ou agonista de ER-beta (DPN). Avaliou-se: a expressão gênica (RT-qPCR) de Slc2a4 e Sp1; o conteúdo (Western blotting) total de GLUT4 e o nuclear de ER-alfa/beta e SP1; a atividade de ligação do SP1 no Slc2a4 (ensaio de mobilidade eletroforética); e a formação de complexos SP1/ER-alfa (imunoprecipitação). Os resultados confirmaram que E2 aumenta a expressão de Slc2a4/GLUT4 pela ação preponderante do ER-alfa. O agonista PPT aumentou: o conteúdo nuclear de SP1, a interação SP1/ER-alfa e a atividade de ligação do SP1 no Slc2a4. O agonista DPN indicou que a ação repressora do ER-beta não envolve o SP1. Conclui-se que o efeito estimulador do ER-alfa na expressão do Slc2a4 envolve mecanismo de transativação gênica via SP1. Essas observações colocam a cooperação ER-alfa/SP1 como um novo alvo para o desenvolvimento de medidas terapêuticas para resistência à insulina e diabetes mellitus tipo 2 / Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is characterized by insulin resistance, which can be modulated by estrogen in both females and males. In this process, the glucose transporter GLUT4 (solute carrier family 2 member 4 gene - Slc2a4) plays an important role, since increasing GLUT4 expression improves glycemic control. Estradiol (E2) regulates the expression of Slc2a4, by a mechanism in which estrogen receptors (ERs) play opposite effects: ER-alpha stimulates, whereas ER-beta inhibits the expression. Transcriptional effects of ERs involve co-regulators, notably the transcription factor SP1, a powerful enhancer of Slc2a4. However, the role of SP1 in the ERs-mediated regulation of Slc2a4 is unknown; and that was the aim of the present study. Differentiated adipocytes 3T3-L1 were treated (24 hours) with E2, ER-alpha agonist (PPT) or ER-beta agonist (DPN). It was analyzed: gene expression (RT-qPCR) of Slc2a4 and Sp1; total content o GLUT4 and nuclear content of ER-alpha/beta and SP1 (Western blotting); binding activity of SP1 into Slc2a4 promoter (electrophoretic mobility shift assay); and content of nuclear SP1/ER-alpha complexes (immunoprecipitation). Results confirmed that E2 increases the expression of Slc2a4/GLUT4, by the dominant effect of ER-alpha. The ER-alpha agonist PPT increased the nuclear content of SP1, the interaction of SP1/ER-alpha, and the binding activity of SP1 into the Slc2a4. The agonist DPN evinced that ER-beta activity does not involve the SP1. In conclusion, the enhancer effect of ER-alpha upon Slc2a4 gene expression involves a transactivation mechanism via SP1. This observation point outs the cooperation of ER-alpha/SP1 as a new target for the development of approaches to treat insulin resistance and T2DM