Salmonella Enteritidis y Salmonella Gallinarum son dos patógenos importantes para el hospedero aviar. El primero causa infecciones silentes en aves de postura, lo que le permite infectar los huevos y tras el consumo de éstos, llegar al hospedero humano. El segundo, causa en el ave un cuadro de gastroenteritis severa y posterior tifoidea aviar, generando graves consecuencias económicas y productivas. Previamente, mediante herramientas bioinformáticas, identificamos una nueva isla de patogenicidad no caracterizada en cuatro serotipos distintos de Salmonella, entre ellos Gallinarum y Enteritidis. Esta fue nombrada isla de patogenicidad 19 de Salmonella (SPI-19), y codificaría para un sistema de secreción tipo VI (T6SS), un sistema de secreción de proteínas el cual se encuentra ampliamente distribuido entre las bacterias Gram negativo. S. Gallinarum posee codificado en la SPI-19 todos los genes esenciales para un T6SS funcional, mientras que S. Enteritidis posee una versión trunca de la isla, y sólo posee algunos genes del T6SS. Este sistema cumpliría una serie de funciones en los procesos patogénicos dependiendo de la bacteria, y hasta el momento se ha descrito su participaciòn en adherencia, invasión, citotoxicidad y proliferación intracelular. Al analizar filogenéticamente el T6SS codificado en SPI-19 se descubrió que se encontraba cercano a los sistemas codificados en bacterias como Vibrio cholerae y Aeromonas hydrophila. En estos patógenos ya se ha descrito un rol del T6SS en la interacción con células del sistema inmune, particularmente en la sobrevida y citotoxicidad en líneas celulares de macrófagos. Debido a que la capacidad de Salmonella para sobrevivir dentro de macrófagos es un proceso fundamental para su diseminación sistémica y colonización de órganos blanco, en esta memoria se propuso determinar el papel que cumple el T6SS codificado en SPI-19 en la interacción con macrófagos murinos. Para esto se estudió la capacidad de sobrevivir al interior de macrófagos RAW 264.7 de mutantes en genes estructurales y efectores del T6SS. A su vez, se analizó la capacidad citotóxica de estas cepas. Los resultados muestran que mutantes de S. Gallinarum presentan una supervivencia menor a tiempos tardíos de infección. En S. Enteritidis la mutante para SPI-19 no presenta una disminución significativa de la sobrevida. En ambos serotipos no se presentan cambios en la citotoxicidad. También se estudió la expresión en la infección de macrófagos del efector VgrG mediante una fusión con el fluoróforo GFP. Esto reveló una rápida expresión de la fusión, lo que sugiere que el contacto bacteria-macrófago gatilla la expresión del efector. Estos resultados demuestran que la isla SPI-19 codifica para un T6SS funcional, que participa en un proceso esencial de la infección por Salmonella.

Orientador: Edir Nepomuceno Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-19T02:06:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Afonso_MagalyAnanias_M.pdf: 2768658 bytes, checksum: 3b0cd61fc672cafefd6f641b93b7bf53 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Determinou-se a sobrevivência de Salmonella enteritidis em ovos artificialmente, contaminados e submetidos à cocção em chama de gás e forno de microondas (FMO), e, em alimentos preparados com ovos contaminados c submetidos a diferentes temperaturas de armazenagem. Foi utilizado Salmonella enteritidis patogênico, fagotipo 28 isolado de aves e ovos brancos de galinhas comerciais. Os alimentos contaminados com aproximadamente 106 a 108 UFC e examinados foram: ovos cozidos em água em ebulição por até oito minutos, ou em forno microondas por 1 minuto, ovos mexidos; ovos tipo pochê; maionese, glacê de clara, gemada e sorvete de creme. A recuperação da Salmonella enteritidis contaminante foi feita quantitativamente através do plaqueamento em duplicata de alíquotas de diluições decimais da amostra sobre Agar a, qualitativamente, com enriquecimento da mesma para verificar presença ou ausência de células viáveis na amostra original. A cocção de ovos em FMO foi mais eficiente na eliminação de Salmonella enteritidis que a em água, num mesmo período de tempo. A cocção de ovos em água em ebulição, até 8 minutos, reduziu drasticamente, mas não foi capaz de eliminar totalmente a contaminação por Salmonella enteritidis. A cocção de ovos em por 1:00 minuto reduziu drasticamente, mas não foi capaz de eliminar totalmente a contaminação por Salmonella enteritidis. O preparo convencional de ovos tipo pochê em chama de gás reduziu drasticamente, mas não foi capaz de eliminar totalmente a contaminação por Salmonella enteritidis. Novamente, a cocção de ovos tipo poché em FMO eliminou totalmente a contaminação por Salmonella enteritidis de ovos inoculados, quando o tempo de cocção era igual ou superior a 1m:30s. A cocção de ovos mexidos em ambos os métodos foi capaz de eliminar totalmente a contaminação de ovos inoculados. Sorvete contaminado, mantido a -18ºC, teve grande redução na sua contami¬nação original por Salmonella enteritidis mas deixou, ainda, uma população residual após 35 dias de armazenagem. A população inicial de Salmonella enteritidis contaminante de glacê de ciara reduziu gradativamente na armazenagem refrigerado a (8ºC) mas, continha, ainda, população residual após 7 dias. A escaldarem com o leite fervente no preparo de gemada artificialmente inoculada exerceu efeito "past eur isante" destruindo quase totalmente a contaminação por Salmonella enteritidis. A detecção de células viáveis sobreviventes (101 UFC/g) só foi possível através de cultivo qualitativo. Tanto a variação do pH (3,80 a 4,04), do tempo (4 a 72 horas), quanto a variação da temperatura de armazenagem (8 e 25ºC) tiveram pequeno ou nenhum efeito na redução ou aumento da contaminação por Salmonella enteritidis de maionese. A população de fungos. e leveduras aumentou gradativamente quando maionese contaminada com Salmonella enteritidis. Foi mantida a 25ºC, mas nao quando estocada a 8ºC, no período de 72 horas, independente da variação do pH da amostra de 3,80 a 4,04. Nossos experimentos determinaram que alimentos que contenham ovos e os ovos propriamente ditos, quando apresentam uma carga alta de contaminante como Salmonella enterit idis podem, em alguns casos, trazer risco à saúde consumidor quando sofrem preparo doméstico convencional. / Abstract: The survival of Salmonella enteritidis was determined in artificially contaminated eggs cooked using both a gas flame and microwave oven (MWO). It was also determined in foods prepared with contaminated eggs and stored at different temperatures. The pathogenic Salmonella enteritidis used was phagotype 28, isolated from chicken meat and white eggs produced commercially. The following foods were examined, having been contaminated with approximately to 106 to 108 UFC: eggs cooked in boiling water for 8 minutes or in the microwave oven for 1 minute, scrambled eggs, poached eggs; mayonnaise, egg white glaze; milk drink containing beaten egg yolk, vanilla ice-cream. The quantitative recuperation of Salmonella enteritidis contamination was carried out by plating decimal dilutions of the sample on agar in duplicate. For the qualitative determination, an enrichment procedure was used to check for the presence or absence of viable cells in the original sample. Using the same time period, MWO cooking was more efficient than boiling water in eliminating Salmonella enteritidis. Boiling in water for 8 minutes reduced the count drastically, but was not capable of eliminating the Salmonella enteritidis completely. Similarly, poaching eggs over a gas flame reduced the count drastically but did not completely eliminate Salmonella enteritidis contamination, whereas MWO totally eliminated it if a cooking time equal or greater to 1 min 30 sees was used. Both methods of cooking scrambled eggs completely eliminated the contamination. When contaminated ice-cream was stored at -18ºC, a considerable reduction in the Salmonella enteritidis count occurred, but after 35 days of storage, there was still a residual population. In egg white glaze- the- initial population of Salmonella enteritidis declined gradually during refrigerated storage (8ºC), but there was still a residual population after 7 days. In the milk drink containing beaten egg yolk, the scalding of the contaminated yolk with boiling milk effectively pasteurized the yolk, almost completely destroying the Salmonella enteritidis contamination. The detection of surviving viable cells- was only possible by way of qualitative cultivation (101 UFC/g). With respect to mayonnaise, variations in pH (3.80 - 4.04), time (4-7S hours) and storage temperature (8 e 25ºC) had little or no effect on the reduction or increase of the Salmonella enteritidis contamination. The yeast and mould count increased gradually when maionese contaminated with Salmonella enteritidis was held at 25ºC, but not when held at 8ºC for a period of 72 hours, independent of the variation in sample pH (from 3.80 to 4.04). These experiments showed that foods containing eggs can, in some cases, present health risks to the consumer when prepared by conventional domestic methods, if the original eggs show a high level of contamination by Salmonella enteritidis. / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En la actualidad la detección de cepas bacterianas resistentes a múltiples agentes antimicrobianos parece ir en aumento y se atribuye principalmente a la inadecuada utilización de ellos. Estos fármacos han permitido la selección de genes de resistencia en bacterias zoonóticas, como Salmonella, los cuales pueden diseminarse a los seres humanos a través de la cadena alimentaria. Además cobra importancia el rol de las aves silvestres como reservorios y agentes diseminadores de genes de resistencia a antibióticos hacia los seres humanos y otros animales. El objetivo de esta Memoria de Título fue comparar los perfiles genéticos de resistencia antimicrobiana de cepas de S. enterica ser. Enteritidis aisladas desde aves silvestres, aves comerciales y seres humanos en Chile, y determinar su relación con el hospedero de origen de estas cepas. Se analizaron 96 cepas en total, de las cuales 33 fueron aisladas desde aves silvestres, 31 de aves comerciales y 32 de seres humanos. Se utilizó la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para determinar los perfiles de resistencia antimicrobiana. Los genes seleccionados fueron: tet(A), tet(B), tet(G) (resistencia a tetraciclinas), blaPSE-1, blaTEM, blaCMY (resistencia a β-lactámicos), aadB, aacC (resistencia a aminoglicósidos) y además se detectó la presencia de integrones clase 1. Para determinar la asociación de los perfiles genéticos de resistencia con su hospedero de origen se utilizó el programa Infostat®. De las 96 cepas analizadas en esta Memoria, se encontraron 13 perfiles genéticos de resistencia antimicrobiana diferentes, los cuales resultaron estar asociados con el hospedero de origen de las cepas. Adicionalmente, los datos obtenidos fueron analizados con la finalidad de determinar la asociación de genes de resistencia antimicrobiana con hospedero de origen de las cepas, siendo tet(A) el único gen asociado a cepas obtenidas de aves silvestres. Los resultados de esta Memoria proporcionan evidencia sobre los efectos colaterales que provoca la sobreutilización de antimicrobianos en el medio ambiente, impactando indirectamente en la fauna silvestre

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En los últimos años se han utilizado biotecnologías, como los bacteriófagos, para controlar patógenos bacterianos asociados a enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), tales como Campylobacter spp., E. coli 0157H7 y Salmonella enterica. Si bien en un inicio se realizaron fagoterapias directamente en los animales de abasto, hace poco más de una década se inició el biocontrol de estos agentes biológicos directamente en los alimentos, tanto a temperatura de refrigeración como ambiental. Los resultados internacionales indican que la aplicación directa de ellos logra reducir en rangos variables los recuentos bacterianos, sin producir cambios organolépticos. El objetivo de este estudio fue establecer la efectividad de una mezcla de fagos líticos nativos en la reducción de los recuentos de Salmonella Enteritidis (SE), en dos matrices alimentarias como son las cecinas cocidas, particularmente el jamón de pavo y la vienesa pollo. Para esto se trabajó con dos grupos de 25 muestras cada uno: el grupo experimental se contaminó con SE y se le aplicó la mezcla de fagos (MOI 105), en tanto que el grupo control sólo se contaminó con la cepa desafío. La dosis de contaminación varió según la temperatura de incubación de las muestras. Una vez contaminada y aplicada la mezcla de fagos, las muestras se incubaron por 10 días a temperatura ambiente (18 ºC) y a temperatura de refrigeración (4 ºC) para luego realizarles recuento bacteriano. Pasados los 10 días se observó que la aplicación de la mezcla de bacteriófagos redujo significativamente (p < 0,0001) los recuentos de SE en jamón de pavo mantenidos a temperatura ambiente, logrando una leve reducción de 0,48 unidades logarítmicas de SE/g mientras que en las muestras que permanecieron a temperatura de refrigeración se obtuvieron mayores reducciones del orden de 1,72 unidades logarítmicas de SE/g. Para vienesa pollo, la mezcla de fagos redujo los recuentos en 1,13 unidades logarítmicas de SE (p < 0,05) para el grupo que permaneció a temperatura ambiente mientras que en el grupo a temperatura de refrigeración se logró obtener reducciones significativas de 0,48 unidades logarítmicas (p < 0,05) de SE. Los resultados obtenidos indican que la efectividad de esta mezcla de fagos líticos depende de la matriz alimentaria y que podría ser una alternativa para el biocontrol de SE en jamón de pavo y vienesa de pollo a temperatura ambiente y de refrigeración por 10 días. / In recent years, biotechnological tools, as bacteriophages, have been used to control bacterial pathogens associated with food-borne diseases, such as Campylobacter spp., E. coli 0157:H7 and Salmonella enterica. While initially performed direct phagetherapies were performed in livestock, just over a decade ago the biocontrol direct in Food began, both cooling and room temperature. The international data have shown that the bacteriophage direct application reduce, in variable ranges, the bacterial counts, with no organoleptic changes. The aim of this study was to establish the effectiveness of a native lytic bacteriophage cocktail in reducing Salmonella Enteritidis (SE) counts, in two processed food matrices, as turkey breast ham and chicken sausage. Thus, two groups of 25 samples each one were differentiated: the experimental group was inoculated with SE and receive the phage cocktail (MOI 105), in so far as the control group was only inoculated with the bacterial strain. The inoculation dose varied according to the storage temperature of the samples. Once contaminated and added with the phage cocktail, the samples were incubated for 10 days at room (18 ºC) and cooling (4 ºC) temperature, to next perform the bacterial count. After 10 days a significant bacterial count reduction (p < 0.0001) was observed due to the application of the phage cocktail in turkey breast ham stored at room temperature, achieving a slight reduction of 0.48 log CFU/g, while in the samples stored at cooling temperature higher reductions were obtained, around 1.72 log UFC/g. In chicken sausage, the phage cocktail reduced the bacterial counts in 1.13 log UFC/g (p < 0.05) in the samples stored at room temperature, while in the samples stored at cooling temperature the reduction were of 0.48 log CFU/g (p < 0.05). The present results indicates that the effectiveness of this lytic bacteriophage cocktail depends strongly in the type of food matrix, and that could be an alternative tool for the biocontrol of SE in turkey ham and chicken sausages at room and cooling temperatures for 10 days. / Financiamiento: Proyecto FONDECYT 1110038.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella Enteritidis continúa siendo una zoonosis emergente tanto en Chile como en el mundo entero, principalmente asociada al sector avícola. Los productores de aves han realizado esfuerzos para implementar medidas de control y prevención frente a este enteropatógeno, sin embargo estas medidas aún no han mostrado la eficiencia esperada. En la actualidad en el sector avícola se están realizando novedosas investigaciones sobre el uso de bacteriófagos líticos como biocontroladores frente a patógenos de importancia en salud publica. El objetivo de este trabajo fue demostrar la eficiencia de tres bacteriófagos líticos frente a la colonización de SE en pollos SPF experimentalmente infectados, estudiando su administración solos o en asociación y diferentes vías de administración. En una primera experiencia se formaron 5 grupos de 30 pollos SPF de 10 días de edad cada uno, estos fueron tratados con fagos, individuales y en asociación (mezcla) con una MOI de 103 UFP y posteriormente las aves fueron desafiadas con 8,5x105 UFC/ml de SE. A los 20 días de edad las aves recibieron eutanasia, obteniendo muestras individuales de intestino y pool de órganos (hígado, corazón y bazo), para bacteriología cualitativa y cuantitativa. Los grupos controles fueron: uno tratado solo con fagos, otro que recibió solo cepa desafío y un tercer grupo que no recibió tratamiento ni desafío. En una segunda experiencia se formaron 3 grupos de 22 pollos libres de Salmonella spp y provenientes de madres no vacunadas. Al día 9 de edad, dos grupos recibieron una mezcla de los tres fagos (MOI 103 cada uno), uno por aerosol y otro por agua de bebida. Un día después, los tres grupos fueron desafiados con 9,6 x 105 UFC/ml de SE. A los 10 días post infección las aves recibieron eutanasia obteniendo muestras individuales de intestino y pool de órganos (hígado, corazón y bazo), para bacteriología cualitativa y cuantitativa. En la primera experiencia, solo las aves tratadas con la mezcla de fagos (58,6%) y el fago 3 de forma individual (53,3%) disminuyeron significativamente el número de aves infectadas (P= 0,0154 y P= 0,0099 respectivamente) comparado con el grupo control de infección (86,6%). Mediante bacteriología cuantitativa se demostró que la terapia con mezcla, fago 1 y fago 3 redujeron el recuento de SE en contenido intestinal, desde 108 UFC/g hasta 105/UFC/g. El fago 2 logró una menor disminución en los recuentos (107UFC/g). En relación a las vías de administración, la bacteriología cualitativa reveló diferencias estadísticas en el total de aves infectadas solo en el grupo de aves que recibió la mezcla de fagos por vía aerosol (P= 0,0084) donde se logró un nivel de infección de 72,7% comparado con el 100% de infección detectado en el grupo control. En las aves que recibieron la mezcla de fagos en el agua de bebida se detectó un nivel de infección del 90,9%. En relación al recuento bacteriano las aves tratadas con fagos por ambas vías, aerosol y agua de bebida, lograron reducir significativamente SE a nivel intestinal (P< 0,01 y P< 0,05 respectivamente), mientras que solo la terapia por agua de bebida fue capaz de disminuir los recuentos a nivel sistémico (P= 0,014). El grupo que solo recibió fago y el grupo control sano no evidenciaron algún tipo de alteración clínica ni lesiones macroscópicas a la necropsia, hecho que aseguró la inocuidad de los fagos, y de las vías de administración y descartó una posible contaminación entre los grupos experimentales. Con los resultados obtenidos se concluye que la terapia preventiva de fagos podría constituir una herramienta promisoria para el biocontrol de Salmonella Enteritidis en el sector avícola, disminuyendo la incidencia y la colonización intestinal y sistémica. A pesar que quedan desafíos pendientes respecto a la incorporación de partículas virales en animales, esta experiencia sugiere que la fagoterapia es una medida fácil y económica para ser aplicada a gran escala en la producción aviar.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella Enteritidis (S.E.) se encuentra ampliamente distribuida alrededor del mundo, causando problemas en salud pública y pérdidas económicas para los países, particularmente para la industria avícola. Las aves de corral son el principal reservorio de este enteropatógeno y dentro de los productos avícolas, el huevo presenta una mayor importancia epidemiológica en los brotes causados por esta bacteria. Debido a que las medidas de control no han sido lo suficientemente satisfactorias y, producto del desarrollo de resistencia a antimicrobianos, renace el interés por el uso de bacteriófagos líticos como una herramienta terapéutica y profiláctica. El objetivo de este estudio fue determinar si una mezcla de tres bacteriófagos líticos, administrados de manera profiláctica, era capaz de disminuir la incidencia de infección y el recuento (UFC/g) de S.E. en el tracto reproductivo (ovario y oviducto) de gallinas infectadas experimentalmente. Para ello, se utilizaron 80 gallinas comerciales de postura Hy Line Brown, de 22 semanas de edad, las que se dividieron de manera aleatoria en cuatro grupos; control negativo (A, no recibió fagos ni S.E.), control de inocuidad de fago (C, solo se le administraron fagos), control de infección (B, solo desafiadas con S.E.) y grupo terapia (D, fagos y S.E.). Las aves pertenecientes a los grupos C y D, recibieron por tres días consecutivos una dosis de 1011 UFP/cada fago/mL (MOI 103), por vía oral forzada y al cuarto día del ensayo, las gallinas de los grupos B y D, fueron desafiadas con S.E. a una dosis total de 2,4 x 108 UFC, por vía oral. Al décimo día post infección se procedió al sacrificio de las aves, para la obtención de muestras separadas de ovario y oviducto, las que se analizaron mediante bacteriología cualitativa y cuantitativa (UFC/g). La bacteriología cualitativa reveló a nivel de ovario, un 43,3% de positividad en el grupo control de infección, mientras que en el grupo tratado con bacteriófagos el porcentaje alcanzó un 30%, reducción (13,3%) que no fue estadísticamente significativa (p=0,2839). Situación similar ocurrió en tejido oviductal, en donde la incidencia de S.E. en el grupo control de infección (23,3%) y en el grupo que recibió fagos (10%), no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p=0,1659). 4 En cuanto a la bacteriología cuantitativa, el tratamiento con bacteriófagos no logró disminuir significativamente el recuento de S.E. a nivel oviductal (p=0,1007), mientras que en ovario, la utilización profiláctica del cóctel de fagos redujo significativamente (p=0,0489) la colonización de la bacteria, al compararlo con los recuentos del grupo control de infección (0,95 versus 0,31 UFC log10). Las aves pertenecientes al grupo control de inocuidad de fago, se observaron asintomáticas durante toda la experiencia y no presentaron lesiones patológicas macroscópicas al momento de la necropsia. De acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo, se concluye que la utilización profiláctica de una mezcla de tres bacteriófagos líticos, en gallinas de postura no fue eficaz en reducir la incidencia de infección ni los recuentos de S.E. en tejidos reproductivos, exceptuando la colonización a nivel ovárico (recuento). La actividad lítica de estos virus demostrada sólo en el tejido ovárico, sugiere que una mayor investigación es necesaria para determinar el verdadero aporte de la utilización de bacteriófagos como biocontroladores de S.E. en gallinas de postura.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella spp. es uno de los principales patógenos involucrados en enfermedades transmitidas por los alimentos, siendo el serotipo Enteritidis el que más se asocia a productos derivados de la industria avícola, principalmente a los huevos. Es por esto que se han buscado diversas medidas de control en gallinas comerciales de postura, no logrando éstas ser completamente eficientes. Los bacteriófagos podrían ser una potencial alternativa para el control de Salmonella Enteritidis (S.E.) en huevos ya que demostraron ser inocuos para las células eucariotas y logran reducir una variedad de patógenos en diversos alimentos. El objetivo del presente trabajo fue determinar in vitro la efectividad de una mezcla de bacteriófagos sobre Salmonella Enteritidis en yemas y albúminas de huevos. Se trabajó con tres grupos de huevos SPF: grupo control de infección que sólo recibió S.E. (101 UFC/0,1 mL), grupo control de fagos que sólo recibió fagos (106 UFP/0,1 mL) y tres grupos que recibieron S.E. (101 UFC/0,1 mL) y fagos en distintas concentraciones (MOI de 103, 104 y 105 /0,1 mL). Albúminas y yemas por separado fueron inoculadas con la cepa desafío S.E. nalr rifr y luego de dos horas a temperatura ambiente, se les administró la mezcla de tres fagos líticos. Las muestras fueron mantenidas a 37 ºC por 24 horas (protocolo de 24 horas) y por 48 horas (protocolo de 48 horas), antes de ser analizadas por bacteriología cualitativa y cuantitativa (recuento bacteriano). Los fagos no lograron disminuir (p > 0,05) la incidencia de S.E. en las muestras de yemas, presentándose un 100% de positividad, tanto para el protocolo de 24 horas como para el de 48 horas, independiente de la MOI utilizada. En las muestras de albúminas, los fagos no lograron disminuir (p > 0,05) la incidencia de S.E. en el protocolo de 24 horas, presentándose un 100% de positividad. En el protocolo de 48 horas, los fagos no disminuyeron (p > 0,05) la incidencia de S.E. en albúminas tratadas con una MOI de 103 (96%) y 104 (100%), pero sí lo hicieron (p < 0,05) en albúminas tratadas con una MOI de 105 (68% de positividad) Los resultados de la bacteriología cuantitativa en los grupos experimentales demostraron que los fagos disminuyen (p < 0,05) los recuentos de S.E. en yemas en 2,53 log10 (MOI 105), en 2,26 log10 (MOI 104) y en 2,32 log10 (MOI 103) en relación al grupo control de infección, para el protocolo de 24 horas. Para el protocolo de 48 horas, los recuentos disminuyeron (p < 0,05) en 0,48 log10 (MOI 103), en 0,35 log10 (MOI 104) y en 0,25 log10 (MOI 105), en relación al grupo control de infección. En las muestras de albúminas tratadas con fagos, los recuentos de S.E. aumentaron (p < 0,05) en 2,4 log10 (MOI 103) y en 1,55 log10 (MOI 104) en relación al grupo control de infección, mientras que en el grupo tratado con una MOI 105 (4,49 log10), no hubo diferencias significativas (p > 0,05) en relación al grupo control (3,07 log10), para el protocolo de 24 horas. Para el protocolo de 48 horas, los recuentos de S.E. disminuyeron (p < 0,05) en 1,81 log10 (MOI 105) y en 1,35 log10 (MOI 103) en relación al grupo control de infección, mientras que en el grupo tratado con una MOI 104 (3,00 log10), no hubo diferencias significativas (p > 0,05) en relación al grupo control de infección (3,55 log10). Con los resultados obtenidos se concluye que el uso de fagos líticos podría ser una herramienta eficaz en la reducción de Salmonella Enteritidis en huevos, sin embargo mayores estudios son necesarios para optimizar el modelo experimental

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Las infecciones por Salmonella enteritidis, han aumentado considerablemente en Chile y en el mundo entero. Esta zoonosis se transmite principalmente por el consumo de productos contaminados, siendo el reservorio más frecuente las aves. Este hecho ha canalizado los esfuerzos hacia métodos de control eficientes, que excluyan el uso de antibióticos, debido a los altos niveles de multirresistencia observados en este enteropatógeno.El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del bacteriófago f3alfaSE, de origen aviar, sobre la colonización de Salmonella enteritidis en un modelo de aves, para esto se trabajó con pollos broiler. A los 10 días de edad se formaron 5 grupos de 15 pollos cada uno. El grupo 1 se inoculó con una relación bacteria/fago 1:1, el grupo 2 fue inoculado con una relación bacteria/fago 1:10, el grupo 3 constituyó el control de infectividad de la cepa de Salmonella entritidis nal elevado a r rif elevado a r recibiendo una dosis de 4 x 10 elevado a 9 UFC/ml, el grupo 4 fue inoculado sólo con el fago en una dosis de 10 elevado a 10 UFP/ml, constituyendo el grupo control de inocuidad del fago, se contó además con un quinto grupo, que no recibió fago ni bacteria, para controlar la contaminación cruzada del fago entre las unidades experimentales. Después de 10 días de la inoculación fago/bacteria, se efectuó la eutanasia de las aves y se procedió al reaislamiento de la cepa desafío a partir de intestino y corazón e hígado ("pool" de órganos) de cada una de las aves. La inoculación del fago en una dosis de 10 elevado a 9 UFP/ml, disminuyó en forma significativa el número de aislamientos de Salmonella desde hígado y corazón vs el grupo control, no así desde intestino. El fago administrado en una dosis de 10 elevado a 10 UFP/ml disminuyó significativamente los aislamientos de Salmonella a nivel intestinal vs el grupo control, no ocurriendo lo mismo en órganos internos. En el grupo control de inocuidad del fago, inoculado con 10 elevado a 10 UFP/ml, no se observó daño en órganos internos a nivel macroscópico. Se concluye que el uso de bacteriófago f3alfaSE sería eficaz en disminuir la colonización intestinal y sistémica de pollos desafiados con una cepa de Salmonella enteritidis / Proyecto FIV 3718-2

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de gerar dados de resistência a agentes antimicrobianos de Salmonella Enteritidis (SE) isoladas de amostras clínicas e do ambiente criatório de aves, nos anos de 1999, 2000 e 2001, de cortes de frango, no ano de 1996, ambos na região Sul, bem como de carcaças de frango, nos anos de 2004 e 2005, na região Nordeste, detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas das cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e fagotipá-las. Realizou-se também a ribotipagem de 28 cepas de SE isoladas de carcaças resfriadas de frango no ano de 2004, na região Sudeste. Cento e dezesete cepas de SE foram submeitdos foram submetidas a testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos e os resultados indicaram que 84,6% (99/117) das cepas de Salmonella Enteritidis apresentaram resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, sendo que o maior percentual está entre as cepas isoladas de carcaças resfriadas de frango, 100% (17/17), seguidas pelas isoladas de cortes de frango, 85,7% (18/21) e das de amostras clínicas e de ambiente criatório de aves, 81% (64/79). Cepas com diferentes níveis de resistência foram encontradas para ampicilina (0,8%), canamicina (1,7%), ciprofloxacina (1,7%), enrofloxacina (10,2%), gentamicina (14,5%), estreptomicina (16,2%), ácido nalidíxico (35,9%), nitrofurantoína (47%) e tetracicilna (59%). Nenhuma das 117 cepas de Salmonella Enteritidis foi resistente ao cloranfenicol, norfloxacina e polimixina B. Dentre as 99 amostras de SE que apresentaram resistência, 66,6% (66), foram resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Trinta e três cepas (33,3%), foram resistentes somente a um agente antimicrobiano, 16 a tetraciclina, 12 a nitrofurantoína, três ao ácido nalidíxico, uma a estreptomicina e uma a gentamicina. Para detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas, 42 cepas de SE que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico foram submetidas a reação em cadeia da polimerase e sequenciamento. Das 42 cepas, 30 (71,4%) apresentaram algum tipo de mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas. As alterações gênicas ocorreram nos aminoácidos dos codons Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) ou Asp-87 (62%). As mutações continham alterações de Gly para Asp (n: 1) no codon 81, Asp para Asn (n: 1) no codon 82, Ser para Phe (n: 9) no codon 83 e Asp para Tyr (n: 9) ou Asn (n: 9) no codon 87. Uma amostra apresentou uma inclusão do aminoácido prolina entre os codons 56 e 57. A fagotipificação de 116 cepas de SE apresentou que 68,9% (80/116) pertencem ao fagotipo (FT) 4, 15,5% (18/116) ao FT 4a, 12,2% (14/116) ao FT 1, 0,9% (1/116) ao FT6, 0,9% (1/116) ao FT 6a, 0,9% (1/116) ao FT 7 e 0,9% (1/116) ao FT 7a. Quando leva-se em consideração a origem dos isolados, observamos que nas SE isoladas de amostras clínicas e ambientais criatório de aves, 56,4% pertencem ao FT 4, 21,8% ao FT 4a, 17,9% ao FT 1, 1,3% ao FT 6, 1,3% ao FT 6a e 1,3% ao FT 7a. Nas amostras isoladas de carne cortes de frango, o FT 4 predomina com 95,2% (20/21) e 4,8% (1/21), pertencem ao FT 7. Nos isolados de carcaças resfriadas de frango 94,1% são do FT 4 e 5,9% (1/17) do FT 4a. A caracterização por ribotipagem foi realizada utilizando-se o RiboPrinter® system (DuPont), e apresentou quatro diferentes ribotipos, sendo que o mais comum foi o 25-S-1 (82,1%), seguido pelo 29-S-5 (10,7%) e 28-S-5 e 38-S-3 com 3,5% cada um. Baseados nos dados do presente estudo, conclui-se que: houve uma elevada percentagem de cepas de Salmonella Enteritidis resistente a um ou mais agentes antimicrobianos, indicando que levantamentos contínuos são necessários na indústria avícola e que existe a necessidade de um uso responsável dos agentes antimicrobianos, baseado na compreensão da ecologia da resistência, da transmissão da bactéria resistente e de genes de resistência, da relação entre o uso do antibiótico e aumento da resistência e de um conhecimento de intervenções efetivas; Que assim como em outros trabalhos amostras de S. Enteritidis resistentes ao ácido nalidíxico, isoladas no Brasil, também apresentam mutação no gene gyrA, da região determinante de resistência a quinolonas; Que o FT 4 foi o predominante e que entre as cepas de S. Enteritidis isoladas de aves e de seu ambiente criatório existe uma maior diversidade de fagotipos quando comparada as isoladas de carcaças de frango; E que ao avaliarmos os dados gerados pela ribotipagem observamos um baixo grau de diversidade gênica entre as cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas no presente estudo. / This work aimed to evaluate the antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis (SE) isolated from clinical and environmental poultry samples, during the years of 1999, 2000 and 2001, broiler chicken parts, in 1996, both in Southern Brazil, broiler chicken carcasses, during the years 2004 and 2005, in Northeastern Brazil, detect mutations in the gyrA gene from nalidixic acid resistant and identify their phage type. Also, 28 SE strains isolated during the year 2004 in Southeastern Brazil were characterized by ribotyping. The antimicrobial resistance test was performed using the disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar. The results indicated that 84.6% (99/117) of SE strains were resistant to at least one of the antimicrobial agents tested. Resistance at different levels was found to ampicillin (0.8%), kanamycin (1.7%), cyprofloxacin (1.7%), enrofloxacin (10.2%), gentamycin (14.5%), streptomycin (16.2%), nalidixic acid (35.9%), nitrofurantoin (47%), and tetracycline (59%). None of the SE strains were resistant to chloramphenicol, norfloxacin and polimyxin B. Among the 99 SE strains showing resistance, 66.6% (66) presented multiple resistance, to two or more antimicrobial agents. Thirty-three strains (33.3%) were resistant to only one of the antimicrobial agents, 16 to tetracycline, 12 to nitrofurantoin, 3 to nalidixic acid, 1 to gentamycin, and 1 to streptomycin. Fourty-two nalidixic acid resistant strains were submited to PCR and sequencing to detect gyrA mutation genes. Thirty SE strains (71.4%) showed at least one mutation in gyrA genes of quinolone resistance determining region (QRDR), in the codons corrosponding to Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) or Asp-87 (62%). These mutants contained a change from Gly to Asp (n: 1) at codon 81, Asp to Asn (n: 1) at codon 82, Ser to Phe (n: 9) at codon 83 and Asp to Tyr (n: 9) or Asn (n: 9) at codon 87. In one sample there was a Pro inclusion between the 56 and 57 codons. The phage typing of 116 SE isolates showed that 68.9% (80/116) belonged to the phage type (PT) 4, 15.5% (18/116) to the PT 4a, 12.2% (14/116) to the PT 1, 0.9% (1/116) to the PT 6, 0.9% (1/116) to the PT 6a, 0.9% (1/116) to the PT 7, and 0.9% (1/116) to the PT 7a. The ribotyping characterization was done using RiboPrinter® system (DuPont), and showed four different ribotypes. The most common ribotype was 25-S-1 (82.1%). The other ribotypes were 29-S-5 (10.7%), 38-S-3 (3.6%) and 28-S-5 (3.6%). In conclusion, the antimicrobial resistance levels presented here suggest a high occurrence of Salmonella Enteritidis strains resistant to at least one antimicrobial agent, indicating the need for continuous surveillance in the poultry industry, and the need for responsible use of antimicrobial agents in food animals, based on a understanding of the ecology of resistance, the transmission of both bacteria and resistance genes, the relationship between antimicrobial agents use and resistance amplification, and the knowledge of effective interventions. S. Enteritidis nalidixic acid resistant strains isolated in Southern and Northeastern Brazil showed mutation in the gyrA gene of QRDR. Phage type 4 was the most common isolated and among S. Enteritidis strains isolated from clinical and environmental poultry samples there were a higher phagetype diversity when compared with broiler chicken carcasses. The S. Enteritidis strains that were ribotyping showed a lower degree of genetic diversity.

Thesis (M. Phil.)--Hong Kong University of Science and Technology, 2003. / Includes bibliographical references (leaves 98-116). Also available in electronic version. Access restricted to campus users.