Les Epidermolyses Bulleuses Dystrophiques (EBD) sont des génodermatoses rares et sévères transmises sur un mode autosomique récessif (EBDR) ou dominant (EBDD), dues à une perte de l’adhésion dermo-épidermique. Les patients atteints d’EBD souffrent de décollements bulleux cutanéo-muqueux qui menacent le pronostic fonctionnel et vital dans les formes les plus graves. Toutes les formes d’EBD sont dues à des mutations du gène COL7A1 codant pour le collagène VII qui est le constituant des fibres d’ancrage assurant l’adhésion de l’épiderme au derme. Il n’existe actuellement pas de thérapie satisfaisante des EBD. La première partie de ma thèse visait à démontrer la faisabilité d’une approche thérapeutique par saut d’exon des EBDR. Cette stratégie consiste à exciser l’exon porteur de la mutation durant le processus d’épissage, afin de restaurer l’expression d’une protéine fonctionnelle. Les exons 73 et 80 de COL7A1 sont particulièrement intéressants car ils sont le siège de mutations récurrentes et que leur excision préserve le cadre ouvert de lecture. Nous avons dans un premier temps démontré le caractère non indispensable des séquences codées par ces exons in vivo en utilisant un modèle de xénogreffe de peau humaine EBDR reconstruite, génétiquement modifiée à l’aide de vecteurs rétroviraux exprimant l'ADNc de COL7A1 délété des séquences des exons 73 ou 80. Puis, j’ai pu établir que la transfection d’oligoribonucléotides antisens (AONs) dirigés contre certaines séquences régulatrices de l’épissage permettait d’induire le saut en phase de ces exons dans des cellules primaires de patients EBDR, avec une efficacité atteignant 90% de saut d’exon. Les analyses par western blot et immunocytofluorescence après transfection ont permis de mettre en évidence une réexpression significative du collagène VII (jusqu’à 25%) dans les cellules de trois patients EBDR. Enfin, j’ai pu démontrer la réexpression du collagène VII in vivo, après injection de différentes doses d’AONs dans des peaux équivalentes générées avec des cellules de patients et greffées sur des souris immunodéficientes. Dans la seconde partie de ma thèse, j’ai étudié une famille EBD particulière, dont les deux enfants atteints présentaient une EBD beaucoup plus sévère que leur mère et leur grand père maternel, atteints d’une forme modérée d’EBDD. Le séquençage des 118 exons de COL7A1 et des régions d’épissage adjacentes a permis d’identifier une seule mutation dominante c.6698G>A (p.Gly2233Asp) dans l’exon 84, à l’état hétérozygote chez les quatre sujets. A partir de l’étude des transcrits paternels, j’ai pu identifier une nouvelle mutation c.2587+40G>A dans l’intron 19 de COL7A1, qui active un site donneur cryptique dans l’intron 19, entraînant sa rétention partielle et la formation d’un codon stop prématuré. La confirmation de la présence de cette seconde mutation, récessive, dans l’ADN des deux enfants a ainsi permis d’expliquer les différences phénotypiques observées, les deux enfants atteints étant hétérozygotes composites pour une mutation dominante et une mutation récessive de COL7A1. Cette mutation récessive constitue la mutation intronique la plus distante des sites consensus d’épissage de COL7A1 et souligne l’importance de l’étude des ARNm pour la recherche de mutations dans le cadre des EBD. Dans une dernière partie de ma thèse, j’ai débuté la caractérisation d’un modèle murin knock-in d’EBDR développé par notre laboratoire, qui mime certaines des caractéristiques phénotypiques des patients EBDR. Mon travail a permis de démontrer in vivo la faisabilité de l’approche par saut d’exons pour COL7A1. Cette première étape importante conduit à développer des études de preuve de principe et de toxicologie dans des modèles animaux, dans la perspective d’une transition vers la clinique. Il illustre également les variations pathologiques d’épissage pouvant faire l’objet d’approches thérapeutiques similaires. / Dystrophic Epidermolysis Bullosa (DEB) is a group of rare and severe genetic skin disorders, inherited in a dominant (DDEB) or recessive (RDEB) manner, and characterised by loss of adhesion between the epidermis and the underlying dermis. DEB patients suffer from severe blistering of the skin and mucosae after mild traumas, and in the most severe forms, DEB can be life-threatening. DEB is caused by mutations in the COL7A1 gene encoding type VII collagen that assembles into anchoring fibrils forming key dermo-epidermal adhesion structures. To date, there is no specific treatment for DEB. The first part of my thesis was to develop exon skipping as a therapeutic approach for RDEB. In this work, exon skipping strategy consists in modulating the splicing of a premessenger RNA to induce the skipping of a mutated exon and lead to the synthesis of a shorter but functional protein. Exons 73 and 80 of COL7A1 are of particular interest since they carry many recurrent mutations and their excision preserves the open reading frame. In first instance, we have demonstrated the dispensability of these exons for type VII collagen function in an in vivo xenograft model using RDEB cells transduced with retroviral vectors containing COL7A1 cDNAs, deleted of the sequences of exon 73 or 80. I have subsequently transfected primary RDEB keratinocytes and fibroblasts with antisense oligoribonucleotides (AONs) targeting key splicing regulatory elements of these exons, and achieved efficient skipping of these exons (up to 90%). Western blot and immunocytofluorescence experiments demonstrated significant type VII collagen re-expression (up to 25% of the normal amount) in cells from three RDEB patients. Finally, I have generated skin equivalents with cells of these patients, grafted them on immunodeficient mice and injected different doses of AONs in the grafts, and I have demonstrated type VII collagen re-expression in vivo. In the second part of my thesis, I have studied the case of a particular DEB family, in which two affected children presented a DEB much more severe than their mother and maternal grandfather, suffering from a mild form of DDEB. Sequencing of the 118 exons ofCOL7A1 and of their flanking splice sites, lead to the identification of a single dominant mutation c.6698G>A (p.Gly2233Asp) in exon 84, at the heterozygous state in the four individuals. By carrying out analyses on the paternal transcripts, I have identified a novel c.2587+40G>A recessive mutation in intron 19, which activates a cryptic donor splice site in this intron, leading to its partial retention and to the formation of a premature termination codon. I confirmed the presence of this second, recessive, mutation in the DNA of the two affected children, thus providing an explanation for the observed intrafamilial phenotypic variability: the two affected offsprings being compound heterozygotes for a dominant mutation and a recessive mutation in COL7A1. This novel mutation is the deepest intronic mutation found in COL7A1 so far, and emphasizes the importance of studying COL7A1 at the transcripts level to unravel intronic mutations, understand their molecular consequences and their involvement in the development of the disease. In the last part of my thesis, I have started the characterisation of a knock-in murine model of RDEB generated by our laboratory, which mimics some of the phenotypic characteristics of RDEB patients. My thesis work provided the in vivo demonstration of the feasibility of an exon skipping therapeutic approach for COL7A1. This first important step leads to development of proof of concept studies and toxicological studies in different animal models, with the aim of a clinical translation. It also illustrates the pathological splicing alterations that could benefit from similar approaches.

Durant ma thèse, mes recherches se sont principalement portées sur l'identification des propriétés modulaires de la dysferline, une protéine impliquée dans des dystrophies musculaires, afin d'identifier les approches thérapeutiques les plus prometteuses. Mon travail s’est donc orienté selon deux axes de recherche, une approche par « mini-protéines » et une approche par «saut d’exon », toutes deux basées sur des preuves de principe obtenues chez des patients. Nous avons tout d'abord testé une approche de saut d'exon pour l'exon 32 de DYSF. Nous avons pu établir la fonctionnalité de cette protéine tronquée en permettant son expression dans des cellules de patients déficients en dysferline. Ceci a suggéré que le domaine C2D (encodé par les exons 31 à 34) n'est pas essentiel pour la dysferline puisque l'absence d'une partie de celui-ci n'empêche pas sa fonctionnalité. Nous avons dans le même temps analysé les caractéristiques d'autres domaines de la dysferline, en créant des miniprotéines contenant différentes combinaisons de domaines. Nous avons montré que la partie C-terminale de la dysferline (composée des deux derniers domaines C2 et du passage transmembranaire) était essentielle et suffisante pour la fonctionnalité de la dysferline dans le muscle. L'ensemble de ces résultats démontre que certains domaines de la dysferline sont dispensables, ouvrant ainsi la voie à l'étude d'approches de thérapie génique basé sur les minigènes ou le saut d'exon pour les dysferlinopathies. / During my thesis, my researches have mainly concerned the modular properties of dysferlin, a protein involved in muscular dystrophies, in order to identify the most promising therapeutic approaches.My work has been oriented within two research axes, a mini-proteins approach and an exon-skipping approach, both based on proofs of concept obtained in patients. We first tested an exon-skipping approach for the exon 32 of DYSF, based on the identification of a protein lacking the encoded part of this exon, in an asymptomatic person. We have established the functionality of this truncated protein by allowing its expression in dysferlin-deficient patients' cells. This suggests that the C2D domain (encoded by exons 31 to 34) is not essential for dysferlin since the absence of a part of it don't block its functionality.In the same time we analyzed the characteristics of the others domains of dysferlin, by creating miniproteins containing different combinations of domains. By studying the abilities of this constructs, we have showed that the C-ter part of dysferlin (composed of the last C2 domains and the transmembrane domain) was essential and sufficient for the functionality of dysferlin in muscle. All these results demonstrate that several domains of dysferlin are dispensable, paving the way for studying gene therapy approaches, based on minigenes or exon-skipping for dysferlinopathies.

Les dysferlinopathies sont des dystrophies musculaires qui se manifestent par la dystrophie musculaire des ceintures de type 2B (LGMD2B) ou la myopathie de Miyoshi (MM). Elles sont causées par des mutations dans le gène dysferline. La dysferline est une protéine membranaire exprimée dans le muscle squelettique, responsable de la réparation des microlésions du sarcolemme. L’absence d’une telle réparation de la membrane entraîne une atrophie musculaire progressive. Ce travail de thèse explore le potentiel thérapeutique d'une stratégie de modulation d'épissage pour le traitement de la LGMD2B causée par la mutation faux-sens c4022T>C dans l'exon 38 du gène dysferline. Des oligonucléotides et des petits ARN U7 délivrés par un vecteur viral de type adéno-associé ont été utilisés comme outils antisens pour induire un saut d'exon in vitro et in vivo. Ce projet de thèse étudie également la capacité de la dysferline tronquée à se localiser de façon appropriée à la membrane et ainsi la réparer. / Dysferlinopathy is a muscular dystrophy that manifests as two major phenotypes: limb-girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) or Miyoshi myopathy (MM). It is caused by mutations in the dysferlin gene. Dysferlin is a membrane protein expressed in skeletal muscle. It is responsible for the repair of sarcolemma microlesions produced by muscle contractions. A compromised membrane repair leads to slowly progressing muscle wasting. This thesis explores the therapeutic potential of an antisense mediated splice switching strategy in LGMD2B caused by the missense mutation c4022T>C in the exon 38 of the dysferlin gene. Antisense oligonucleotides and U7 snRNAs delivered by an adeno-associated viral vector were used as antisense tools to trigger exon skipping in vitro and in vivo. The thesis investigates also if the truncated dysferlin maintainsa proper membrane localization and its membrane repair ability.

L’objectif était d’évaluer l’efficacité de thérapies développées pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD, due à des mutations du gène de la dystrophine) dans la restauration de déficits cognitifs associés à ce syndrome. Deux pistes thérapeutiques visant à compenser les altérations cérébrales liées à la perte de dystrophine ont été explorées chez les souris mdx, modèle de DMD. Une approche pharmacologique basée sur la surexpression de l’utrophine, homologue de la dystrophine, n’améliore pas les déficits comportementaux des souris mdx. Par contre, une intervention génique basée sur l’épissage de l’exon muté conduit à la restauration d’une dystrophine endogène et une récupération d’altérations cérébrales comme l’agrégation des récepteurs GABAA et la plasticité synaptique hippocampique. Ceci suggère un rôle de la dystrophine dans la plasticité du cerveau adulte et l’applicabilité de cette approche de thérapie génique au traitement des altérations cognitives de la DMD. / Therapies have been developed to treat Duchenne muscular dystrophy (DMD, due to mutation in the dystrophin gene), but their ability to restore the cognitive deficits associated with this syndrome has not been yet studied. We explored two therapeutic approaches to compensate for the brain alterations resulting from the loss of dystrophin in the mdx mouse, a model of DMD. A pharmacological approach based on the overexpression of utrophin, a dystrophin homologue, does not alleviate the behavioural deficits in these mice. In contrast, a genetic intervention based on the splicing of the mutated exon leads to the restoration of endogenous dystrophin and a recovery of brain alterations such as the clustering of GABAA receptors and hippocampal synaptic plasticity in mdx mice. These results suggest a role for dystrophin in adult brain plasticity and indicate that this gene therapy approach is applicable to the treatment of cognitive impairments in DMD.