Les dysferlinopathies sont un groupe de dystrophies musculaires progressives, dues à l’absence ou la déficience de la protéine sarcolemmale Dysferline, codée par le gène DYSF. Il n’existe pas de traitement disponible à l’heure actuelle.Le virus recombinant adeno-associé (AAVr) est actuellement le vecteur le plus approprié pour le transfert de gène dans le muscle squelettique. Cependant, les capacités d’encapsidation du vecteur AAVr sont limitées à ~5kb, ce qui empêche l'encapsidation des gènes de grande taille, comme la Dysferline. Pour contourner cette limitation, d’une part, plusieurs Dysferlines modulaires de taille ⩽ à 4,7kb (minigène) ont été créées et testées, dans le but de rechercher le rôle de domaines spécifiques dans la toxicité, la fonction et les interactions avec les partenaires ainsi que leur intérêt thérapeutique potentiel. Il a été montré que : la restauration de la capacité de réparation membranaire n’est pas suffisante pour améliorer l’histologie musculaire, que le domaine DYSF peut être responsable de la toxicité et que le domaine FER interagit avec la protéine OPTN. D’autre part, une étude comparative de plusieurs techniques de transfert de gène entier de la Dysferline (concatémérisation-épissage, recombinaison homologue dirigée (RDH), stratégie hybride ou assemblage) a montré que la stratégie par RHD est la méthode la plus efficace. L'administration systémique de vecteurs RHD chez des souris Dysferline déficientes est suffisamment efficace pour corriger la pathologie musculaire et augmenter la résistance du sarcolemme aux contraintes mécaniques. Le transfert de vecteurs RHD pourra devenir une approche thérapeutique potentielle pour le traitement de dysferlinopathies. / The dysferlinopathies are a group of untreatable progressive muscular dystrophies, caused by absence or deficiency of the sarcolemmal protein, dysferlin, as a consequence of mutations in DYSF gene. Recombinant adeno-associated virus (rAAV) is currently the most appropriate vector for gene delivery into the skeletal muscle. However, the ~5kb packaging size of this virus is a major obstacle for large gene transfer like dysferlin. To overcome this limitation, several strategies were developed. Firstly, several modular dysferlins (minigene) having a size of about 4.7kb were created and tested, in order to look for: role of specific domains in the toxicity and the function, the interactions with the partners and the therapeutical potential. It was demonstrated, that the restoration of the membrane repair deficit is not sufficient to improve the muscle histology; that the DYSF domain can be responsible for the toxicity and that the domain FER interacts with the protein OPTN. Secondly, several large gene transfer techniques: concatemerization-splicing, overlapping vectors, hybrid dual or fragmented AAV, were compared to deliver the DYSF gene into the skeletal muscle by two rAAV vectors. The rAAVs intramuscular injections into dysferlin deficient mice showed that the overlap strategy is the most effective approach to reconstitute a full-length messenger. The systemic administration of overlapping vectors was efficient to correct the histopathology and resistance to eccentric contractions of muscular fibers in the dysferlin deficient mice. These data indicate that using overlapping vectors could be a promising approach for a potential clinical treatment of dysferlinopathies.

Les dysferlinopathies constituent un groupe de dystrophies musculaires autosomiques récessives comprenantprincipalement la myopathie des ceintures (LGMD) de type 2B et la myopathie distale de Miyoshi. Elles sont causéespar des mutations dans le gène DYSF qui se situe dans la région chromosomique 2p13.1-13.3 (NM_003494). Ce gènecomporte 55 exons répartis sur plus de 230 kb. Il est exprimé principalement dans le muscle squelettique etcardiaque, mais également dans d'autres tissus (placenta...) et types cellulaires tels que lesmonocytes/macrophages. La dysferline (2080 acides aminés, 237 kDa, O75923) fait partie de la famille des Ferlineset comporte 7 domaines C2, senseur de calcium et un domaine transmembranaire C-terminal.La dysferline participe à la formation des tubules-T et à la fusion des myoblastes en myotubes avec lamyoferline (un autre membre de la famille). Elle est localisée au sarcolemme de la fibre musculaire squelettiqueadulte, où elle joue un rôle dans sa réparation. En effet, chez l’homme comme dans les modèles murins, en absencede dysferline, des vésicules, dont la nature n’est pas clairement établie, s’accumulent sous le sarcolemme lésé sansfusionner avec celui-ci. Elle interagirait avec plusieurs protéines membranaires ou cytosoliques, dont certaines(comme la cavéoline 3) sont aussi impliquées dans d’autres formes de LGMD.Au cours de ma thèse, mon travail a été axé d’une part sur l’amélioration des techniques de diagnostic : étudede délétion/duplication dans le gène DYSF par CGH et le développement d’un test permettant d’évaluerl’absence/présence de la dysferline à partir de sang total par des techniques de FACS et d’immunofluorescence.D’autre part j’ai également étudié la pertinence d’approches thérapeutiques. Ainsi, nous avons mis en évidence unelarge délétion homozygote des ¾ du gène DYSF chez une patiente présentant un phénotype modéré dedysferlinopathies. Cette délétion permet cependant la production d’une dysferline tronquée. L’identification decette miniprotéine, la première identifiée à ce jour a permis de mettre en évidence l’aspect en partie modulaire dela dysferline. Une autre donnée sur le caractère modulaire de la dysferline est apparue dans la littérature, cette foismontrant le caractère dispensable de l’exon 32. Sur la base de cette observation clinique, nous avons développéune approche thérapeutique par saut d’exon pour les dysferlinopathies, en démontrant dans un premier temps safaisabilité technique sur l’exon 32.L’ensemble de ces travaux permettront probablement l’amélioration du diagnostic différentiel desdysferlinopathies, tout en fournissant de nouvelles pistes pour comprendre les rôles de la dysferline et offrir ainsides pistes thérapeutiques pour le traitement de patients souffrant de ces pathologies. / Dysferlinopathies are a group of autosomal recessive muscular disorders including mainly limb girdlemuscular dystrophy 2B (LGMD2B) and Miyoshi Myopathy (MM), caused by mutation in DYSF gene (2p13.1-13.3). It is composed by 55 exons spreading on 234 kb of genomic DNA and it is expressed mainly in skeletal and heart muscle and monocytes/macrophages.Dysferlin (2080 amino-acids, molecular weight 237 kDa) belongs to the Ferlin family as Myoferline, which is also expressed in muscle. Dysferlin is involved with Myoferlin in myoblasts fusion and T-tubule formation. In adult skeletal muscle, Dysferlin is localized at the sarcolemma where it plays its main function: the sarcolemma repair after muscular wounding. It has been suggested that Dysferlin allows them to fuse with the plasma membrane in order to provide the required plasma membrane to reseal the wound. During these years, my work was essentially focused on the improvement of diagnosis technique (evaluation of CGH array to detect deletion/duplication event in DYSF gene and development of test able to detect absence/presence of Dysferlin in whole blood), the functional exploration of diagnosis technique (evaluation of CGH array to detect deletion/duplication event in DYSF gene and development of test able to detect absence/presence of Dysferlin in whole blood), and the development of promising therapeutics approaches: AAV gene transfer of a minidysferlin which was identified in patient presenting a mild phenotype and for the first time the demonstration of the feasibility of an exon-skipping therapeutics strategy for dysferlinopathies.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Objective: To report the clinical and muscle biopsy findings from the recessive forms of limb girdle muscular dystrophies (LGMD type 2) seen in the state of CearÃ, Northeast of Brazil. Design: Case series. Setting: Tertiary care clinic, University hospital. Patients and Methods: We studied 41 patients from 32 families with chronic progressive weakness in a limb-girdle distribution seen at a tertiary care hospital. All patients were born in the State of CearÃ. Patients with autossomal dominant pattern or facial involvement were excluded. Muscle biopsies specimens were immunostained for dystrophin, sarcoglycan, dysferlin, myotilin, merosin and emerin on all cases. Results: We found a specific protein deficiency in 24 patients (58.5%) from 20 families. Among these patients 11 (45.8%) had sarcoglycanopathy and 13 (54.2%) had dysferlinopathy and the pattern of inheritance was autosomal recessive or sporadic. Eletrocardiographic changes were seen in 6 (54.5%) patients with sarcoglycanopathy. Conclusion: Sarcoglicanopathies and disferlinopathies represent more than 60% of the cases of families with LGMD type 2 in this series from Northeast Brazil. Immunohistochemistry is still a very important tool for classification of LGMDs if genetic testing is not available or limited. Further studies are necessary to characterize the genetic background of the different LGMD families and to further characterize the other subtypes of LGMD type 2 in Brazil. / Objetivo: CaracterizaÃÃo clÃnica e de achados da biÃpsia muscular de formas recessivas de distrofias musculares de cinturas (DMPC tipo 2) no Estado do CearÃ, Nordeste do Brasil. Desenho: SÃrie de casos. Local: Hospital universitÃrio; atendimento terciÃrio. Pacientes e mÃtodos: Foram estudados 41 pacientes de 32 famÃlias com fraqueza crÃnica progressiva em distribuiÃÃo de cinturas atendidos em hospital terciÃrio. Todos os pacientes nasceram no Estado do CearÃ. Pacientes com padrÃo de heranÃa autossÃmico dominante ou com fraqueza facial foram excluÃdos. Os espÃcimes das biÃpsias musculares foram imunomarcados para distrofina, sarcoglicano, disferlina, miotilina, merosina e emerina em todos os casos. Resultados: Foi encontrado um padrÃo especÃfico de deficiÃncia protÃica em 24 pacientes (58,5%) de 20 famÃlias. Entre estes pacientes 11 (45,8%) tinham sarcoglicanopatia e 13 (54,2%) tinham disferlinopatia e o padrÃo de heranÃa foi recessivo ou esporÃdico. AlteraÃÃes eletrocardiogrÃficas foram observadas em 6 (54,5%) pacientes com sarcoglicanopatia. ConclusÃo: Sarcoglicanopatias e disferlinopatias representam mais de 60% dos casos de famÃlias com DMPC tipo 2 nesta sÃrie do Nosrdeste brasileiro. ImunohistoquÃmica ainda à uma ferramenta muito importante para classificaÃÃo das DMPCs se o teste genÃtico nÃo està disponÃvel ou à limitado. Estudos futuros sÃo necessÃrios para caracterizar o perfil genÃtico de diferentes famÃlias com DMPC, bem como caracterizar outros subtipos de DMPC tipo 2 no Brasil.

Les dysferlinopathies sont des dystrophies musculaires qui se manifestent par la dystrophie musculaire des ceintures de type 2B (LGMD2B) ou la myopathie de Miyoshi (MM). Elles sont causées par des mutations dans le gène dysferline. La dysferline est une protéine membranaire exprimée dans le muscle squelettique, responsable de la réparation des microlésions du sarcolemme. L’absence d’une telle réparation de la membrane entraîne une atrophie musculaire progressive. Ce travail de thèse explore le potentiel thérapeutique d'une stratégie de modulation d'épissage pour le traitement de la LGMD2B causée par la mutation faux-sens c4022T>C dans l'exon 38 du gène dysferline. Des oligonucléotides et des petits ARN U7 délivrés par un vecteur viral de type adéno-associé ont été utilisés comme outils antisens pour induire un saut d'exon in vitro et in vivo. Ce projet de thèse étudie également la capacité de la dysferline tronquée à se localiser de façon appropriée à la membrane et ainsi la réparer. / Dysferlinopathy is a muscular dystrophy that manifests as two major phenotypes: limb-girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) or Miyoshi myopathy (MM). It is caused by mutations in the dysferlin gene. Dysferlin is a membrane protein expressed in skeletal muscle. It is responsible for the repair of sarcolemma microlesions produced by muscle contractions. A compromised membrane repair leads to slowly progressing muscle wasting. This thesis explores the therapeutic potential of an antisense mediated splice switching strategy in LGMD2B caused by the missense mutation c4022T>C in the exon 38 of the dysferlin gene. Antisense oligonucleotides and U7 snRNAs delivered by an adeno-associated viral vector were used as antisense tools to trigger exon skipping in vitro and in vivo. The thesis investigates also if the truncated dysferlin maintainsa proper membrane localization and its membrane repair ability.