Techn. Universiẗat, Diss., 2005--Dresden.

The biogenesis of spliceosomal UsnRNPs is a highly elaborate cellular process that occurs both in the nucleus and the cytoplasm. A major part of the process is the assembly of the Sm-core particle, which consists of a ring shaped heptameric unit of seven Sm proteins (SmD1•D2•F•E•G•D3•B) wrapped around a single stranded RNA motif (termed Sm-site) of spliceosomal UsnRNAs. This process occurs mainly in the cytoplasm by the sequential action of two biogenesis factors united in PRMT5- and SMN-complexes, respectively. The PRMT5-complex composed of the three proteins PRMT5, WD45 and pICln is responsible for the symmetric dimethylation of designated arginine residues in the C-terminal tails of some Sm proteins. The action of the PRMT5- complex results in the formation of assembly incompetent Sm-protein intermediates sequestered by the assembly chaperone pICln (SmD1•D2•F•E•G•pICln and pICln•D3•B). Due to the action of pICln, the Sm proteins in these complexes fail to interact with UsnRNAs to form the mature Sm-core. This kinetic trap is relieved by the action of the SMN-complex, which removes the pICln subunit and facilitates the binding of the Sm-core intermediates to the UsnRNA, thus forming the mature Sm-core particle. The human SMN complex consists of 9 subunits termed SMN, Gemin2-8 and Unrip. So far, there are no available atomic structures of the whole SMN-complex, but structures of isolated domains and subunits of the complex have been reported by several laboratories in the past years. The lack of structural information about the entire SMN complex most likely lies in the biophysical properties of the SMN complex, which possesses an oligomeric SMN core, and many unstructured and flexible regions. These were the biggest roadblocks for its structural elucidation using traditional methods such as X-ray crystallography, NMR or CryoEM. To circumvent these obstacles and to obtain structural insight into the SMN-complex, the Schizosaccharomyces pombe SMN complex was used as a model system in this work. In a collaboration with the laboratory of Dr. Remy Bordonne (IGMM, CNRS, France), we could show that the SpSMN complex is minimalistic in its composition, consisting only of SpSMN, SpGemin2, SpGemin8, SpGemin7 and SpGemin6. Using biochemical experiments, an interaction map of the SpSMN complex was established which was found to be highly similar to the reported map of the human SMN complex. The results of this study clearly show that SpSMN is the oligomeric core of the complex and provides the binding sites for the rest of the subunits. Through biochemical and X-ray scattering experiments, the properties of the SpSMN subunit such as oligomerization viii and intrinsic disorder, were shown to determine the overall biophysical characteristics of the whole complex. The structural basis of SpSMN oligomerization is presented in atomic detail which establishes a dimeric SpSMN as the fundamental unit of higher order SpSMN oligomers. In addition to oligomerization, the YG-box domain of SpSMN serves as the binding site for SpGemin8. The unstructured region of SpSMN imparts an unusual large hydrodynamic size, intrinsic disorder, and flexibility to the whole complex. Interestingly, these biophysical properties are partially mitigated by the presence of SpGemin8•SpGemin7•SpGemin6 subunits. These results classify the SpSMN complex as a multidomain entity connected with flexible linkers and characterize the SpSMN subunit to be the central oligomeric structural organizer of the whole complex. / Die Biogenese von spliceosomalen UsnRNPs ist ein hochkomplexer zellulärer Prozess, der sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma stattfindet. Ein Hauptteil dieses Prozesses ist der Aufbau des Sm-Kernpartikels, der aus einem ringförmigen Heptamer aus sieben Sm-Proteinen (SmD1 · D2 · F · E · G · D3 · B) besteht, die um ein einzelsträngiges RNA-Motiv (das auch als Sm-Stelle bezeichnet wird) der spliceosomalen U snRNAs gewickelt ist. Dieser Prozess findet hauptsächlich im Zytoplasma durch die sequenzielle Wirkung von zwei Biogenesefaktoren statt, den PRMT5 und den SMN-Komplexen. Der PRMT5-Komplex besteht aus den drei Proteinen PRMT5, WD45 und pICln und ist für die symmetrische Dimethylierung bestimmter Argininreste in den C-terminalen Schwänzen einiger Sm-Proteine verantwortlich. Die Wirkung des PRMT5-Komplexes führt zur Bildung von inkompetenten Sm-Protein-Intermediaten, die durch das Assemblierungs-Chaperon pICln (SmD1 · D2 · F · E · G · pICln und pICln · D3 · B) sequestriert werden. Aufgrund der Wirkung von pICln interagieren die Sm-Proteine in diesen Komplexen nicht mit den U snRNAs, um den reifen Sm-Kern zu bilden. Diese kinetische Falle wird durch die Wirkung des SMN-Komplexes aufgelöst, der die pICln-Untereinheit entfernt und die Bindung der Sm-Core-Zwischenprodukte an die U snRNA erleichtert, wodurch der reife Sm-Core-Partikel gebildet wird. Der menschliche SMN-Komplex besteht aus 9 Untereinheiten, die als SMN, Gemin2-8 und Unrip bezeichnet werden. Bisher sind keine atomaren Strukturen des gesamten SMN-Komplexes verfügbar, aber Strukturen isolierter Domänen und Untereinheiten des Komplexes wurden in den letzten Jahren von mehreren Laboratorien beschrieben. Der Mangel an strukturellen Informationen über den gesamten SMN-Komplex liegt höchstwahrscheinlich in den biophysikalischen Eigenschaften des SMN-Komplexes, der einen oligomeren SMN-Kern und viele unstrukturierte und flexible Regionen besitzt. Dies waren die größten Hindernisse für die Strukturaufklärung mit traditionellen Methoden wie Röntgenkristallographie, NMR oder CryoEM. Um diese Hindernisse zu umgehen und strukturelle Einblicke in den SMN-Komplex zu erhalten, wurde in dieser Arbeit der SMN-Komplex von Schizosaccharomyces pombe als Modellsystem verwendet. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Remy Bordonne (IGMM, CNRS, Frankreich) konnten wir zeigen, dass der SpSMN-Komplex in seiner Zusammensetzung minimalistisch ist und nur aus SpSMN, SpGemin2, SpGemin8, SpGemin7 und SpGemin6 besteht. Mit biochemischer Experimenten wurde eine x Interaktionskarte des SpSMN-Komplexes erstellt, die der bekannten Karte des menschlichen SMN-Komplexes sehr ähnlich war. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich, dass SpSMN der oligomere Kern des Komplexes ist und die Bindungsstellen für den Rest der Untereinheiten bereitstellt. Durch biochemische und Röntgenstreuungsexperimente wurde gezeigt, dass die Eigenschaften der SpSMNUntereinheit wie Oligomerisierung und intrinsische Störung die gesamten biophysikalischen Eigenschaften des gesamten Komplexes bestimmen. Die strukturelle Basis der SpSMN-Oligomerisierung wird atomar detailliert dargestellt, wodurch ein dimeres SpSMN als zentrale Grundeinheit der SpSMN-Oligomere höherer Ordnung festgelegt wird. Zusätzlich zur Oligomerisierung dient die YG-Box- Domäne von SpSMN als Bindungsstelle für SpGemin8. Die unstrukturierte Region von SpSMN verleiht dem gesamten Komplex eine ungewöhnlich große hydrodynamische Größe, intrinsische Unordnung und Flexibilität. Interessanterweise werden diese biophysikalischen Eigenschaften teilweise durch das Vorhandensein von SpGemin8 • SpGemin7 • SpGemin6-Untereinheiten gemindert. Diese Ergebnisse klassifizieren den SpSMN-Komplex als eine mit flexiblen Wechselwirkungen verbundene Multidomäneneinheit und charakterisieren die SpSMN-Untereinheit als den zentralen oligomeren Strukturorganisator des gesamten Komplexes.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / Les cassures double-brin de l'acide désoxyribonucléique (ADN) sont parmi les lésions les plus cytotoxiques car une seule lésion non réparée est létale chez la levure. Dans le but de réparer efficacement ces dommages, la cellule dispose de différents mécanismes tels que le Non Homologous End Joining (NHEJ). Toutefois ces mécanismes peuvent causer des mutations et, lorsqu' il est possible, la cellule privilégie un système qui permet une réparation très fiable: la recombinaison homologue. Ce processus peut aussi être utilisé lors de la méiose pour créer de la diversité génétique. La méiose est un mécanisme complexe et une mauvaise régulation peut mener à des problèmes tels que l' aneuploïdie. La recombinaison homologue méiotique se divise en quatre étapes majeures: (i) l' initiation qui crée des cassures double-brin par un complexe muItiprotéique incluant Rec12; (ii) la résection de l'ADN ou les protéines majeures sont Rad32/Rad50/Nbsl; (iii) l'invasion d'un duplex homologue avec les protéines RadSl et Dmcl, et pour terminer (iv) la résolution des jonctions de Holliday. Lors de mes études de doctorat, je me suis concentré sur la caractérisation biochimique des principales protéines des trois premières étapes (initiation, résection et particulièrement l'invasion) de la recombinaison méiotique chez Schizosaccharomyces pombe permettant la réparation des cassures double-brin. Mes travaux avaient pour but de caractériser les protéines Dmcl et le complexe Hop2/Mndl chez S.pombe. Nous avons déterminé que Dmcl avait comme Rad 51 la capacité de former un filament hélical sur l'ADN simple brin, ansi que de catalyser des réactions d'échange de brin. D'autre part j'ai mis en évidence le rôle que joue le complexe Hop2/Mndl dans la stimulation de Dmc 1, ainsi que les différences entre les protéines de S.pombe et de la SOurIS.

Le complexe cohésine maintient associées les chromatides sœurs depuis la réplication jusqu’à leur ségrégation en mitose. Une question majeure est de comprendre comment la cohésion est établie lors de la phase S. Chez les mammifères et S. pombe, les cohésines sont associées de manière labile aux chromosomes pré-réplicatifs et l’établissement de la cohésion en phase S s’accompagne de la stabilisation de l’association des cohésines aux chromosomes. L’objectif de ce travail est de comprendre comment la dynamique des cohésines est régulée et comment son inhibition créée la cohésion.En G1 les cohésines associées aux chromosomes s’échangent avec le pool soluble et leur dissociation dépend de Pds5 et Wapl. La première partie de ce travail présente les résultats d’un crible génétique visant à identifier de nouveaux régulateurs de la dynamique des cohésines.L’établissement de la cohésion nécessite l’acétyltransférase Eso1 mais pas en contexte Δwpl1, indiquant que la seule mais essentielle fonction d’Eso1 est de s’opposer à celle de Wapl. L’acétylation de Smc3 par Eso1 contribue mais n’est pas suffisante pour contrecarrer Wapl, suggérant l’existence d’un autre événement dépendant d’Eso1. En G1, Pds5 agit avec Wapl pour dissocier les cohésines des chromosomes mais après la phase S, Pds5 est requise pour leur maintien sur les chromosomes et pour la cohésion à long terme. Pds5 co-localise avec la fraction stable de cohésines mais pas Wapl. Nous suggérons un modèle dans lequel la cohésion est créée par deux événements d’acétylation couplés à la progression de la fourche de réplication conduisant à l’éviction de Wapl des cohésines destinées à produire la cohésion. / Following DNA replication, sister chromatids are connected by cohesin to ensure their correct segregation during mitosis. How cohesion is created is still enigmatic. The cohesin subunit Smc3 becomes acetylated by ECO1, a conserved acetyl-transferase, and this change is required for cohesion. As in mammals, fission yeast cohesin is not stably bound to G1 chromosomes but a fraction becomes stable when cohesion is made. The aim of this work was to understand how cohesin dynamics is regulated and how the change in cohesin dynamics creates cohesion.In G1 chromatin bound cohesin exchange with the soluble pool and the unloading reaction relies in part on Wapl. The first part of this study reports on the identification of G1/S factors as new candidate regulators of cohesin dynamics.Following S phase a stable cohesin fraction is made. The acetyl-transferase Eso1 is not required for this reaction when the wpl1 gene is deleted. Yet, it is in wild-type cells, showing that the sole but essential Eso1 function is counteracting Wapl. Eso1 acetylates the cohesin sub-unit Smc3. This renders cohesin less sensitive to Wapl but does not confer the stable binding mode, suggesting the existence of a second Eso1-dependent event. The cohesin sub-unit Pds5 act together with Wapl to promote cohesin removal from G1 chromosomes but after S phase Pds5 is essential for cohesin retention on chromosomes and long term cohesion. Pds5 co-localizes with the stable cohesin fraction whereas Wapl does not. We suggest a model in which cohesion establishment is made by two acetylation events coupled to fork progression leading to Wapl eviction while keeping Pds5 on cohesin complexes intended to make cohesion.

RNA interference (RNAi) is a conserved pathway that plays key roles in heterochromatin formation, gene regulation and genome surveillance across a wide range of eukaryotes. One of the most utilised model organisms for studying the RNAi pathway is the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. However, this species is somewhat atypical, in that it has not retained the ancestral role for RNAi in the silencing of mobile genetic elements. In contrast, the related fission yeast S. japonicus has a large and diverse retrotransposon complement that appears to give rise to abundant siRNAs. For this reason, we believe that S. japonicus may be a more suitable model for studying the role of RNAi in silencing mobile genetic elements, a function that is conserved in many higher eukaryotes. Functional analysis of the S. japonicus RNAi pathway proved more challenging than expected, as it was generally not possible to recover strains bearing deletions of core RNAi components (Ago1/Clr4/Rdp1/Arb1/Arb2). This suggests that a functional RNAi pathway may be required for viability in S. japonicus, unlike in S. pombe. However, disruption mutants were isolated for the sole Dicer ribonuclease Dcr1, at very low frequency. Analysis of these mutants revealed that disruption of Dcr1 impaired the generation of retrotransposon derived siRNAs, and caused de-repression of retroelement transcript accumulation and mobilisation in an element dependent manner. Surprisingly however, Dcr1 appeared dispensable for the maintenance of H3K9me2 at transposons, suggesting that, in contrast to S. pombe, silencing may occur principally at the post-transcriptional level. It is also possible that the isolated Dcr1 mutants represent rare survivors that are viable due to the presence of suppressor mutations elsewhere in the genome. I utilised my genome wide RNA sequencing data to help improve the annotation of the S. japonicus genome, with a specific focus on the retrotransposon complement. From this, I identified 12 new families of LTR retrotransposon, which increased the annotated retrotransposon complement by around 40% in S. japonicus. Finally, I characterised the integrative preference of the S. japonicus retrotransposon Tj1, and found that it shares characteristics associated with the S. cerevisiae retrotransposons Ty1 and Ty3, mostly integrating upstream of RNA PolIII transcribed tRNA genes. The findings of this work highlight some potentially key differences in the way the RNAi pathway functions across the fission yeast clade, both in terms of its importance for viability and its mode of action. The work undertaken here also contributes to the establishment of S. japonicus as a model for the study of RNA interference and genome regulation.

Las especies reactivas del oxígeno (ROS), superóxido (O2o-), peróxido de hidrógeno (H2O2), y radical hidroxilo (OHo), se generan a partir de la reducción parcial del oxígeno molecular durante procesos metabólicos como la respiración o tras la exposición a ciertos agentes ambientales como las radiaciones UV. Estas ROS pueden reaccionar con biomoléculas como lípidos, proteínas y DNA e inactivar su función, por lo que las células han desarrollado actividades enzimáticas que se encargan de mantener niveles no-tóxicos de estos oxidantes. Se llama estrés oxidativo a la situación en la cual se produce un incremento en la concentración intracelular de ROS como consecuencia de un aumento en la generación o una disminución en la degradación de las mismas. En respuesta a estrés oxidativo, la célula activa rutas de señalización y factores de transcripción específicos que activan la expresión de proteínas antioxidantes encargadas de reestablecer los niveles redox intracelulares y de reparar los desperfectos causados por estos oxidantes. La levadura Schizosaccharomyces pombe es un organismo modelo ideal para el estudio de las respuestas a estrés oxidativo en las células eucariotas ya que posee sensores específicos a estrés oxidativo como el factor de transcripción Pap1 (pombe AP-1-like) y rutas de respuesta global a estrés, como las descritas en las células de mamífero, que son activadas por diferentes tipos de estrés. En el centro de esta ruta de respuesta global a estrés se encuentra la MAPK (Mitogen-activated protein kinase) Sty1. El factor de transcripción Pap1, de localización citoplasmática basal, se acumula en el núcleo en respuesta a estrés oxidativo. Este cambio de localización subcelular es debido a la inhibición del exporte nuclear dependiente de Crm1, aunque se desconocía el mecanismo molecular utilizado por este factor de transcripción para sensar y responder a oxidantes como H2O2 y dietilmaleto (DEM). Los resultados obtenidos indican que H2O2 oxida de forma reversible dos residuos de cisteína de Pap1 induciendo, seguramente, la formación de un puente disulfuro intramolecular, mientras que, DEM actúa como un agente alquilante que modifica de forma irreversible los residuos de cisteína del dominio C-terminal de Pap1. El gen que codifica para el factor de transcripción Pap1 fue aislado inicialmente como un gen que, en elevado número de copias, confería a las células un fenotipo de resistencia a ciertas drogas como estaurosporina. Esto es debido a que, tras acumularse en el núcleo en respuesta a estrés oxidativo, Pap1 activa la transcripción de genes implicados tanto en la respuesta antioxidante como en la resistencia a multidrogas. Todos aquellos genes que, al igual que pap1 fueron identificados por su implicación en la resistencia a multidrogas, codifican para proteínas que regulan la actividad del factor de transcripción Pap1. hba1 fue el único gen relacionado con resistencia a multidrogas, cuyo producto génico, una proteína con un dominio de unión a Ran (Ran-binding domain), Hba1, no había sido relacionado con la actividad de Pap1. Uno de los objetivos de mi trabajo experimental era el de determinar si Hba1 tenía un papel en la regulación de la actividad de Pap1. Nuestros resultados indican que la proteína Hba1, localizada en el nucleoplasma de la célula, participa en el exporte nuclear mediado por Crm1 de ciertas proteínas como el factor de transcripción Pap1 y la MAPK Sty1, aunque no de otras como la proteína PKI. Por ello, la pérdida de función de Hba1, por sobreexpresión o deleción del gen hba1, induce la localización nuclear constitutiva de Pap1 y Sty1 en ausencia de estrés. Esta localización nuclear de Pap1 es suficiente para la activación transcripcional de sus genes diana. Por lo tanto, el fenotipo de resistencia aumentada a multidrogas de las cepas en las que se ha perdido la actividad de la proteína Hba1, es debido a la acumulación de Pap1 en el núcleo en condiciones de no-estrés.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 6 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2010.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2010.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der genetischen Optimierung der Spalthefe S. pombe für die biotechnologische Produktion von Fremdproteinen. Hierbei werden vor allem zwei Aspekte näher untersucht, zum einen die Stabilität des zu produzierenden Proteins und zum anderen die Bildung von Disulfidbrücken. Von anderen Organismen ist bekannt, dass die N-terminale AS im Verbund mit einem Lysinrest ein Protein destabilisieren kann. Das Modellprotein vVEGF besitzt an Position 2 einen Lysinrest (K2) und damit ein Hauptmerkmal eines derartigen Destabilisierungselementes. Falls das Protein dem Ubiquitin-vermittelten Abbau unterliegt, ist es wahrscheinlich, dass K2 eine essenzielle Rolle für die Stabilität dieses Proteins spielt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass K2 in S. cerevisiae destabilisierend wirkt, während es in S. pombe keinen destabilisierenden Effekt hat. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass es Unterschiede im Ubiquitin-vermittelten Abbau von Proteinen in diesen beiden Hefen gibt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Analyse und Optimierung der Bildung von Disulfidbrücken in S. pombe. Disulfidbrücken stellen eines der wichtigsten Elemente der korrekten Proteinfaltung dar und werden in Eukaryonten vorwiegend im oxidierenden Milieu des ER in das naszierende Protein eingeführt. Aus diesem Grunde wurden Proteindisulfid-isomerasen (PDIs) und ER-oxidoreduktin (Ero)-ähnliche Proteine, die die Schlüssel-komponenten der Bildung von Disulfidbrücken in Eukaryonten darstellen, näher untersucht. In S. pombe finden sich insgesamt drei PDI-Homologe (SpPdi1p, SpPdi2p und SpPdi3p) sowie zwei Ero-Homologe (SpEro1a p und SpEro1b p). Mit Ausnahme des nicht glycosylierten SpPdi2p, sind alle Proteine Membran-assoziierte glycosylierte Komponenten des ER. SpPdi2p und SpPdi3p sowie SpEro1a p und SpEro1b p liegen in vivo teilweise in oxidiertem Zustand vor. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass SpEro1b p, nicht jedoch SpEro1a p in der Lage ist, die temperatursensitive S. cerevisiae ero1-1-Mutante funktionell zu komplementieren. Interessanterweise ergab die Untersuchung konservierter Cysteine mittels gerichteter Mutagenese einerseits Unterschiede zwischen SpEro1a p und SpEro1b p sowie andererseits zwischen den S. pombe Ero-Proteinen und den Ero-Proteinen anderer Spezies. Im Gegensatz zu Ero1b p wird Ero1a p durch reduzierenden Stress und Hitzestress induziert. Dies deutet darauf hin, dass SpEro1b p für die Bildung von Disulfidbrücken unter normalen Wachstumsbedingungen nötig ist, während SpEro1a p vornehmlich bei der Adaption der Zellen an Stressbedingungen erforderlich ist. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte Expression von SpEro1a p und SpEro1b p zu einer deutlich erhöhten Ausbeute des disulfidhaltigen heterologen Proteins Orf19p-HA führt. Dieser Befund impliziert, dass in S. pombe die Oxidation der Disulfidbrücken für die Faltung von Proteinen vermutlich limitierend ist.