Une étude précédente visant à mieux comprendre le rôle et le contexte cellulaire dans lequel la ribonucléase Dicer (Dcrl) évolue nous a permis d'identifier des protéines pouvant être régulées par un mécanisme post-transcriptionnel impliquant Dcrl et la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) chez Schizosaccharomyces pombe. Parmi ces protéines se trouvaient trois enzymes impliquées dans la voie de la glycolyse. Nous avons tenté de caractériser le mécanisme et l'implication fonctionnelle de leur régulation en effectuant des expériences de FACS combinées à l'utilisation d'un système de gène rapporteur basé sur la « Green fluorescent protein » et en effectuant des tests de croissance, respectivement. La régulation de la voie de la glycolyse ne semble pas nécessaire à la croissance des levures, ce qui suggère la présence de mécanismes compensatoires. L'étude précédente nous avait également permis d'identifier la protéine ribosomale L12 comme interacteur potentiel de Dcrl pouvant être impliqué dans sa régulation. Nous avons tenté de comprendre le rôle de L12 dans cette régulation en confirmant son interaction avec Dcrl et en caractérisant l'aspect fonctionnel de cette interaction en produisant des lignées délétionnelles de L12. La localisation intracellulaire de la protéine L12 nous permet de croire qu'elle pourrait amener Dcrl dans des structures spécifiques du cytosol, où elle pourrait jouer un rôle dans la régulation génique post-transcriptionnelle. Ce rôle demande toutefois à être confirmé.

Chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) est un mécanisme endogène de régulation génique transcriptionnelle et posttranscriptionnellc médié par de petits acides ribonucleiques (ARN) non-codants générés par la ribonucléase III Dicer (Dcrl). Le rôle et la fonction de Dcrl, cependant, demeure méconnus. Une étude réalisée au laboratoire a précédemment permis l'identification, par une analyse en spectrométrie de masse, de la protéine Byr3 dans des immunoprécipitats de Dcrl. Cette observation suggère la possibilité que Byr3 interagisse avec Dcrl et qu'elle soit impliquée dans la voie de l'iARN. L'homologue de Byr3 chez l'humain est la protéine CNBP, « ccllular nuclcic acid binding protein ». L'interaction entre CNBP et Dicer est donc également envisageable. L'objectif principal de mon travail est de déterminer si la protéine Byr3 et son homologue humain peuvent interagir avec la ribonucléase Dicer, et ainsi être impliquées dans la voie de l'iARN. Chez S. pombe, la création de lignées mutées et d'outils moléculaires a permis d'étudier la protéine Byr3. Chez l'humain, des approches de microscopic par immunofluorescenec et de co-immunoprécipitation (co-IP) ont permis de définir une interaction entre la CNBP et Dicer. Notre travail pave la voie à une caractérisation plus approfondie de l'importance et de la signification de l'interaction entre Byr3 et Dcrl dans la voie de l'iARN / In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), the RNA interference (RNAi) pathway is an endogenous mechanism of transcriptional and posttranscriptional gene regulation by non-coding small ribonuclcic acids (RNAs) generated by the ribonuclease III Dicer (Dcr1). The role and function of Dcr1 though remains unclear. A previous study in our laboratory allowed the identification, by mass spectroscopy, of the Byr3 protein in Dcr1 immunoprecipitates. This observation suggests the possibility that Byr3 interacts with Dcr1 and is involved in the RNAi pathway. The main objective of my project was to define whether Byr3 and its human homolog, the cellular nucleic acid binding protein, (CNBP), can interact with the ribonuclease Dicer and be implicated in the RNAi pathway. In S. pombe, the creation of mutated strains and molecular tools allowed the study of the protein Byr3. In the human cellular model, methods of immunofluorescence microscopy and co-immunoprecipitation allowed the delineation of an interaction between CNBP and Dicer. Our study paves the way to an in-depth characterization of the importance and significance of the interaction between Byr3 and Dcr1 in the RNAi pathway.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2009. / Härtill 4 uppsatser.

The DNA replication checkpoint transcriptionally up-regulates genes that allow cells to adapt to and survive replication stress. Our results show that, in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, the replication checkpoint regulates the entire G1/S transcriptional program by directly regulating MBF (aka DSC1), the G1/S transcription factor. Instead of initiating a checkpoint-specific transcriptional program, the replication checkpoint targets MBF to maintain the normal G1/S transcriptional program during replication stress. We propose a mechanism for this regulation, based on in vitrophosphorylation of the Cdc10 subunit of MBF by the Cds1 replication-checkpoint kinase. Substitution of two potential phosphorylation sites with phospho-mimetic amino acids suffice to promote the checkpoint transcriptional program, suggesting that Cds1 phosphorylation directly regulates MBF-dependent transcription. The conservation of MBF between fission and budding yeast, and recent results implicating MBF as a target of the budding yeast replication checkpoint, suggest that checkpoint regulation of the MBF transcription factor may be a conserved strategy for coping with replication stress. Furthermore, the structural and regulatory similarity between MBF and E2F, the metazoan G1/S transcription factor, suggests that this checkpoint mechanism may be broadly conserved among eukaryotes. Our result shows that both the replication checkpoint and the S-phase DNA damage checkpoint are involved in activating MBF regulated S-phase gene transcription and that this coordinated transcriptional response is beneficial for survival during replication stress. I demonstrate that the beneficial role of the transcriptional response during checkpoint activation is mediated by three major MBF transcripts: cdc22, mrc1 and mik1. Mrc1 dependent stabilization of stalled fork is important during S phase arrest. However, cells ability to prevent mitosis (Mik1 dependent) along with stable fork (Mrc1 dependent) both are crucial for survival. Our data also suggest that the level of Cdc22 is a determining factor for replication checkpoint activation and when over-expressed can alleviate the effects not only in HU but also in MMS.

Une fraction non négligeable de protéines qui contrôlent la dynamique de la chromatine et la transcription est conservée au cours de l'évolution chez les eucaryotes. Ces protéines se retrouvent dérégulées dans de nombreuses maladies, dont les cancers. Dans cette étude, nous avons exploité la purification de deux protéines associées à la chromatine pour étudier de nouveaux acteurs impliqués dans la réduction au silence (ou silencing) de la transcription au sein de l'hétérochromatine et/ou de l'euchromatine chez la levure Schizosaccharomyces pombe, un modèle de référence pour la biologie de la chromatine.Mmi1 est un facteur de liaison à l'ARN capable de guider la formation d'hétérochromatine facultative sur des gènes méiotiques. Parmi les protéines partenaires de Mmi1, nous nous sommes intéressés à Ccr4-Not, un complexe multifonctionnel, conservé de la levure à l'Homme, important pour la maturation de l'extrémité 3' des ARNs et pour le contrôle de l'expression des gènes. Nos travaux montrent que Ccr4-Not est également nécessaire pour le dépôt de la marque H3K9 méthylée aux gènes cibles de Mmi1, ainsi que pour le silencing de la transcription au sein de l'hétérochromatine constitutive, indépendamment de Mmi1.En parallèle, nous avons étudié deux nouveaux partenaires potentiels de RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), un complexe nécessaire à la formation de l'hétérochromatine et l'inactivation de gène. Ces partenaires agiraient à l'interface entre la régulation de la chromatine et de la transcription. Le premier partenaire est l'histone chaperonne Spt6. Une caractérisation initiale entreprise sur Spt6 a montré son rôle crucial dans le silencing des gènes à l'hétérochromatine constitutive et facultative. Le second partenaire est Abo1, une histone chaperonne putative et homologue à la protéine humaine ATAD2, une protéine exprimée dans de nombreuses tumeurs et considérée comme une cible prometteuse pour le traitement de certains cancers, bien qu'à ce jour il n'y ait que peu d'information disponible sur sa fonction moléculaire. Nous avons dans un premier temps montré qu'Abo1 est nécessaire pour le silencing de la transcription au sein de l'hétérochromatine constitutive. Cependant, l'analyse du transcriptome des cellules abo1Δ a montré qu'Abo1 est également nécessaire au silencing transcriptionel de nombreux gènes codant et non-codant localisés dans l'euchromatine. Par la suite, nous avons purifié Abo1 et identifié par spectrométrie de masse le réseau des protéines qui lui est associé. Cette approche protéomique a montré qu'Abo1 est connectée à de nombreuses protéines impliquées dans le contrôle de la transcription, comme des histones chaperonnes et des complexes de remodelage ATP-dépendant de la chromatine. Enfin, nous avons montré que le défaut de croissance sévère observé dans les cellules abo1Δ est complètement rétabli par l'expression de ATAD2 humain. Ce dernier résultat indique que la caractérisation fonctionnelle d'Abo1, entreprise dans la levure, a le potentiel de fournir des informations importantes sur la fonction moléculaire non seulement d'Abo1, mais aussi d'ATAD2 et de son lien avec les cancers.En résumé, nos résultats permettent une meilleure compréhension de la fonction de trois acteurs impliqués dans le silencing de la transcription chez la levure fissipare. De plus, la caractérisation plus approfondie d'Abo1 pourrait grandement contribuer à élucider la fonction d'ATAD2 et de son rôle dans les cancers. / A sizeable fraction of proteins controlling chromatin dynamics and transcription are conserved throughout eukaryotes and are deregulated in many diseases, including cancer. In this study, we exploited the purification of two chromatin-associated proteins to characterize new actors in the context of euchromatic and/or heterochromatic gene silencing in Schizosaccharomyces pombe, a reference model for the biology of chromatin.Mmi1 is an RNA binding factor that can guide the formation of facultative heterochromatin assembly at meiotic genes. Among new proteins interacting with Mmi1, we examined the function of Ccr4-Not, which is a conserved multifunctional complex processing 3'ends of RNAs and regulating gene expression. We found that Ccr4-Not is also required for the deposition of H3K9 methylation mark at Mmi1 target genes and for gene silencing in a Mmi1-independent manner at constitutive heterochromatin.In parallel, we studied two new potential partners of RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), a complex required for heterochromatin formation and gene silencing. Both partners are believed to act at the interface between chromatin and transcription regulation. The first one is the histone chaperone Spt6. An initial functional characterization conducted on this protein showed its implication in gene silencing, both at constitutive and facultative heterochromatin. The second one is Abo1, a putative histone chaperone which is homologue to human ATAD2 protein, a male germ factor ectopically expressed in many tumors and considered as a promising target for cancer therapy, although little is known about its molecular function. We first showed that Abo1 is necessary for proper heterochromatin gene silencing at constitutive heterochromatin. However, transcriptomic analysis of abo1∆ cells further extended Abo1's function in gene silencing to protein-coding and non-coding regions within euchromatin. In addition, we purified Abo1 and identified by mass spectrometry the network of its associated proteins. This proteomic approach showed that Abo1 is connected to several chromatin- and transcription-linked proteins, such as histone chaperones and ATP-dependent chromatin remodeling complexes. Finally, we demonstrated that the severe growth defect observed in abo1Δ is completely rescued by the expression of human ATAD2. This later finding indicates that the functional characterization of Abo1 in yeast has the potential to provide important insights into the molecular function not only of Abo1, but also of the cancer linked ATAD2 protein.Altogether, our results permitted a better understanding of three actors involved in chromatin-based gene silencing in fission yeast. In addition, a further characterization of Abo1 may contribute elucidating the function of ATAD2 and its role in cancer.

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has become a powerful model system for studying cytokinesis, a process of cytoplasmic division by which one cell divides into two identical daughter cells. Like mammalian cells, S. pombe divides through the use of an actomyosin contractile ring, which is composed of a set of highly conserved cytoskeletal proteins. Cytokinesis in S. pombe is primarily regulated by the SIN pathway, which is activated in late mitosis and is required for actomyosin contractile ring and septum assembly, and also plays a role in spindle checkpoint inactivation, and telophase nuclear positioning. The various functions of the SIN are carried out by the terminal kinase in the pathway called Sid2. The lack of information in the downstream targets of Sid2 has limited our understanding of the different functions of the SIN. We recently showed that, in addition to its other functions, the SIN promotes cytokinesis through inhibition the MOR signaling pathway, which normally drives cell separation and initiation of polarized growth following completion of cytokinesis (Ray et al, 2010). The molecular details of this inhibition and the physiological significance of inhibiting MOR during cytokinesis was unclear. The results presented in Chapter II describe our approach to identify Sid2 substrates, particularly focusing on Nak1 and Sog2 that function in the MOR signaling cascade. We identified and characterized Sid2 phosphorylation sites on the Nak1 and Sog2 proteins. Chapter III explores how post translational modification of MOR proteins by Sid2 regulates polarized growth during cytokinesis. This includes delineating the effect of Sid2 mediated phosphorylation of Nak1 and Sog2 on protein-protein interactions in the MOR pathway as well as on the regulation of their localization during late mitosis. Finally, results in Chapter IV demonstrate that failure to inhibit MOR signaling is lethal because cells initiate septum degradation/cell separation before completing cytokinesis thereby emphasizing the importance of cross-regulation between the two pathways to prevent initiation of the interphase polarity program during cytokinesis.

Un nouveau procédé intensifié de vinification continue avec un mélange de levures S.cerevisiae et Sch.pombe immobilisées dans des billes d’alginate est proposé. A l’échelle laboratoire, l’étude de la teneur en billes et de la configuration du réacteur conduit à l’obtention d’un réacteur de type lit fixe permettant une production de vin en 35 heures. Des validations du procédé aux échelles pilote (170 L) puis industrielle (120 hL) montrent que, en cave, du vin de qualité semblable au témoin est produit en 2 à 3 jours. Une analyse du comportement du réacteur a identifié des raisons de pertes de performances liées à l’hydrodynamique lors du changement d’échelle ainsi que des axes améliorations possibles. Ce procédé permet d’obtenir un vin de qualité maitrisée et un gain de temps de plusieurs semaines / From a batch to another, produced wines are usually different because of the different alcoholic and malolactic fermentation courses. To blend wines quality and continue wine production industrialization, a new continuous process, using Ca-alginate immobilized yeast cells, was developed for red wine-making. Working with a blending of S.cerevisiae and Sch.pombe allowed the regrouping of the alcoholic and malolactic fermentations in a unique step. After testing different reactor set-ups at lab scale, the selected process, a vertical bed reactor, was used in real wine-making conditions, firstly in a pilot reactor (170 L) and then in an industrial one (120 hL). The results showed that continuous wine-making was possible in 2 to 3 days. The wine presented nearly the same sensory profile compared to a classical one. Thanks to the analysis of the reactor behaviour, we were able to explain the efficiency losses linked to the hydrodynamic, observed during the scale-up. This new intensified process enables to obtain a wine with a controlled quality and to save several weeks of production time

Condensine est un complexe protéique organisateur du génome qui conduit l’assemblage des chromosomes et promeut leur transmission fidèle en anaphase. De nombreuses études ont rapporté des changements dans les niveaux des ARNs cellulaires quand Condensine est défaillante, suggérant un rôle pour Condensine dans la régulation de l’expression génique. Cependant, les mécanismes sous-jacents sont demeurés énigmatiques, et l’on ignore dans quelle mesure le rôle joué par Condensine dans l’expression génique est lié ou non à sa fonction dans l’organisation des chromosomes. Lors de ma thèse, j’ai étudié l’activité de Condensine dans la régulation de l’expression génique en utilisant la levure S. pombe comme organisme modèle. Contrairement à l’idée communément admise, mes résultats montrent que Condensine ne joue aucun rôle direct dans le maintien du transcriptome, ni en interphase, ni en mitose chez cette levure. En accord avec les études précédentes, j’observe des changements de niveau et de qualité des ARNs dans les cellules mutantes pour Condensine au sortir de la mitose ; des ARNs non codants et des ARNs aberrants, étendus en 3’, s’accumulent. En revanche, je démontre que ces changements sont la conséquence de défauts de transmission des chromosomes en anaphase. L’inactivation de Condensine cause la non-disjonction de l’ADN ribosomique et du nucléole, entrainant une déplétion de l’ARN-exosome des cellules filles, lesquelles accumulent alors des ARNs normalement dégradés par l’ARN-exosome. De façon cruciale, je montre qu’empêcher les anomalies de migration des chromosomes restaure une expression normale des gènes malgré l’inactivation de Condensine, démontrant que c’est l’instabilité chromosomique qui est source des changements d’expression génique observés quand Condensine est défaillante, et non le complexe Condensine en tant que tel. Ce travail remet en question le concept de régulation de l’expression génique par les complexes Condensine et appelle à la prudence lorsque l’on cherche à étudier les fonctions de ces complexes en dehors de la condensation de la chromatine en mitose. / Condensin is a genome organiser that shape chromosomes and promote their accurate transmission in anaphase. Several studies have related changes in RNA level when Condensin is defective, suggesting that the complex has also a role in gene expression. However, the mechanisms have remained enigmatic and we still don’t know to what extent it is related to its role in chromosome organization. During my thesis, I studied the role played by Condensin in the regulation of gene expression using S. pombe as a model system. In contrast to previous studies, my results provide compelling evidence that Condensin plays no direct role in the maintenance of the transcriptome, neither during interphase nor during mitosis in this yeast. Accordingly to previous studies, I observed changes in RNA level in cells mutated for Condensin; non coding and 3’ extended RNA accumulate. However, I showed that the changes in gene expression in post-mitotic fission yeast cells that result from Condensin inactivation are largely a consequence of chromosome missegregation during anaphase, which notably depletes the RNA-exosome from daughter cells. Crucially, preventing karyotype abnormalities in daughter cells restores a normal transcriptome despite Condensin inactivation. Thus, chromosome instability, rather than a direct role of Condensin in the transcription process, changes gene expression. This work challenges the concept of gene regulation by canonical Condensin complexes and ask for caution when studying Condensin role outside chromosome condensation in mitosis.

Faithful duplication and segregation of undamaged DNA is critical to the survival of all organisms and prevention of oncogenesis in multicellular organisms. To ensure inheritance of intact DNA, cells rely on checkpoints. Checkpoints alter cellular processes in the presence of DNA damage preventing cell cycle transitions until replication is completed or DNA damage is repaired. Several checkpoints are specific to S-phase. The S-M replication checkpoint prevents mitosis in the presence of unreplicated DNA. Rather than outright halting replication, the S-phase DNA damage checkpoint slows replication in response to DNA damage. This checkpoint utilizes two general mechanisms to slow replication. First, this checkpoint prevents origin firing thus limiting the number of replication forks traversing the genome in the presence of damaged DNA. Second, this checkpoint slows the progression of the replication forks. Inhibition of origin firing in response to DNA damage is well established, however when this thesis work began, slowing of replication fork progression was controversial. Fission yeast slow replication in response to DNA damage utilizing an evolutionarily conserved kinase cascade. Slowing requires the checkpoint kinases Rad3 (hATR) and Cds1 (hChk2) as well as additional checkpoint components, the Rad9-Rad1-Hus1 complex and the Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) recombinational repair complex. The exact role MRN serves to slow replication is obscure due to its many roles in DNA metabolism and checkpoint response to damage. However, fission yeast MRN mutants display defects in recombination in yeast and, upon beginning this project, were described in vertebrates to display S-phase DNA damage checkpoint defects independent of origin firing. Due to these observations, I initially hypothesized that recombination was required for replication slowing. However, two observations forced a paradigm shift in how I thought replication slowing to occur and how replication fork metabolism was altered in response to DNA damage. We found rhp51Δ mutants (mutant for the central mitotic recombinase similar to Rad51 and RecA) to slow well. We observed that the RecQ helicase Rqh1, implicated in negatively regulating recombination, was required for slowing. Therefore, deregulated recombination appeared to actually be responsible for slowing failures exhibited by the rqh1Δ recombination regulator mutant. Thereafter, I began a search for additional regulators required for slowing and developed the epistasis grouping described in Chapters II and V. We found a wide variety of mutants which either completely or partially failed to slow replication in response to DNA damage. The three members of the MRN complex, nbs1Δ, rad32Δ and rad50Δ displayed a partial defect in slowing, as did the helicase rqh1Δ and Rhp51-mediator sfr1Δ mutants. We found the mus81Δ and eme1Δ endonuclease complex and the smc6-xhypomorph to completely fail to slow. We were able to identify at least three epistasis groups due to genetic interaction between these mutants and recombinase mutants. Interestingly, not all mutants’ phenotypes were suppressed by abrogation of recombination. As introduced in Chapters II, III and IV checkpoint kinase cds1Δ, mus81Δ endonuclease, and smc6-x mutant slowing defects were not suppressed by abrogation of recombination, while the sfr1Δ, rqh1Δ, rad2Δ and nbs1Δ mutant slowing defects were. Additionally, data shows replication slowing in fission yeast is primarily due to proteins acting locally at sites of DNA damage. We show that replication slowing is lesion density-dependent, prevention of origin firing representing a global response to insult contributes little to slowing, and constitutive checkpoint activation is not sufficient to induce DNA damage-independent slowing. Collectively, our data strongly suggest that slowing of replication in response to DNA damage in fission yeast is due to the slowing of replication forks traversing damaged template. We show slowing must be primarily a local response to checkpoint activation and all mutants found to fail to slow are implicated in replication fork metabolism, and recombination is responsible for some mutant slowing defects.

De nombreux processus métaboliques nécessitent la présence de fer en tant que cofacteur. Paradoxalement, la surabondance en fer peut contribuer à la formation de dérivés oxygénés hautement réactifs qui sont toxiques pour la cellule. Ceci fait en sorte que sa concentration intracellulaire doit être finement régulée. Chez la levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, plusieurs mécanismes participent à l'établissement de l'homéostasie du fer. Parmi ces mécanismes, on y retrouve des protéines de transport du fer à la surface cellulaire, ainsi que d'autres responsables de la séquestration de l'ion à l'intérieur de la vacuole. Un rôle pour la vacuole consiste à emmagasiner le fer afin de détoxifier la cellule s'il est trop abondant. Du même coup, la vacuole sert de réservoir qui pourra redonner le fer plus tard à la cellule si cette dernière croît en condition de rareté pour cet élément. La voie par laquelle le fer peut ressortir de la vacuole n'a cependant pas encore été identifiée. L'objectif de cette étude est d'identifier le transporteur responsable du relâchement du fer de la vacuole vers le compartiment cytosolique. Nos recherches ont permis d'identifier un candidat, un transporteur transmembranaire de type ABC (ATP binding cassette) nommé Abc3, dont l'expression augmente de 16.9 fois en carence de fer selon des études comparatives par biopuces à ADN. Tout d'abord, l'étude de la régulation du gène abc3[indice supérieur +] a été effectuée selon la présence ou non de fer dans le milieu de culture. L'expression du gène abc3[indice supérieur +] a été comparée avec d'autres gènes codant pour d'autres protéines de la même famille. Seul le gène abc3[indice supérieur +] a montré une expression variant selon le statut en fer. Il est réprimé en présence de fer et activé en carence de ce dernier. Par la suite, des éléments en cis du promoteur abc3[indice supérieur +] pouvant être responsables de la régulation selon le statut en fer ont été analysés. Parmi ces derniers, nous avons démontré que seul l'élément de régulation le plus près du cadre de lecture est fonctionnel permettant la répression du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer. Un essai fonctionnel permettant de montrer l'importance de la protéine Abc3 a été mis au point. Ainsi, une souche nulle pour le gène abc3[indice supérieur +] montre une perte de croissance en présence de cérulénine, un antibiotique qui inhibe la biosynthèse des acides gras. La souche abc3[delta] mutante est également sensible à la présence du chélateur de fer, le 2,2-dipyridyl (Dip), lorsque le système de transport de surface constitué de Fio1 et de Fip1 est inactivé. Une protéine Abc3 portant une étiquette fluorescente exprimée sous le contrôle du promoteur endogène abc3[indice supérieur +] a permis de localiser la protéine Abc3-GFP au niveau des vacuoles en carence de fer. Des analyses de profils transcriptionnels ont indiqué que l'expression forcée du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer active le répresseur Fep1. La surexpression du transporteur Abc3 libérerait plus de fer de la vacuole ce qui aurait pour effet d'activer Fep1, résultant en la répression de la transcription des gènes impliqués dans l'acquisition du fer à la surface cellulaire. Les résultats obtenus sur Abc3 suggèrent fortement que cette protéine pourrait être impliquée dans l'exportation du fer de la vacuole vers le cytoplasme de la levure lorsque cette dernière croît en carence de fer.