La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui cause la mort des neurones moteurs, induisant une paralysie progressive et menant à la mort quelques années après l'apparition des premiers symptômes. Comme dans toutes les maladies neurodégénératives, l'inflammation est une composante principale de la pathogénèse de la SLA. Une des cellules effectrices de cette inflammation, la cellule microgliale est le sujet central de cette thèse. Avec l'apparition des symptômes, la microglie passe d'un phénotype anti-inflammatoire et neuroprotecteur à un phénotype aberrant et neurotoxique. Il est nécessaire d'élucider les mécanismes cellulaires responsable du changement de phénotype et l'identification des facteurs maintenant ces phénotypes pour permettre le développement de thérapies efficaces ciblant l'inflammation. Ainsi dans cette thèse, nous tâchons d'identifier, en utilisant divers outils moléculaires et modèles animaux, la signature microgliale à différents stades de la SLA. Durant le stade présymptomatique, nous identifions, par l'étude du sécrétome microglial, la cytokine immunosuppressive interleukine-10 comme responsable du maintien du phénotype anti-inflammatoire. Cette cytokine est à la fois produite par les cellules microgliales et reconnue par celles-ci, grâce au récepteur IL-10R. Le blocage d'IL-10R a pour conséquence d'accélérer la progression de la maladie et de diminuer la survie dans un modèle murin. Aussi, l'augmentation de l'expression de cette cytokine à l'aide d'un vecteur viral mène à une diminution de la vitesse de la progression de la maladie et allonge la durée de vie chez ce même modèle murin. Dans le but de comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans le changement phénotypique de la microglie avec l'apparition des symptômes de la SLA, nous utilisons un système-modèle pour le profilage moléculaire spécifique à la microglie. Cet outil, EDTA TRAP, consiste en l'immunopurification des ribosomes microgliaux et l'identification subséquente des ARNm et des protéines séquestrés sur ces ribosomes. Il a été possible d'identifier une forte disparité dans la nature des ARNm et des protéines les plus régulés. Le profil transcriptomique de la microglie symptomatique dénote une fonction phagocytaire et possiblement neuroprotectrice pour la microglie alors que son profil protéomique est proliférateur et potentiellement neurotoxique. La disparité de ces deux profils s'explique par la répression de la traduction d'ARNm issus de gènes immunitaires par un mécanisme impliquant l'interaction de leur 3'UTR et de la protéine liant l'ARN SRSF3. La forme phosphorylée de cette protéine s'accumule spécifiquement du cytoplasme des cellules microgliales proportionnellement avec la progression de la maladie. La diminution de l'expression de SRSF3 à l'aide d'un oligonucléotide interférent rétablit la traduction des ARNm immunitaires et la fonction phagocytaire de la microglie associée à ces ARNm. Cela mène à une progression plus lente de la maladie et une plus longue survie dans un modèle murin. Ainsi, l'utilisation d'un oligonucléotide interférant contre SRSF3 pourrait être une nouvelle avenue thérapeutique dans le traitement de la SLA. La compréhension des divers mécanismes cellulaires impliquant la protéine SRSF3 est importante pour comprendre son dynamisme dans la SLA. SRSF3 est la plus petite protéine de la famille SR. Cette famille se distingue par leur structure soit un ou deux motifs de reconnaissance de l'ARN en N-terminus et un domaine riche en arginine et en sérine hautement phosphorylable en C-terminus. SRSF3 peut être phosphorylé dans le noyau par la kinase CLK1 ou dans le noyau et dans le cytoplasme par les kinases SRPK. SRSF3 est impliqué dans l'épissage, le transport nucléo-cytoplasmique et la traduction, entre autres. La dérégulation du niveau d'expression ou de la phosphorylation de SRSF3 peut drastiquement changer son rôle dans la cellule. Ainsi, SRSF3 est impliqué dans diverses maladies comme le cancer, les infections virales ou la SLA. Les mécanismes cellulaires régissant le dynamisme de SRSF3 doivent ainsi être bien compris dans le but de faire de l'oligonucléotide interférent contre SRSF3 une thérapie efficace contre la SLA / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder that leads to motoneuron loss, progressive paralysis and death a few years after the first symptoms. As every other neurodegenerative disorder, inflammation is a main component of ALS pathogenesis. One of the cell type implicated in this inflammation, the microglia, is the central subject of this thesis. With the emergence of the symptoms, microglia transforms from an anti-inflammatory and neuroprotective phenotype to an aberrant and neurotoxic phenotype. It is necessary to elucidate the cellular mechanisms underlying this phenotypic change and the factors maintaining these phenotypes to allow the development of effective inflammation-targeting therapies. In this thesis we seek to identify, using multiple molecular tools and animal models, the microglial signature at the different stage of the disease. During the symptomatic stage, we identified the immunosuppressive cytokine IL-10 to be responsible for maintaining the anti-inflammatory phenotype. This cytokine is at the same time produced and recognized by microglial cells. Blocking IL-10 receptor accelerated disease progression and shortened survival in a mouse model. Moreover, the augmentation of the expression of IL-10, using a viral vector, slowed disease progression and lengthened lifespan in the same mouse model. In order to understand the cellular mechanisms implicated in the microglial phenotypic change in ALS, we used a system-model for the microglia-specific molecular profiling. This tool, EDTA-TRAP, consists in the microglial poly-ribosome immunopurification and the subsequent identification of in-translation mRNAs and proteins sequestered on these ribosomes. It was possible to identify a strong mismatch in the nature of the most regulated mRNAs and proteins. The transcriptomic profile of symptomatic microglia denotes a phagocytic and possible neuroprotective function for microglia while its proteomic profile is proliferative and potentially neurotoxic. The discrepancy between these two profiles is explained by the repression of immune gene mRNA translation by a mechanism implicating the interaction of their 3'UTR and the RNA-binding protein SRSF3. The phosphorylated form of SRSF3 specifically accumulates in microglia cytoplasm proportionally with disease progression. The decrease of SRSF3 expression by an interfering oligonucleotide restores immune mRNA translation and the microglial phagocytic function. This leads to and slower disease progression and a longer survival in a mouse model. Hence, the use of an interfering oligonucleotide against SRSF3 could be a new therapeutic avenue in ALS treatment. The understanding of the diverse cellular mechanisms implicating SRSF3 is important in elucidating its dynamic function in ALS. SRSF3 is the shortest protein from the SR family. This family can be distinguished by their structure : one or two N-terminal RNA recognition motif and a C-terminal highly phosphorylatable arginine and serine rich domain. SRSF3 can be phosphorylated in the nucleus by the CLK1 kinase or in the nucleus and the cytoplasm by the SRPK kinases. SRSF3 is implicated in splicing, nucleocytoplasmic transport and translation, among others. The deregulation of the expression level or the phosphorylation of SRSF3 can drastically change its role in the cell. Hence, SRSF3 is implicated in many diseases such as cancer, viral infection and ALS. The cellular mechanisms governing SRSF3 dynamism should then by well understood in order to make the interfering oligonucleotide against SRSF3 an efficient therapy to treat ALS.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodegenerative chronique caractérisée par la dégénérescence des motoneurones corticaux, bulbaires et spinaux. Environ 5 à 10% des cas de SLA sont familiaux (SLAf), avec un mode de transmission autosomique dominant, tandis que les 90 à 95% restants sont des cas sporadiques (SLAs), sans composante génétique connue. Approximativement 20% des cas familiaux de SLA sont associés à plus de 100 mutations du gène codant pour la superoxyde dismutase de type 1 (SOD1). Des données récentes indiquent que les chromogranines, composants majeurs de la matrice des granules de sécrétion, peuvent lier spécifiquement les formes mutées de la SOD1 et promouvoir leur sécrétion. Une fois sécrétée, la SOD1 mutée peut induire la microgliose ainsi que la mort des motoneurones. Afin de confirmer cette nouvelle hypothèse pathologique, nous avons testé une approche d'immunisation visant à réduire les niveaux extracellulaires de la SOD1 mutée dans le tissu nerveux de souris modèles de la SLA. Cette approche s'est avérée efficace pour retarder l'apparition de la maladie et prolonger la durée de vie des souris vaccinées. Nos travaux montrent également que la SOD1 peut être transloquée dans le réseau RE-Golgi sous forme monomérique et en présence d'ATP. Dans le but de mieux comprendre le rôle et l'implication des chromogranines dans la toxicité de la SOD1 mutée et par conséquent dans la pathogenèse de la SLA, nous avons généré des souris SOD1G37R dans le contexte de surexpression neuronale de la chromogranine A (CgA). Nos résultats montrent que la surexpression de la CgA chez les souris SOD1G37R accélère l'apparition des troubles moteurs et augmente la dégénérescence des motoneurones. Les souris TCgA; SOD1G37R présentent un niveau plus élevé d'espèces protéiques mal repliées de SOD1, ce qui refléterait une stabilisation des espèces toxiques de la SOD1 par l'excès de CgA. Ces résultats suggèrent un rôle des chromogranines comme modulateurs de la survenue de la maladie dans la pathogenèse de la SLA.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le but du travail de recherche présenté dans cette thèse était de déterminer les mécanismes impliqués dans le développement de symptômes neurologiques observés dans une lignée de souris transgénique pour l’expression de la molécule B7.2/CD86. La molécule B7.2 est un des ligands du récepteur CD28 qui transmet des signaux intracellulaires nécessaires à la prolifération des lymphocytes T et au développement de leurs fonctions effectrices. Nos travaux démontrent que ces souris développent spontanément une pathologie démyélinisante auto-immune conséquemment à l’expression transgénique de la molécule B7.2 sur les cellules de la microglie du système nerveux central. Les souris affectées présentent une infiltration de lymphocytes T au niveau du système nerveux central et périphérique proximal et cet infiltrat est prédominé par une population de lymphocytes T CD8[indice supérieur +] mémoires/effectrices. Nos études indiquent que la population de lymphocytes T CD8[indice supérieur +] joue un rôle effecteur dans le développement de la pathologie tandis que la population des lymphocytes T CD4[indice supérieur +] la régulent de façon négative. Nos résultats démontrent également que l’activation des cellules de la microglie survient très tôt lors de la pathogenèse et que cette activation des cellules de la microglie ainsi que le processus de démyélinisation sont entièrement dépendants de la signalisation par le récepteur de l’IFNy. Ce modèle de démyélinisation reflète l’émergence de cellules T autoréactives spécifiques au système nerveux à partir d’un répertoire périphérique polyclonal, un processus immunopathogénique qui se produit possiblement durant la pathogenèse de la sclérose en plaques. De plus, il présente certaines caractéristiques pathologiques similaires à celles de la sclérose en plaques tels que le développement spontané du processus de démyélinisation et de dommages aux axones ainsi qu’une connexité avec l’activité de l’IFNy. Plusieurs données de la littérature suggèrent que les lymphocytes T CD8[indice supérieur +] pourraient jouer un rôle dans les maladies auto-immunes affectant le système nerveux, mais la contribution exacte et les mécanismes pathogéniques spécifiques des lymphocytes T CD8[indice supérieur +] ne sont pas encore clairement établis. Le travail de recherche présenté dans cette thèse a donc permis d’établir que la lignée de souris transgénique qui exprime de façon constitutive le ligand de costimulation B7.2/CD86 sur les cellules de la microglie représente un nouveau modèle animal qui permettra d’étudier et de comprendre ces mécanismes pathogéniques spécifiques aux lymphocytes T CD8[indice supérieur +] ainsi que les processus qui régulent la participation des lymphocytes T CD8[indice supérieur +] dans la destruction de la gaine de myéline.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable. Environ 10% des cas de SLA sont familiaux (SLAF) et 90% sont sporadiques (SLAS). À l'heure actuelle, des mutations dans les gènes SOD1 et TARDBP demeurent parmi les principales causes de SLAF. Plusieurs évidences tendent à attribuer aux facteurs environnementaux une place de plus en plus importante dans l'identification de causes probables de la SLAS. Cependant, notre compréhension des mécanismes menant à des anomalies dans ces gènes ou à l’exposition à divers facteurs environnementaux et à la mort des neurones moteurs reste limitée. À ce jour, aucun traitement efficace n’a encore été décrit pour la SLA. C’est pourquoi le développement d’une immunothérapie avec des anticorps anti-SOD1 mal repliée spécifiques nous permettra de mieux comprendre les mécanismes et les causes environnementales susceptibles d’être impliqués dans la SLAS. Ceci ouvrira de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques pour le traitement de cette maladie encore incurable. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease. About 10% of cases are familial (FALS) and 90% are sporadic (SALS). Currently, mutations in SOD1 and TARDBP genes are among the main causes of FALS. Many evidences suggest that environmental factors can be an important element in the identification of probable SALS causes. However, our comprehension of mechanisms leading to mutations in these genes or exposure to different environmental factors, to the death of motor neurons is still limited. Currently, there is not efficient cure for ALS. The development of an immunotherapy with specific anti-misfolded SOD1 antibodies will therefore help us to understand the mechanisms and environmental factors that may be involved. This can lead to new perspectives for early diagnosis and prognosis, and new therapeutic approaches for this yet incurable disease.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodegenerative incurable. Un seul médicament existe pour traiter la SLA et il ne fait que prolonger la durée de vie des patients de 3 à 6 mois, sans en diminuer les symptômes. Parmi les meilleurs modèles pour étudier la SLA, les souris S0D1G93A sont largement utilisées, notamment pour tester de nouveaux composés. Aussi, le modèle murin TDP-43 , récemment généré dans notre laboratoire, représente très bien la pathologie observée dans une autre sous-portion des patients atteints de SLA (protéinopathies TDP-43). Dans une tentative de découvrir un nouveau traitement pour la SLA, nous avons administré à des souris S0D1G93A et TDP-43 du bleu de méthylène, médicament connu pour traiter une variété des désordres neurologiques et ayant des propriétés neuroprotectrices toutes indiquées pour traiter la SLA. Nous l'avons aussi administré conjointement avec le lithium qui est connu pour avoir des effets synergiques avec certains composés.

Des mutations dans plusieurs gènes ont été liés à la sclérose latérale amyotrophique (SLA),en particulier dans celui codant pour la protéine Fused in Sarcoma (FUS). Les mutations sont retrouvées dans la partie codant pour le signal de localisation nucléaire, rendant la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d’autres observations, ça suggère qu’un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l’origine de la neurodégénérescence. La SLA est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et cause une paralysie progressive. Les mécanismes moléculaires causant la maladies ont toujours inconnus. Une des pistes serait la perturbation de la traduction locale desARNm, qui permet aux synapses de répondre rapidement et indépendamment du corps cellulaire. Une traduction locale insuffisante pour soutenir l’activité synaptique à long terme mènerait à la perte des synapses et à la neurodégénérescence. Mon objectif est donc de déterminer le rôle de FUS dans régulation de la traduction des ARNm en caractérisant son interaction avec les composantes traductionnelles et d’évaluer sa fonction dans une condition reproduisant les caractéristiques de la SLA. J’ai montré que FUS s’associe aux polyribosomes inactifs, ce qui suggère que FUS jouerait un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en interagissant avec le cœur de la traduction. Il est également possible d’observer une augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme et de son interaction avec les polyribosomes suite à une inhibition de la traduction par mTOR, suggérant son rôle de régulateur négatif. De plus, les mutations liées à la SLA amplifient la fonction inhibitrice de FUS en rendant FUS cytoplasmique et en réduisant la synthèse des protéines. Mes résultats montrent que la protéine FUS aurait un rôle d’inhibiteur de la traduction quand celle-ci est cytoplasmique. Par conséquent, l’augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme dans la SLA entrainerait une inhibition de la traduction importante, à un niveau insuffisant pour soutenir l’activité synaptique. / Mutations in several genes have been linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS),particularly in the gene coding for the Fused in Sarcoma protein (FUS). Those mutations are found in the part encoding for the nuclear localization signal, making the protein abnormallyabundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it suggests that a toxic gainof function of FUS in the cytoplasm would be the cause of the neurodegeneration. ALS is a neurodegenerative disease that affects motor neurons and causes progressive paralysis. The molecular mechanisms causing the disease are still unknown. One of the hypotheses is the disruption of local translation of mRNAs, which allows synapses to respond quickly and independently from the cell body. Insufficient local translation to support long-term synapticactivity would lead to synaptic loss and neurodegeneration. Thereby, the objective of mystudy is to determine the role of FUS in the regulation of mRNA translation by characterizing its interaction with translational components and evaluate its function in an ALS-linked condition. I have shown that FUS is associated with stalled polyribosomes, which suggests that it plays a role in regulating mRNA translation by interacting with the core of translation.There is also an increase in the presence of FUS in the cytoplasm and in its interaction with polyribosomes following inhibition of translation through mTOR, suggesting its role as anegative regulator. In addition, ALS-related mutations amplify FUS inhibitory function bymaking FUS cytoplasmic and reducing protein synthesis. My results show that the FUSprotein would have a role as a translation inhibitor when it is cytoplasmic. There fore, increasing the presence of FUS in the cytoplasm in ALS would result in significant translation inhibition, at a level insufficient to support synaptic activity.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative affectant les neurones moteurs supérieurs et inférieurs menant éventuellement à une paralysie générale du patient. Le décès du patient survient généralement entre 2 à 5 ans subséquemment à l’apparition des premiers symptômes. La SLA consiste en la maladie neurologique causant le plus décès chez l’adulte et il est estimé qu’environ 10% des cas sont familiaux (fSLA) et 90% sont sporadiques (sSLA). De plus, 15% des patients souffrant de la SLA développent également une démence fronto-temporale (DFT) s’illustrant par des troubles de comportements ainsi qu’un changement de personnalité majeur. Il a été démontré que la SLA et la DFT partagent un spectre génétique commun et les patients atteints de DFT démontrent une protéinopathie caractérisée par une accumulation anormale de certaines protéines dans le cytoplasme des neurones et des cellules gliales, tout comme pour les patients souffrant de SLA. Plusieurs gènes mutés ont été identifiés au cours des dernières années pour la forme fSLA, notamment superoxide dismutase 1 (SOD1), TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), ubiquilin-2 (UBQLN2), Fused in sarcoma (FUS), optineurin (OPTN), etc. Un des gènes le plus étudié et le mieux décrit est celui codant la protéine TDP-43. Cette protéine nucléaire, lorsque mutée, est délocalisée dans le cytoplasme, où elle forme des inclusions anormales et persistantes. Ces agrégats, lorsque formés, renferment également plusieurs autres composés, notamment d’autres protéines telles qu’UBQLN2, différentes nucléoporines, ubiquitine, etc. UBQLN2 est une protéine ayant un rôle primordial dans le système de dégradation du protéasome (UPS) ainsi que pour l’autophagie. Cette protéine est responsable de la liaison entre les protéines destinées à être dégradées avec l’UPS. Il a été démontré dernièrement in vitro et in vivo que la mutation d’UBQLN2 est liée à l’agrégation de TDP-43. Cependant, le mécanisme exact de ce phénomène reste grandement incompris et nécessite encore beaucoup d’attention et de travail. Dans ce mémoire, nous avons utilisé pour notre étude des cellules en culture afin de surexprimer les formes natives et mutantes d’UBQLN2 humain (hUBQLN2) pour étudier l’effet d’UBQLN2 sur la protéine TDP-43. Notre équipe a réussi à démontrer dernièrement dans les cellules de neuroblastome de souris (Neuro2a) que la surexpression de l’UBQLN2 entraînait une délocalisation de TDP-43 du noyau vers le cytoplasme en plus de son accumulation anormale dans des agrégats. De plus, l’effet synergique entre les formes mutées de TDP-43 et UBQLN2 a également été démontré dans un modèle murin dans notre article paru en 2018 comme quoi la mutation d’UBQLN2 influence grandement la protéinopathie de TDP-43. À la suite de ces constats, nous avons orienté nos études sur le phénomène synergique entre UBQLN2 et TDP-43 qui est encore grandement méconnu. Pour ce faire, une analyse complète et exhaustive de la littérature a été effectuée afin de bien comprendre la mutation UBQLN2 et consiste en la première revue littéraire couvrant la totalité des ouvrages publiés sur la mutation d’UBQLN2 dans la SLA. Par la suite, nous avons convenu d’étudier l’effet de la mutation d’UBQLN2P497H sur le transport nucléo-cytoplasmique dans les cellules Neuro2a ainsi que dans les tissus de souris transgéniques. Les souris utilisées sont les mêmes que pour l’article Picher-Martel et al., 2018, soit des souris simple transgénique UBQLN2P497H et TDP-43G348C ainsi que la première souris double transgénique arborant UBQLN2P497H/TDP-43G348C. Les souris doubles transgéniques se sont avérées très intéressantes. En effet, elles ont développé les caractères typiques retrouvés chez les patients SLA/DFT avec une perte motoneuronale accompagnée de dégénérescence axonale, atrophie musculaire, gliose, trouble moteur ainsi que cognitif en plus d’agrégations cytoplasmique de TDP-43 importantes. À l’aide de ce modèle unique nous avons approfondi notre compréhension des déficits observés au niveau du transport nucléo-cytoplasmique, déficit grandement observé chez les patients SLA. Nous avons observé que le transport nucléo-cytoplasmique était davantage et significativement altéré dans les cellules co-transfectées avec les gènes encodant pour les deux protéines mutées plutôt que transfectées avec une seule. Nous avons également observé pour les souris double transgéniques comparées aux souris simples pour l’une ou l’autre de ces protéines. Nos résultats suggèrent donc que la mutation d’UBQLN2 exacerbe significativement la protéinopathie de TDP-43 et engendre une perturbation importante du transport nucléo-cytoplasmique ainsi que des complexes du pore nucléaire. En conclusion, ce mémoire démontre un rôle important de la mutation d’UBQLN2 sur TDP-43 et leur grande affinité à augmenter les déficits du transport nucléo-cytoplasmique. Ceci suggère donc qu’UBQLN2 et TDP-43 sont intimement liés et peuvent jouer un rôle synergique dans la physiopathologie de la SLA. Le modèle murin double transgénique pourra indubitablement être utilisé en laboratoire afin de tester de nouvelles approches thérapeutiques.