No Brasil, houve significativa redução da mortalidade infantil, porém não do componente perinatal que corresponde a 13% do total. O diagnóstico das infecções congênitas com base apenas em dados clínicos, ultrassonográficos e sorológicos maternos é muito difícil, havendo necessidade de um número grande de sorologias, algumas delas não disponíveis na rotina laboratorial, e o simples encontro de sorologia positiva (IgM e IgG positivas) na gestante não constitui prova inequívoca da transmissão vertical. A extração de DNA/ RNA a partir de líquido amniótico possui baixo rendimento, dificultando a realização de inúmeros testes moleculares. Sendo assim, na tentativa de preencher esta lacuna diagnóstica, a presente pesquisa teve como objetivo a padronização e validação de uma multiplex-nested-PCR capaz de detectar, de forma simultânea, sete patógenos que causam infecções congênitas e possuem DNA no genoma: CMV, HSV, VZV, EBV, adenovírus, parvovírus B19 e Toxoplasma gondii, com determinação da frequência relativa de cada microrganismo em um grupo de gestantes com (estudo) e sem suspeita de infecção (controle). No grupo de estudo, 147 gestantes foram recrutadas, com 57 casos positivos (38,8%): 32 com T. gondii (21,8% do total e 56,1% dos positivos);12 com CMV (8,1% e 21%); 5 casos com parvovírus (3,4% e 8,8%); 4 com adenovírus (2,7% e 7%) e 4 casos com dupla detecção (2 casos com T. gondii e CMV; 1 caso com T. gondii e VZV e 1 caso com CMV e parvovírus B19). O grupo controle contou com 193 casos e 197 amostras: líquido amniótico para cariotipagem em gestantes com idade avançada (n=44); amostras de sangue (n =150), e fragmentos de placentas (n=3) de gestantes com pré-natal normal, no momento do parto. Neste grupo, duas amostras de líquido amniótico foram positivas (1,04% do total de casos e 4,5% dos líquidos): um caso de adenovírus em feto com cariótipo normal, e um caso de T. gondii em feto com translucência nucal aumentada e trissomia do 21 (síndrome de Down). Neste grupo controle 14/193 cariótipos fetais se encontravam alterados (7,2%). A falta de estudos similares dificultou a comparação dos resultados, porém a multiplex-nested-PCR detectou número quase seis vezes superior ao detectado pelos exames disponíveis nos centros participantes. Todos os resultados positivos foram confirmados pelo sequenciamento dos produtos de amplificação. A similaridade entre as sequências amplificadas e os protótipos do GenBank variou entre 95-98%. No presente estudo, a padronização e validação de uma multiplex-nested-PCR foi realizada com sucesso, utilizando protocolos simples, reprodutíveis, agrupamento dos sete controles positivos em um único plasmídeo bacteriano e substituição da detecção do material amplificado pela eletroforese capilar, mais rápida, com menor custo, e com maior grau de resolução que os géis de agarose. Para a implantação da técnica na rotina laboratorial, pretende-se a substituição do sequenciamento como método confirmatório, pela realização de amplificações em tempo real com Sybr Green, apenas do patógeno que for detectado pela multiplex-nested-PCR. / In Brazil, there was a significant reduction in infant mortality, but not in the perinatal component, which corresponds to 13% of the total. Diagnosis of congenital infections based on maternal clinical, ultrasound and serological data is very difficult, requiring a large number of serologies, some of which are not available in the clinical laboratory routine, and the simple finding of a positive IgM and IgG in the pregnant woman does not constitute unequivocal evidence of vertical transmission. The extraction of DNA/ RNA from amniotic fluid samples has a low yield, making it difficult to perform many molecular tests on this biological material. Therefore, in an attempt to fill this diagnostic gap, the present research aimed at standardizing and validating a multiplex-nested-PCR capable of simultaneously detecting seven pathogens that cause congenital infections and have DNA in their genomes: CMV, HSV, VZV, EBV, adenovirus, parvovirus B19 and Toxoplasma gondii. The study has also aimed at determining the relative frequency of each microorganism in a group of pregnant women with (study group) or without suspicion of infection (control group). In the study group, 147 pregnant women were included and 57 (38.8%) positive cases detected. Thirty-two cases had T. gondii (21.8% of the total and 56.1% of the positive ones), 12 had CMV (8.1% and 21%); 5 cases had parvovirus (3.4% and 8.8%); 4 cases had adenovírus (2.7% and 7%). Four cases showed double detection (2 cases had T. gondii and CMV, 1 case had T. gondii and VZV, and 1 case had CMV and parvovirus). The control group had 193 cases and 197 samples: amniotic fluid for karyotyping in pregnant women with advanced age (n = 44); blood samples (n = 150), and fragments of placentas (n = 3) of pregnant women with normal prenatal care, at delivery. In this group, two amniotic fluid samples were positive (1.04% of total cases and 4.5% of fluids): one case of adenovirus with normal fetal karyotype, and one case of T. gondii with increased nuchal translucency and trisomy 21 (Down syndrome). In this control group, 13/ 193 fetal karyotypes were altered (6.7%). The lack of similar studies made it difficult to compare the results, but the multiplex-nested-PCR detected a number almost six times higher than that detected by the tests available at the participating centers. All the positive amplification products were sequencing and confirmed the results. The similarity between the amplified sequences and the GenBank prototypes varied between 95-98%. In the present study, the standardization and validation of a multiplex-nested-PCR was success, using simple and reproducible protocols, and the clustering of the seven positive controls on a single bacterial plasmid aside from the replacement of the amplification products detection by agarose gels for the capillary electrophoresis, which is faster, less expensive and has a higher degree of resolution. For the technique set up in the laboratory routine, the substitution of the sequencing as the confirmatory method for real-time amplifications with Sybr Green is required, amplifying only the pathogen that has been previously detected by the multiplex-nested-PCR.

A microbiota do trato gastrointestinal dos psitacídeos é composta por bactérias Gram-positivas, entre elas as bactérias ácido láticas. Porém, há poucos estudos na literatura descrevendo a microbiota do trato gastrointestinal dessas aves. O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar fenotipicamente e genotipicamente, por três diferentes métodos, as bactérias ácido láticas isoladas da microbiota fecal de papagaios verdadeiros. Um total de 80 amostras bacterianas foram estudadas, sendo que 31 amostras eram provenientes da microbiota fecal de papagaios-verdadeiros de vida livre e 49 amostras eram de papagaios-verdadeiros de cativeiro. Foram realizadas provas bioquímicas convencionais, automatizadas (Vitek 2) e o sequenciamento completo do gene 16S rRNA e realizada a análise comparativa dos resultados. Das 80 amostras analisadas, em 40 (50%) destas foram identificadas as espécies, pois apresentaram concordância de identificação em pelo menos dois métodos, e as demais 40 amostras (50%) não apresentaram concordância entre os testes, não sendo possível definir a espécie. As espécies identificadas foram: Enterococcus avium (02 amostras), Enterococcus faecium (03 amostras), Enterococcus faecalis (15 amostras), Enterococcus hirae (15 amostras), Lactococcus lactis (02 amostras) e Staphylococcus warneri (02 amostras). Dentre as amostras identificadas, sete (07) amostras apresentaram concordância no resultado nas três técnicas analisadas, trinta e uma (31) amostras apresentaram concordância pelo bioquímico automatizado e pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, e apenas duas (02) amostras apresentaram concordância pelo bioquímico convencional e pelo sequenciamento de DNA. A similaridade de utilização de substratos pelas cepas foi definida em treze (13) amostras, nas demais amostras estudadas houve uma diferença no consumo de substratos nas provas bioquímicas. O perfil de resistência a antimicrobianos evidenciou resistência em onze (11) amostras, quatro (04) a benzilpenicilina, quatro (04) a eritromicina, duas (02) a gentamicina e uma (01) a estreptomicina. A análise filogenética baseada no coeficiente de Neighbor-Join para comparar a similaridade entre as sequencias geradas pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, mostrou uma tendência de agrupamento bacteriano de acordo com o local de onde as aves eram provenientes. Verificou-se que a identificação através do teste bioquímico convencional apresentou resultados inconsistentes quando comparados com o teste bioquímico automatizado e com o sequenciamento de DNA. Por sua vez, a técnica do sequenciamento genético demonstrou uma elevada confiabilidade nos resultados obtidos; sugerindo-se a utilização deste como teste de eleição e também como teste complementar as provas bioquímicas, para assim diminuir a probabilidade de erro de identificação bacteriana de bactérias ácido láticas em papagaios. / Gastrointestinal microbiota of pscittacines main consists largely of Gram-positive bacteria, including acid-latic bacteria. However, the literature presents very few reports on profiling the gastrointestinal microbiota of these birds. The aim of this study was to identify and to characterize phenotypicly and genotypicly acid-latic bacteria isolated from fecal microbiota of Blue-fronted Amazon Parrots. For such, three different methods were used on eighty bacterial strains. Thirty-one fecal samples were collected from free-living Blue-fronted Amazon Parrots, while fourty-nine were from captive birds. Traditional biochemical tests, automated biochemical test (Vitek 2) and complete gene sequencing of 16S rRNA were performed. Results of these three methods were compared. Forty samples (50%) had agreement between at least two of the three methods, and bacterial species identification was confirmed, while strains from the remaining 40 samples were not identified, once agreement between atleast two methods was not found. The species identified were: Enterococcus avium (02 samples), Enterococcus faecium (03 samples), Enterococcus faecalis (15 samples), Enterococcus hirae (15 samples), Lactococcus lactis (02 samples) and Staphylococcus warneri (02 samples). Agreement between the three methods was observed in seven samples. Thirty-one samples presented agreement between automated biochemical tests and sequencing of the 16S rRNA gene. Only two samples presented agreement between tradional biochemical tests and gene sequencing. Similarities of substract consumed by strains in both traditional and automated biochemical tests were observed in thirteen samples, while the other samples presented some difference in substracts utilization. Antimicrobial resistance profile showed that eleven samples were resistant to some antibiotic. Four were resistant to benzilpenicilin, four to erythromycin, two to gentamicin and one to estreptomycin. The phylogenetic test based on Neighbor-Join coefficient, which compares the similarity between 16S rRNA sequences, showed a trend for grouping of strains according to the geographical origin of each bird. However, species identification using traditional biochemical tests showed to be inconsistent when compared to automated biochemical tests and gene sequencing results. On the other hand, genetic sequencing technique results showed to be highly reliable. Thus, this method should be used both as gold standard and as complementary to the biochemical tests for acid-latic bacteria identification in Blue-fronted Amazon Parrots gastrointestinal microbiota.

As espécies do Complexo Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii (ACB) são importantes causadoras de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde em todo o mundo. Detêm maior relevância os isolados com resistência aos antimicrobianos, os quais impactam negativamente no prognóstico, na mortalidade e custos associados ao cuidado com o paciente. O objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade genética e o perfil de susceptibilidade antimicrobiana de 134 isolados multirresistentes de A. baumannii presentes no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, entre 2007 e 2014. A identificação de A. baumannii deu-se pela pesquisa dos genes blaOXA-51-like e gltA, detectados em 85% (n=114) dos isolados Os isolados de Acinetobacter não-baumannii foram identificados por sequenciamento gênico como A. nosocomialis (n=4; 3,1%), A. pittii, A. bereziniae (n=2; 1,7%, cada), A. ursingii, A. variabilis, A. gyllenbergii (n=1; 0,9% cada) e Acinetobacter spp (n=2; 1,7%). Os isolados de A. baumannii foram submetidos às técnicas de PCR multiplex para detecção de outras oxacilinases, pesquisa de ISAba1, teste de susceptibilidade antimicrobiana, tipagem molecular por eletroforese em campo pulsado (PFGE), por sequência trilocus (3LST) e por sequência multilocus (MLST). Detectou-se o gene blaOXA-23-like em 105 isolados (92,1%), estando 100% associados a ISAba1; blaOXA-72 em um isolado (0,9%) e blaOXA-231 em dois isolados (1,7%). A maior parte (n=66; 57,9%) dos isolados foi classificada como extensivamente resistentes (XDR). O PFGE agrupou os isolados em 11 clusters (A-K) e o MLST identificou os isolados pertencentes majoritariamente aos clones CC79 (42,4%), CC1 (16,6%), CC15 (12,1%) e ao ST317 (18,2%). Os resultados do MLST e 3LST concordaram em 95,6%. Foi verificada a ocorrência de diferentes perfis de PFGE em A. baumannii MDR e XDR, predominando cepas carreadoras de ISAba1/OXA-23-like e pertencentes aos CC1, CC15, CC79, ST317. Predominaram o ST317 nos anos iniciais e o CC79 (ST730) de 2011 a 2014. Estes resultados fornecem subsídios que ressaltam a necessidade de monitoramento e controle de patógenos multirresistentes / Species of Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii Complex (ACB) are important causes of Healthcare Associated Infections worldwide. More relevant are isolates with antimicrobial resistance, which have a negative impact on the outcome, mortality and costs associated with patient care. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity and the antimicrobial susceptibility profile of 134 multiresistant ACB spcies strains present at Botucatu Medical School Teaching Hospital between 2007 and 2014. Identification of A. baumannii species was by detection of blaOXA-51-like and gltA genes, detected in 85% (n=114) of the isolates. Non-baumannii Acinetobacter species were identified by gene sequencing as A. nosocomialis (n=4, 3.1%), A. ursingii, A. variabilis, A. gyllenbergii (n=1, 0.9% each) and Acinetobacter spp (n=2; 1.7%). A. baumannii isolates were submitted to multiplex PCR for other oxacillinases and ISAba1 detection, antimicrobial susceptibility testing, molecular typing by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), trilocus sequence typing (3LST) and multilocus sequence typing (MLST). blaOXA-23-like gene was detected in 105 isolates (92.1%), of which 100% were associated with ISAba1; blaOXA-72 was present in one isolate (0.9%) and blaOXA-231, in two isolates (1.7%). The majority (n=66; 57.9%) of isolates were classified as extensively resistant (XDR). The PFGE grouped the isolates into 11 clusters (A-K) and MLST identified the isolates belonging mainly to CC79 (42.4%), CC1 (16.6%), CC15 (12.1%) and ST317 (18.2%). MLST and 3LST results were 95.6% concordant. We verified the occurrence of different PFGE profiles in multidrug-resistant (MDR) and extensively drug-resistant (XDR) A. baumannii, predominantly presenting ISAba1/OXA-23-like genes and belonging to CC1, CC15, CC79 and ST317. There was a prevalence of ST317 in the early years and CC79 (ST730) from 2011 to 2014. Our results highlight the importance of surveillance and control of multiresistant pathogens

As espécies do Complexo Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii (ACB) são importantes causadoras de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde em todo o mundo. Detêm maior relevância os isolados com resistência aos antimicrobianos, os quais impactam negativamente no prognóstico, na mortalidade e custos associados ao cuidado com o paciente. O objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade genética e o perfil de susceptibilidade antimicrobiana de 134 isolados multirresistentes de A. baumannii presentes no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, entre 2007 e 2014. A identificação de A. baumannii deu-se pela pesquisa dos genes blaOXA-51-like e gltA, detectados em 85% (n=114) dos isolados Os isolados de Acinetobacter não-baumannii foram identificados por sequenciamento gênico como A. nosocomialis (n=4; 3,1%), A. pittii, A. bereziniae (n=2; 1,7%, cada), A. ursingii, A. variabilis, A. gyllenbergii (n=1; 0,9% cada) e Acinetobacter spp (n=2; 1,7%). Os isolados de A. baumannii foram submetidos às técnicas de PCR multiplex para detecção de outras oxacilinases, pesquisa de ISAba1, teste de susceptibilidade antimicrobiana, tipagem molecular por eletroforese em campo pulsado (PFGE), por sequência trilocus (3LST) e por sequência multilocus (MLST). Detectou-se o gene blaOXA-23-like em 105 isolados (92,1%), estando 100% associados a ISAba1; blaOXA-72 em um isolado (0,9%) e blaOXA-231 em dois isolados (1,7%). A maior parte (n=66; 57,9%) dos isolados foi classificada como extensivamente resistentes (XDR). O PFGE agrupou os isolados em 11 clusters (A-K) e o MLST identificou os isolados pertencentes majoritariamente aos clones CC79 (42,4%), CC1 (16,6%), CC15 (12,1%) e ao ST317 (18,2%). Os resultados do MLST e 3LST concordaram em 95,6%. Foi verificada a ocorrência de diferentes perfis de PFGE em A. baumannii MDR e XDR, predominando cepas carreadoras de ISAba1/OXA-23-like e pertencentes aos CC1, CC15, CC79, ST317. Predominaram o ST317 nos anos iniciais e o CC79 (ST730) de 2011 a 2014. Estes resultados fornecem subsídios que ressaltam a necessidade de monitoramento e controle de patógenos multirresistentes / Species of Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii Complex (ACB) are important causes of Healthcare Associated Infections worldwide. More relevant are isolates with antimicrobial resistance, which have a negative impact on the outcome, mortality and costs associated with patient care. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity and the antimicrobial susceptibility profile of 134 multiresistant ACB spcies strains present at Botucatu Medical School Teaching Hospital between 2007 and 2014. Identification of A. baumannii species was by detection of blaOXA-51-like and gltA genes, detected in 85% (n=114) of the isolates. Non-baumannii Acinetobacter species were identified by gene sequencing as A. nosocomialis (n=4, 3.1%), A. ursingii, A. variabilis, A. gyllenbergii (n=1, 0.9% each) and Acinetobacter spp (n=2; 1.7%). A. baumannii isolates were submitted to multiplex PCR for other oxacillinases and ISAba1 detection, antimicrobial susceptibility testing, molecular typing by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), trilocus sequence typing (3LST) and multilocus sequence typing (MLST). blaOXA-23-like gene was detected in 105 isolates (92.1%), of which 100% were associated with ISAba1; blaOXA-72 was present in one isolate (0.9%) and blaOXA-231, in two isolates (1.7%). The majority (n=66; 57.9%) of isolates were classified as extensively resistant (XDR). The PFGE grouped the isolates into 11 clusters (A-K) and MLST identified the isolates belonging mainly to CC79 (42.4%), CC1 (16.6%), CC15 (12.1%) and ST317 (18.2%). MLST and 3LST results were 95.6% concordant. We verified the occurrence of different PFGE profiles in multidrug-resistant (MDR) and extensively drug-resistant (XDR) A. baumannii, predominantly presenting ISAba1/OXA-23-like genes and belonging to CC1, CC15, CC79 and ST317. There was a prevalence of ST317 in the early years and CC79 (ST730) from 2011 to 2014. Our results highlight the importance of surveillance and control of multiresistant pathogens

A microbiota do trato gastrointestinal dos psitacídeos é composta por bactérias Gram-positivas, entre elas as bactérias ácido láticas. Porém, há poucos estudos na literatura descrevendo a microbiota do trato gastrointestinal dessas aves. O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar fenotipicamente e genotipicamente, por três diferentes métodos, as bactérias ácido láticas isoladas da microbiota fecal de papagaios verdadeiros. Um total de 80 amostras bacterianas foram estudadas, sendo que 31 amostras eram provenientes da microbiota fecal de papagaios-verdadeiros de vida livre e 49 amostras eram de papagaios-verdadeiros de cativeiro. Foram realizadas provas bioquímicas convencionais, automatizadas (Vitek 2) e o sequenciamento completo do gene 16S rRNA e realizada a análise comparativa dos resultados. Das 80 amostras analisadas, em 40 (50%) destas foram identificadas as espécies, pois apresentaram concordância de identificação em pelo menos dois métodos, e as demais 40 amostras (50%) não apresentaram concordância entre os testes, não sendo possível definir a espécie. As espécies identificadas foram: Enterococcus avium (02 amostras), Enterococcus faecium (03 amostras), Enterococcus faecalis (15 amostras), Enterococcus hirae (15 amostras), Lactococcus lactis (02 amostras) e Staphylococcus warneri (02 amostras). Dentre as amostras identificadas, sete (07) amostras apresentaram concordância no resultado nas três técnicas analisadas, trinta e uma (31) amostras apresentaram concordância pelo bioquímico automatizado e pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, e apenas duas (02) amostras apresentaram concordância pelo bioquímico convencional e pelo sequenciamento de DNA. A similaridade de utilização de substratos pelas cepas foi definida em treze (13) amostras, nas demais amostras estudadas houve uma diferença no consumo de substratos nas provas bioquímicas. O perfil de resistência a antimicrobianos evidenciou resistência em onze (11) amostras, quatro (04) a benzilpenicilina, quatro (04) a eritromicina, duas (02) a gentamicina e uma (01) a estreptomicina. A análise filogenética baseada no coeficiente de Neighbor-Join para comparar a similaridade entre as sequencias geradas pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, mostrou uma tendência de agrupamento bacteriano de acordo com o local de onde as aves eram provenientes. Verificou-se que a identificação através do teste bioquímico convencional apresentou resultados inconsistentes quando comparados com o teste bioquímico automatizado e com o sequenciamento de DNA. Por sua vez, a técnica do sequenciamento genético demonstrou uma elevada confiabilidade nos resultados obtidos; sugerindo-se a utilização deste como teste de eleição e também como teste complementar as provas bioquímicas, para assim diminuir a probabilidade de erro de identificação bacteriana de bactérias ácido láticas em papagaios. / Gastrointestinal microbiota of pscittacines main consists largely of Gram-positive bacteria, including acid-latic bacteria. However, the literature presents very few reports on profiling the gastrointestinal microbiota of these birds. The aim of this study was to identify and to characterize phenotypicly and genotypicly acid-latic bacteria isolated from fecal microbiota of Blue-fronted Amazon Parrots. For such, three different methods were used on eighty bacterial strains. Thirty-one fecal samples were collected from free-living Blue-fronted Amazon Parrots, while fourty-nine were from captive birds. Traditional biochemical tests, automated biochemical test (Vitek 2) and complete gene sequencing of 16S rRNA were performed. Results of these three methods were compared. Forty samples (50%) had agreement between at least two of the three methods, and bacterial species identification was confirmed, while strains from the remaining 40 samples were not identified, once agreement between atleast two methods was not found. The species identified were: Enterococcus avium (02 samples), Enterococcus faecium (03 samples), Enterococcus faecalis (15 samples), Enterococcus hirae (15 samples), Lactococcus lactis (02 samples) and Staphylococcus warneri (02 samples). Agreement between the three methods was observed in seven samples. Thirty-one samples presented agreement between automated biochemical tests and sequencing of the 16S rRNA gene. Only two samples presented agreement between tradional biochemical tests and gene sequencing. Similarities of substract consumed by strains in both traditional and automated biochemical tests were observed in thirteen samples, while the other samples presented some difference in substracts utilization. Antimicrobial resistance profile showed that eleven samples were resistant to some antibiotic. Four were resistant to benzilpenicilin, four to erythromycin, two to gentamicin and one to estreptomycin. The phylogenetic test based on Neighbor-Join coefficient, which compares the similarity between 16S rRNA sequences, showed a trend for grouping of strains according to the geographical origin of each bird. However, species identification using traditional biochemical tests showed to be inconsistent when compared to automated biochemical tests and gene sequencing results. On the other hand, genetic sequencing technique results showed to be highly reliable. Thus, this method should be used both as gold standard and as complementary to the biochemical tests for acid-latic bacteria identification in Blue-fronted Amazon Parrots gastrointestinal microbiota.