A lagarta da espécie Lonomia obliqua é medicamente importante, cujo veneno, presente nas espículas, causa uma síndrome hemorrágica caracterizada por equimoses, alterações da coagulação, dentre outros sintomas. Isto sugere a presença de peptídeos bioativos com potencial farmacêutico, devido à capacidade de modular o comportamento das células endoteliais. O objetivo deste estudo é analisar os potenciais efeitos do veneno de Lonomia obliqua na angiogênese. Uma linhagem celular endotelial (HUVEC) foi exposta a diferentes concentrações do extrato de espículas da Lonomia obliqua (Lonomia obliqua Bristle extract - LOBE) 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL. Empregando citometria de fluxo, observou-se que nenhuma das doses afetou o ciclo celular, viabilidade ou apoptose das células endoteliais após 24h de exposição. Os esferóides das células HUVEC foram plaqueados numa matriz 3D de colágeno e observou-se que LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL) induz um aumento na migração celular, consistente com o processo de angiogênese. A análise da dinâmica da VE-caderina indica que a exposição imediata a LOBE (10 μg/mL) induz um desprendimento da junção célula-célula, o que corrobora com a hemorragia observada nas vítimas de envenenamento. Através de espectrometria de massa, observou-se que LOBE possui vários potenciais peptídeos bioativos. Grupos destes peptídeos foram isolados por fracionamento com metanol a partir do veneno bruto. Os peptídeos presentes, em cada uma das 10 frações, foram caracterizados por espectrometria de massa e foram analisados os efeitos de cada fração sobre a angiogênese. Os resultados sugerem que alguns dos efeitos do envenenamento por Lonomia obliqua são devidos à presença de peptídeos bioativos que modulam o comportamento das células endoteliais. / The caterpillar of the species Lonomia obliqua is medically important, whose venom present in the bristles leads to an hemorrhagic syndrome characterized by ecchymosis, coagulation disorders and others symptoms. This suggests the presence of bioactive peptides with pharmaceutical potencial due to the ability to modulate the behavior of endothelial cells. The aim of this study is to analyze the potential effects of Lonomia obliqua venom on angiogenesis. An endothelial cell line (HUVEC) was exposed to different concentrations (5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) of Lonomia obliqua bristle extract (LOBE). Using flow cytometry, it was observed that none of the doses affected endothelial cell cycle, cell viability or apoptosis after 24h of exposition. Spheroids of HUVEC cells were plated in a 3D-collagen matrix and it was observed that LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) induced an increase on cell migration consistent with the angiogenesis process. Analysis of VE-cadherin dynamics indicates that the immediate exposition to LOBE (10 μg/mL) induced a loosening of cell-cell junction, which corroborates with the hemorrhage observed in the victims. By mass spectroscopy, it was observed that LOBE possesses several potentially bioactive peptides. Groups of these peptides were isolated by a methanol-based fractioning of the crude venom. The peptides present in each of the 10 fractions were characterized by mass spectroscopy and it was analyzed the effects of each fraction on angiogenesis. The results suggest that some of the effects of Lonomia obliqua envenomation are due to the presence of bioactive peptides that modulate the behavior of endothelial cells.

Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / O Feijão Caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp) é uma leguminosa com importante representatividade econômica e nutricional, especialmente no Brasil. Inibidores de serino proteases, como a tripsina, já foram descritos na espécie, assim como em outras plantas. No entanto, nesta espécie, ainda não foram identificados inibidores que apresentem atividade sobre a elastase de neutrófilos humana (HNE), protease envolvida em muitos processos patológicos, como na instalação e progressão da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Nesse estudo, purificamos um inibidor a partir do extrato protéico de Vigna unguiculata que apresenta atividade sobre HNE. Inicialmente, foi realizado o processo de extração alcalina de proteínas, seguido de três passos cromatográficos distintos, utilizando as colunas Hitrap-Q (Troca-iônica), Source15RPC (Fase-Reversa) e ACE18 (Fase-Reversa). Essas etapas foram acompanhadas por testes de atividade inibitória, utilizando os substratos fluorogênicos Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (Elastase) e Z-Phe-Arg-MCA (Tripsina), além de ensaios da quantificação de concentração total de proteínas. Para determinar a massa do inibidor, foram utilizadas as técnicas de espectrometria de massa por MALDI-TOF e SDS-PAGE, o inibidor apresenta massa molecular de 10,99 KDa. O Ki para HNE foi determinado no valor de 9 pM. O inibidor não apresentou atividade inibitória sobre tripsina e trombina, porém foi observada atividade sobre subtilisina e quimotripsina. Estes dados indicam que o inibidor purificado trata-se de uma molécula ainda não caracterizada, devido às suas atividades inibitórias o nomeamos de Vigna unguiculata Elastase Inhibitor (VuEI). / The cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) is a legume of important economic and nutritional representativeness, especially in Brazil. Serine protease inhibitors, such as trypsin, have been described in many species, as well as in other plants. In this specie an inhibitor with activity on human neutrophil elastase (HNE) has not yet been identified. This protease is involved in many pathological processes, such as the onset and progression of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). We purified and characterized an inhibitor from the protein extract of Vigna unguiculata presenting activity towards HNE. Firstly, we performed the alkaline extraction procedure for proteins followed by three different chromatographic steps using Hitrap Q (ion exchange), Source15RPC (Reversed-Phase) and ACE18 (Reversed Phase) columns. These steps were followed by the inhibitory activity tests using fluorogenic substrates, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (elastase) and Z-Phe-Arg-MCA (trypsin), and quantitation assays of protein concentration. To determinate the size of the molecule, we used MALDI-TOF mass spectrometry and SDS-PAGE. The molecular mass of the inhibitor was 10,99 kDa. The dissociation constant (Ki) toward HNE was 9 pM. HNE inhibitor showed no inhibitory activities toward trypsin and thrombin. However, the inhibitor presented activity toward subtilisin and chymotrypsin. These datas indicate that this molecule is a novel inhibitor to HNE and we named it Vigna unguiculata Elastase Inhibitor (VuEI).

A lagarta da espécie Lonomia obliqua é medicamente importante, cujo veneno, presente nas espículas, causa uma síndrome hemorrágica caracterizada por equimoses, alterações da coagulação, dentre outros sintomas. Isto sugere a presença de peptídeos bioativos com potencial farmacêutico, devido à capacidade de modular o comportamento das células endoteliais. O objetivo deste estudo é analisar os potenciais efeitos do veneno de Lonomia obliqua na angiogênese. Uma linhagem celular endotelial (HUVEC) foi exposta a diferentes concentrações do extrato de espículas da Lonomia obliqua (Lonomia obliqua Bristle extract - LOBE) 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL. Empregando citometria de fluxo, observou-se que nenhuma das doses afetou o ciclo celular, viabilidade ou apoptose das células endoteliais após 24h de exposição. Os esferóides das células HUVEC foram plaqueados numa matriz 3D de colágeno e observou-se que LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL) induz um aumento na migração celular, consistente com o processo de angiogênese. A análise da dinâmica da VE-caderina indica que a exposição imediata a LOBE (10 μg/mL) induz um desprendimento da junção célula-célula, o que corrobora com a hemorragia observada nas vítimas de envenenamento. Através de espectrometria de massa, observou-se que LOBE possui vários potenciais peptídeos bioativos. Grupos destes peptídeos foram isolados por fracionamento com metanol a partir do veneno bruto. Os peptídeos presentes, em cada uma das 10 frações, foram caracterizados por espectrometria de massa e foram analisados os efeitos de cada fração sobre a angiogênese. Os resultados sugerem que alguns dos efeitos do envenenamento por Lonomia obliqua são devidos à presença de peptídeos bioativos que modulam o comportamento das células endoteliais. / The caterpillar of the species Lonomia obliqua is medically important, whose venom present in the bristles leads to an hemorrhagic syndrome characterized by ecchymosis, coagulation disorders and others symptoms. This suggests the presence of bioactive peptides with pharmaceutical potencial due to the ability to modulate the behavior of endothelial cells. The aim of this study is to analyze the potential effects of Lonomia obliqua venom on angiogenesis. An endothelial cell line (HUVEC) was exposed to different concentrations (5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) of Lonomia obliqua bristle extract (LOBE). Using flow cytometry, it was observed that none of the doses affected endothelial cell cycle, cell viability or apoptosis after 24h of exposition. Spheroids of HUVEC cells were plated in a 3D-collagen matrix and it was observed that LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) induced an increase on cell migration consistent with the angiogenesis process. Analysis of VE-cadherin dynamics indicates that the immediate exposition to LOBE (10 μg/mL) induced a loosening of cell-cell junction, which corroborates with the hemorrhage observed in the victims. By mass spectroscopy, it was observed that LOBE possesses several potentially bioactive peptides. Groups of these peptides were isolated by a methanol-based fractioning of the crude venom. The peptides present in each of the 10 fractions were characterized by mass spectroscopy and it was analyzed the effects of each fraction on angiogenesis. The results suggest that some of the effects of Lonomia obliqua envenomation are due to the presence of bioactive peptides that modulate the behavior of endothelial cells.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, São Bernardo do Campo, 2017. / Serpina é o nome dado à superfamília de proteínas com uma vasta diversidade de funções biológicas, que tem como principal característica a inibição irreversível de serino proteases. A característica estrutural mais marcante das serpinas é a presença de uma alça na sua porção C-terminal, composta por 20 aminoácidos denominados alça do centro reativo (RCL). A RCL é a região da serpina que se liga covalentemente ao sítio ativo da serino protease, promovendo a inibição irreversível da enzima pela desarticulação de estruturas funcionais essenciais para a catálise enzimática. As calicreínas teciduais humanas (KLKs) são um grupo de 15 serino proteases (KLK1-KLK15) expressas em uma gama de tecidos. A rKLK5, estudada neste trabalho, é expressa abundantemente na pele humana, e parece que exerce importante papel no processo de descamação epidermal, podendo estar relacionada à patologias, como a psoríase e dermatite atópica. Assim, nesse trabalho foi realizada subclonagem, expressão e caracterização bioquímica da atividade inibitória dos mutantes (VSR344G e VSA345G) da serpina oriunda da cianobactéria Gloeobacter violaceus, identificada pelo nosso grupo e nomeada vioserpina. Os genes codificadores da vioserpina foram previamente clonados no vetor de expressão pET-28a e por meio da técnica de mutação sítio-dirigida foram produzidos dois mutantes substituindo os resíduos de aminoácidos arginina e alanina nas posições P1 e P2 da alça do centro reativo (RCL) da vioserpina, respectivamente, por um resíduo de aminoácido glicina (VSR344G e VSA345G). O sucesso das mutações foi avaliado através de sequenciamento de DNA. As vioserpinas mutantes foram expressas na cepa bacteriana E. coli BL21(D3), purificadas pela técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel (Ni-NTA) e obtidas na forma solúvel. Foi possível visualizar a formação do complexo covalente entre a vioserpina e a KLK5 por análise em SDS-PAGE 10% confirmados pela espectrometria de massas. Também foi analisada a ação inibitória dos mutantes (VSR344G e VSA345G) frente a KLK5. Os valores de SI (estequiometria de inibição) apresentaram valores altos o que indica que é preciso uma concentração grande de inibidor, no caso os mutantes da vioserpina, para que a enzima tenha sua atividade inibida, apresentando-se desta forma uma inibição ineficiente frente a rKLK5. Nesse estudo foi possível obter um inibidor específico (vioserpina) para a rKLK5, podendo assim contribuir para o desenvolvimento de novos procedimentos terapêuticos para patologias envolvidas com o processo de descamação epidermal. / Serpin is the name given to the superfamily of proteins with wide range of biological functions, and that has as main feature the irreversible inhibition of serine proteases. The most striking structural feature of serpins is the presence of a loop in the C-terminal portion of the protein, composed by 20 aminoacids called Reative Center Loop (RCL). The RCL is the region of the serpin that binds covalently to the serine protease active site, which causes the irreversible inhibition of the enzyme by the disarticulation of functional structures essencial for the enzymatic catalysis. Human tissue kalikreins (KLKs) are a group of 15 serine proteases (KLK1-KLK15) expressed in a plethora of tissues. The rKLK5, studied in this work, is abundantly expressed in human skin, and seems to play an important role in the epidermal desquamation process, and may be related to pathologies such as psoriasis and atopic dermatitis. Therefore, in this work the subcloning, expression and biochemical characterization of the inhibitory activity of serpin mutants (VSR344G e VSA345G) of the cyanobacteria Gloeobacter violaceus, recently described by our group and named vioserpin, was proposed. The genes coding for vioserpin were previously cloned into the pET-28a expression vector and through the site-directed mutation technique two mutants were produced by substituting the arginine and alanine amino acid residues at the P1 and P2 positions of the serine reactive center loop (RCL), respectively, by a glycine amino acid residue (VSR344G e VSA345G). The success of the mutations was assessed by DNA sequencing. The mutant vioserpin was expressed in the bacterial strain E. coli BL21 (D3), purified by the nickel resin affinity chromatography technique (Ni-NTA) and obtained in the soluble form. Covalent complex formation between vioserpin and rKLK5 could be visualized by 10% SDS-PAGE analysis confirmed by mass spectrometry. We also analyzed the inhibitory action of mutants (VSR344G and VSA345G) against rKLK5. The SI values (inhibition stoichiometry) presented high values indicating that a large inhibitor concentration is required in the case of the vioserpin mutants, so that the enzyme has its inhibited activity, thus presenting an inefficient inhibition in front To rKLK5. In this study it was possible to obtain a specific inhibitor (vioserpin) for rKLK5, thus contributing to the development of new therapeutic procedures for pathologies involved with the epidermal desquamation process.